（食品科学专业论文）菜芙蓉花总黄酮的提取与抗氧化活性研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 菜芙蓉( h i b i s c u sm a n i h o tl ) 为锦葵科( m a l v a c e a e ) 秋葵属 一年生草本植物。菜芙蓉花中含有多种生物活性物质，其中生物黄酮 的含量很高。黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性，它在抗心脑缺血、 缺氧，增进人体代谢中的抗氧化功能以及缓解抑郁紧张症状和增强肾 功能等方面有显著效果。 论文分析了菜芙蓉的组成成分，并对菜芙蓉花总黄酮的提取分离 工艺及其抗氧化活性进行了研究。主要结论如下： 1 新鲜菜芙蓉花的水分含量和租灰分含量分别为9 2 2 7 和4 0 8 ，蛋白质含量为7 3 2 ，脂肪含量为2 8 8 ；菜芙蓉花中c a 和z n 的含量较高，分别为5 6 2 5 0 g g 和4 1 3 0 p g g ，c u 的含量较低。菜芙蓉 根、茎、叶、花和籽中，花中总黄酮含量最高。 2 对菜芙蓉花总黄酮提取工艺条件进行优化，结果表明：在温度 为8 0 。c 、8 0 乙醇作提取溶剂、料液比为1 ：1 0 0 ( g m l ) 、提取2 次、 每次提取2 h 、提取时p h 值为1 0 ，菜芙蓉花总黄酮提取率最高，达到 干重的7 4 8 。提取时的影响因素由主到次顺序为：提取溶剂、提取 时间、提取温度、料液比、p h 值和提取次数。 3 考察了a b 一8 、d m l 3 0 、d m 3 0 1 和x - 5 四种不同极性的大孔吸 附树脂对菜芙蓉花总黄酮的静态吸附和动态吸附效果，得到a b 一8 大孔 树脂对菜芙蓉花总黄酮的纯化效果最好。在静态吸附中，a b 一8 大孔吸 附树脂对菜芙蓉花总黄酮的吸附率最高，为4 8 9 7 ；而d m 3 0 1 型大孔 吸附树脂的解吸率最高，达到8 7 3 6 。a b 一8 大孔吸附树脂纯化菜芙 蓉花总黄酮的最优参数为：洗脱样液浓度6 0m g m l 、p h 值4 0 ，用 6 0 乙醇作洗脱剂，洗脱流速4 0m l m i n 。 江苏大学硕士学位论文 4 对菜芙蓉花总黄酮的粗提液和纯化液进行了抗氧化试验，菜芙 蓉花总黄酮的纯化液比粗提液对d p p h 的清除能力要强。4 o m g m l 菜 芙蓉花总黄酮粗提液对d p p h 的清除率为7 2 4 7 ，而经a b 一8 大孔树 脂纯化后的总黄酮提取液对d p p h 的清除率为8 4 8 0 。在油脂抗氧 化试验中，复配抗氧化剂的抗氧化性优于单一提取物的抗氧化性，其 中0 2 0 提取物和0 0 5 v 。复配抗氧化剂的抗氧化效果最好。 关键词：菜芙蓉，黄酮，火焰原子吸收光谱法，分离提取，大孔树脂， 纯化，抗氧化 江苏大学硕士学位论文 h i b i s c u sm a n i h o tl i sa l la n n u a lh e r b a g ep l a n to fm a l v a c e o u 8 a b e l m o s k h i b i s c u sm a n i h o tf l o w e rc o n t a i np l e n t yo fb i o a c t i v ec o m p o n e n t s ， e s p e c i a l l yf l a v o n o i d s f l a v o n o i d sh a v es t r o n ga n t i o x i d a n ta c t i v i t y t h e y h a v ep r o m i n e n tf u n c t i o n si na g a i n s ta n o x i ao fh e a r ta n db r a i n ，e n h a n c e d a n t i o x i d a n tf u n c t i o ni nm e t a b o l i s m , p o s t p o n e dd u m p sc a t a t o n i aa n d e n h a n c e dk i d n e yf u n c t i o n , a n ds oo n ，1 1 l ec o m p o n e n t so fh i b i s c u sh a v eb e e na n a l y z e da n dt h ee x t r a c t i v e t e c h n o l o g ya n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h eh i b i s c u sm a n i h o tf l o w e rt o t a l f l a v o n e sh a v eb e e ns t u d i e di nt h ea r t i c l e m a i nr e s u l t sa f ea sf o l l o w s ： 1 i nf x e s hh i b i s c u sm a n i l a o tf l o w e r , t h ec o n t e n to fw a t e r , a s h e s , p r o t e i na n df a ti s9 2 2 7p e r c e n t ，4 0 8p e r c e n t ，7 3 2p e r c e n ta n d2 8 8p e r c e n t r e s p e c t i v e l y t h ec o n t e n t o fc aa n dz na r er i c hi nt h ef l o w e l ：, e a c ho ft h e m i s5 6 2 5 0 吵g ga n d4 1 3 0 p g g a n dt h ec o n t e n to fc ui sp o o r i nt h ef i v ep a r t s o fr o o t , s t e m ，l e a f , f l o w e ra n ds e e d ，t h et o t a lf l a v o n e sc o n t e n to ft h ef l o w e r i st h el a i g l a e s t 2 t h ee x t r a c t i n gt e c h n o l o g yo ft o t a lf l a v o n e so fh i b i s c u sm a n i h o t f l o w e rh a v eb e e no p t i m i z e d a n dt h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec o n t e n to f t o t a lf l a v o n e so fh i b i s c u sm a n i h o tf l o w e ri st h eh i g h e s t , a r r i v i n ga t7 4 8 p e r c e n to ft h ed r yf l o w e rp o w d e r , w h i c hi nt h ec o n d i t i o n sa r et h e s e ：i n8 0 d e g r e e sc e n t i g r a d e ，8 0p e r c e n te t h a n o la se x t r a c t i n gs o l v e n t ，t h er a t i oo f s o l i dt ol i q u i di s1 ：1 0 0 ( g m l ) ，e x t r a c t i n g2t i m e s ，2 he a c ht i m e ，a n d e x t r a c t i n gp hv a l u ei s1 0 a n dt h ep r i o r i t yr a t i n go ft h ee x t r a c t i n gf a c t o r s a l et h e s e ：e x t r a c t i n gs o l v e n t ，t i m e ，t e m p e r a t u r e ，r a t i o no fs o l i dt ol i q u i d ，p h v a l u ea n de x t r a c t i n gt i m e s 3 f o u rt y p e so fd i f f e r e n tp o l a rm a c r or e s i n ss u c ha sd m l 3 0 ，d m 3 0 1 ， x 一5a n da b 一8a r es t u d i e dt op u r i f yh i b i s c u sm a n i h o tf l o w e rt o t a lf l a v o n e s m 江苏大学硕士学位论文 w i t hs t a t i ca n dd y n a m i ca d s o r p t i o n t h ep u r i f i c a t i o ne f f i c i e n c yo fa b 一8 m a c r or e s i ni st h eb e s to ft h ef o u rm a c r or e s i n s i nt h es t a t i ca d s o r p t i o no f h i b i s c u sm a n i h o tf l o w e rt o t a lf l a v o n e s ，t h ea d s o r p t i o nm t i o no fa b - 8m a c r o r e s i ni st h eh i g h e s t ，w h i c hr e a c h e st o4 8 9 7p e r c e n t ，a n dt h ed e s o r p t i o n r a t i o no fd m 3 0 1m a c r or e s i ni st h eh i g h e s t w h i c ha r r i v e sa t8 7 3 6p e r c e n t t h eb e s tt e c h n o l o g yo fa b 一8m a c r or e s i nt op u r i f yt h eh i b i s c u sm a n i h o t f l o w e rt o t a lf l a v o n e sa r et h e s e ：t h ec o n c e n t r a t i o no fs a m p l el i q u i di s6 0 m g m l , a n dt h es a m p l el i q u i dp hv a l u ei s4 0 ，6 0p e r c e n te t h a n o la s w a s h i n gs o l v e n t ，a n dt h ew a s h i n gv e l o c i t yo ff l o wi s4 0m l m i n 4 t h ea n t i o x i d a t i o na c t i v i t yi ss t u d i e dw i t ht h ec r u d ee x t r a c t e dt o t a l f l a v o n e s l i q u i da n dt h ep u r i f i e d t o t a lf l a v o n e sl i q u i d t h ee l i m i n a t i n g d p p h c a p a b i l i t yo ft h ep u r i f i e dt o t a l f l a v o n e sl i q u i di sb e a e rt h a nt h e c r u d ee x t r a c t e dt o t a lf l a v o n e s l i q u i d t oe l i m i n a t ed p p h 。i nt h es a m e c o n c e n t r a t i o no f4 o m g m l , t h ee l i m i n a t i o nr a t i o no fc r u d ee x t r a c t e dt o t a l f l a v o n e sl i q u i di s7 2 4 7p e r c e n t ，b u tt h ep u r i f i e dt o t a lf i a v o n e sl i q u i di s 8 4 8 0p e r c e n tw h e ni tf o w e dt h r o u g ha b - 8m a c r or e s i n i nt h ef a t a n t i o x i d a t i o ne x p e r i m e n t ，t h ea n t i o x i d a n te f f e c to fc o m p o u n da n t i o x i d a n ti s b e t t e rt h a nt h es i n g l ea n t i o x i d a n t f o re x a m p l e ，t h ea n t i o x i d a n te f f e c to ft h e c o m p o u n da n t i o x i d a n to f0 2 0p e r c e n tt h ee x t r a c t e dt o t a lf l a v o n e sa n d0 0 5 p e r c e n tv c i st h eb e s t k e yw o r d s ：h i b i s c u sm a n i h o t , f l a v o n o i d s ，f l a m ea t o m i ca b s o r p t i o n s p e c t r o m e t r y , e x t r a c t i o n , m a c r or e s i n ，p u r i f i c a t i o n ， a n t i o x i d a n t i v 江苏大学硕士学位论文 e h u v 矿弘治 h p l c i r h b v s o d t r a c d p p h 劂 b h t b h a t b h q p o v g b 缩略词 e x t r a c to fh i b i s c u sm a n i h o tf l o w e r u l t r a v i o l e t h i 曲p c r f o r m a c cl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i n f r a r e d h o u r s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t o t a lr a d i c a l - t r a p p i n ga n t i o x i d a t i v ec a p a c i t y l ，1 - d i p h e n y l - 2 p i c r y l h y d r a z y l 菜芙蓉花提取物 紫外光谱 紫外可见光 高效液相色谱 红外光谱 小时 树脂床体积 超氧化物歧化酶 总清除自由基抗氧化力 二苯基苫味酰基苯肼 硫代巴比妥酸 2 , 6 - - - 叔丁基4 甲基苯酚 丁羟甲苯 特丁基对苯二酚 油脂过氧化值 国标 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校向有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保材 学位论文作者签名：夏主毫 2 0 0 7 年月r 瑁 指导老师签名：苇盔英 2 0 0 7 年易月l 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名；夏麦毛 日期：2 0 0 7 年多月，2 日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 植物是开发新药和保健食品的重要来源。由于来自植物的天然产物安全无毒， 伴随着人类社会的发展，数千年来，人类赖以生存的食物和药物主要从天然植物 中获得，植物为人类的繁衍昌盛作出了巨大的贡献，目前临床上使用的药物中仍 有5 0 以上直接或间接来源于天然产物。p - 2 1 随着科技进步和人民生活水平的逐步提高，人们的自我保健意识不断增强， 对保健食品和天然药物的认识进一步深化，回归自然的愿望日趋高涨，加之化学 合成药物多有毒副作用，新药开发周期长、投资大，世界各国均着力于天然药物 和天然保健食品的研究开发，这必将极大的促进天然药物和天然保健食品的迅速 发展。 1 1 菜芙蓉简介 菜芙蓉( h i b i s c u s m a n i h o t l ) 为锦葵科( m a l v a c e a e ) 秋葵属一年生草本植物州。 中国科技大学生命科学院沈显生副教授指出，菜芙蓉的植物中文学名q 黄蜀葵明， 而北京玺同春科技开发中心王绍彰教授认为，菜芙蓉是野芙蓉三个种群中的一种， 和黄蜀葵同属。据1 9 8 4 年出版的中国植物志记载，黄蜀葵分布在河北、山东、 河南、陕西、湖北、四川i 、贵州、云南、广西、广东和福建等省区。它原产我国 南部，印度也有，欧州也引种栽培。在野外常生于山谷草丛、田边或沟旁灌丛间嗍。 黄蜀葵花药食兼用，本草纲目已记载黄蜀葵的药用价值，能清热、凉血、 解毒，其花无毒，具有清利湿热、消炎镇痛之功效，内服主治五淋、水肿，外用 治疗汤水烫伤。果实、种子具有补脾健胃、生肌功效，治疗消化不良、不思饮食、 跌打损伤等。嘉佑本草记载：黄蜀葵花主治小便淋及催生、治诸恶疮。现代医 学研究表明，该花的总黄酮有镇痛、抗脑缺血和治疗口腔溃疡等作用。1 9 】 据生物学家测定，菜芙蓉的花中含有多种生物活性物质，其中生物黄酮的含 量比目前在黄酮生产中广泛应用的原料大豆、银杏都高，高居现在已知植物的首 位。生物黄酮的功能被医学界所共认，它在抗心脑缺血、缺氧，增进人体代谢中 的抗氧化功能以及缓解抑郁紧张症状和增强肾功能等方面有显著效果。f 3 】 江苏大学硕士学位论丈 1 2 黄酮类化合物 1 2 1 概述 黄酮类化合物广泛存在于自然界中，以2 苯基苯并吡喃酮为母核( 图1 1 ) ， 即以c 6 c 3 c 6 为骨架结构的一大类天然化合物及其衍生物。【1 0 。1 3 】 7 6 5 4 c 6 c 3 c 6 3 7 4 6 2 一苯基色原酮( 黄酮类) 图1 1 黄酮类的基本结构 f i g 1 1 b a s i cs t r u c t u r eo ff l a v o n o i d s 3 4 1 2 2 结构分类 根据三碳链氧化程度，b 环( 苯基) 连接位置( 2 位或3 位) 以及三碳链是否 构成环状等特点，可将重要的天然黄酮类化合物分类如表1 1 所示： 表1 1 黄酮类化合物结构分类i 摊1 5 1 t a b l e1 1s t r u c t u r ec a t e g o r i z a t i o no f f l a v o n o i d s 名称 基本母核名称基本母核 黄酮类 晖雨 黄酮醇类 ( f l a v o n e s ) ( t l a v a n 0 1 ) i l 二氢黄酮类 二氢黄酮醇类 q ( f l a v a n o n e s ) 0( f l a v a n o n o l s ) o 2 江苏大学硕士学位论文 异黄酮类 二氢异黄酮类 甜、 ( i s o f l a v o n e s ) ( i s o f l a v a n o n e s ) 黄烷- 3 - 醇类 燃 查尔酮类 双归 ( f l a v a n - 3 - o l s ) ( c h a j c o n e s ) 0 黄烷_ 3 ，斗二醇类 二氢查尔酮类 们 ( d i h y d r o c h a l c o n o ( f l a v a n - 3 4 - d i o l s ) e s ) 1 2 3 黄酮类化合物的理化性质及显色反应“埘 1 2 3 1 理化特性 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末。游离的 各种苷元母核中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则 无光学活性。苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋光性，且多为左旋。黄 酮类化合物是否有颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团( o h ，o c l 黾 等) 的种类、数目以及取代位置有关。一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多显 灰黄一黄色，查尔酮为黄一橙色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因不 具有交叉共轭体系或共轭链较短，故不显色( 二氢黄酮及二氢黄酮醇) 或显微黄 色( 异黄酮) 。 1 2 3 2 溶解性 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在的状态不同而有很大的差异。一般游离苷 元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液 中。其中黄酮、黄酮醇、查尔酮等平面性强的分子，因分子与分子间的排列紧密， 分子间引力较大，故难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面性分子， 故分子与分子间不紧密，分子间引力降低，有利于水分子进入，溶解度稍大。 3 江苏大学硕士学位论文 黄酮类苷元分子中引入羟基，将增加在水中的溶解度：而羟基经甲基化后， 则增加在有机溶剂中的溶解度。 黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶度即相应的加大，而在有机溶剂中的溶 解度则相应减小。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶于 或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长，则水溶度越大。 另外，糖的结合位置不同，对苷的水溶度也有一定的影响。 1 2 3 3 酸碱性 黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、 甲酰胺及二甲基甲酰胺中。由于酚羟基的位置不同，酸性强弱也不同l ”1 。一般： 7 ，4 二o h 7 或4 o h 一般酚叫 5 0 h r 一吡喃环上的卜氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与强 无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水后即可分解。 1 2 3 4 显色反应 黄酮类化合物的显色反应多与分子中的酚羟基及r - 吡喃酮环有关，在早期的研 究工作中，常以化学显色反应定性地判断黄酮类化合物的存在和它们的区别。黄 酮类化合物的显色反应如表1 2 。 表1 2 各类黄酮类化合物的显色反应 t a b l e1 2c o l o r f u lr e a c t i o n so f d i f f e r e n tf l a v o n e s 表示自i 荧光 4 江苏大学硕士学位论丈 1 2 4 黄酮类化合物的提取与纯化方法概述 1 2 4 1 提取方法“” 黄酮类化合物存在于花，叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部 坚硬组织中，则多以游离的苷元形式存在。黄酮苷类以及极性稍大的苷元( 如羟基 黄酮、双黄酮、橙酮、查尔酮等) ，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些极 性较大的混合溶剂进行提取，其中用得最多的是甲醇水( 1 ：1 ) 或甲醇，一些多糖 苷类则可用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸( 如0 1 盐酸) ， 但提取- 般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应。为了避免在提取过 程中黄酮苷类发生水解，也常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。大多数黄酮 苷元宜用极性较小的溶剂，如用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等提取，而对多甲氧基黄酮 的游离昔元，甚至可用苯进行提取。 ( 1 ) 乙醇或甲醇提取 乙醇或甲醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇( 如9 0 一9 5 ) 适 宜于提取苷元，8 0 左右的醇适宜于提取苷类。提取的次数一般是2 一次，可用加 热抽提法或冷浸法。 ( 2 ) 热水提取 热水仅限于提取苷类，例如自槐花米中提取芦丁，由于热水提取出的杂质较多， 故不常使用。 ( 3 ) 碱性水或碱性稀醇提取 由于黄酮类成分大多具有酚羟基，显酸性，因此可用碱性水( 如碳酸钠、氢氧 化钠、氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 如5 0 乙醇) 浸出。用碱性溶剂提取时，所 用的碱浓度不宜过商，以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核。当有邻二酚羟 基时，应加硼酸保护。 1 2 4 2 黄酮类化合物的纯化方法” 由于黄酮类化合物的结构和性质不同，其分离纯化的原理有：极性大小不 同，利用吸附能力或分配原理进行分离；酸性强弱不同，利用梯度p h 萃取法 进行分离；分子大小不同，利用葡聚糖凝胶分子筛进行分离；分子中某些 特殊结构，利用与金属盐络合能力的不同进行分离。 常用的分离方法有柱色谱法、高效薄层色谱( | 玎mc ) 、高效液相色谱分析 s 江苏大学硕士学位论文 ( 卸p l c ) 等。 ( 1 ) 硅胶柱色谱 非极性和极性化合物都能用，应用最广，适于分离黄酮类、黄酮醇类、二氢 黄酮类、二氢黄酮醇类、异黄酮类和黄酮苷元类。 在利用硅胶柱色谱对黄酮类化合物进行纯化时，选择合适的洗脱剂是关键， 各种洗脱剂的洗脱能力如下： 石油醚 四氯化碳 苯 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 吡啶 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 儿茶素) 。有人认为，这是因为2 ，3 位双键和4 位羰 基形成共轭体系，这有利于电子在a ，b 环问的离域作用，提高了类黄酮自由基的 稳定性，增大了其给电子能力，因而，有该结构的类黄酮清除自由基活性较强。 另外，在类黄酮发挥抗氧化作用时，其对于脂质膜双层( 脂质体膜) 的亲和力是重要 因素。不仅类黄酮b 环o h 基的数量与位置对类黄酮插入脂质膜双层有影响，c 环的立体结构也影响着类黄酮插入脂质膜双层。最近还证明异黄酮a 环5 位o h 基的存在也可增加亲和力【2 4 1 。 i 2 5 2 抗炎作用 黄酮类化合物，如芦丁及其衍生物羟乙基芦丁、二氢槲皮素以及橙皮苷甲基 查尔酮等据报道对角叉菜胶、5 h t 及p e g 诱发的大鼠足爪水肿，甲醛引发的关节 炎及棉球肉芽肿等均有明显的抑制作用。 1 2 5 3 抗菌及抗病毒作用 木犀草素、黄今苷、黄今素等均有一定程度的抗菌作用，还有槲皮素、桑色 素、二氢槲皮素及山奈酚等有一定的抗病毒作用。 1 2 5 4 对心血管系统的作用 芦丁、橙皮苷、d - ) l 茶素、香叶木苷等有类似维生素p 的作用，能降低血管脆 性及异常的通透性，可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。 1 3 国内外研究情况及立题意义 1 3 1 国内外研究进展 当前国内外对莱芙蓉花总黄酮及其成分、药理作用等方面的研究不多。例如， 范仲先【3 】、杨树柱【4 1 、温柬升瞵】等对菜荚蓉的基本特征作了一些报道，仇燕对菜荚 蓉花中总黄酮微波提取以及总黄酮的含量测定进行了初步研究【5 ，2 6 l ，结果表明菜荚 蓉花中总黄酮含量较高。 菜芙蓉是野荚蓉三个种群中的一种，和黄蜀葵同属f 8 1 ，关于黄蜀葵的研究国内 外相关报道较多：王先荣等对黄蜀葵的化学成分进行了初步研究鲫；尹莲芳等研 究了黄蜀葵花对肾病大鼠肾小管损伤的保护作用团】：李庆林等报道了黄蜀葵花总 黄酮对心肌损伤的保护作用及其机制1 2 9 1 ；高杉等研究了黄蜀葵总黄酮对脑缺血损 8 江苏大学硕士学位论文 伤的保护作用跚；c p u e l 等对黄蜀葵p il e , i , 鼠骨质疏松进行了研究1 3 1 1 。 1 3 2 立题意义 生物黄酮的功能早已被医学界所公认，它在治疗心脑缺氧、缺血，增进人体 代谢中抗氧化功能，以及缓解抑郁紧张症状等方面都有显著效果。据文献报道黄 酮类化合物的药理作用有：( 1 ) 抗脑缺血，( 2 ) 抗心肌缺血，( 3 ) 抗心律失常，( 4 ) 抗自由基，( 5 ) 镇痛作用，( 6 ) 保肝作用，( 7 ) 对消化性溃疡的保护作用，( 8 ) 抗病 毒、抗肿瘤等。，i i , 脑血管疾病是当今世界公认的十大疾病杀手之一，而生物黄酮 则被称为心脑疾病的克星。 目前黄酮主要从银杏叶、大豆、沙棘等植物中提取分离，而菜芙蓉花中黄酮 含量较高，且可以广泛种植。可是当前国内外对菜芙蓉花总黄酮的研究还不够深 入，菜芙蓉花总黄酮的提取工艺和抗氧化活性研究方面的报道也不多。论文对菜 芙蓉花总黄酮的提取分离工艺和抗氧化活性进行研究，使菜芙蓉有望成为黄酮新 的来源，对提高菜芙蓉的利用价值具有一定的意义。 1 4 论文主要研究内容 ( 1 ) 分析菜芙蓉的组成分，测定菜芙蓉花和籽中总黄酮、蛋白、脂肪、水分 和部分矿物元素的含量。 ( 2 ) 对菜芙蓉花总黄酮的提取工艺进行研究，利用单因素试验和正交试验优 化菜美蓉花总黄酮的提取工艺参数。 ( 3 ) 对菜芙蓉花总黄酮的分离纯化工艺进行研究，利用单因素试验和正交试 验优化a b - 8 大孔吸附树脂纯化菜芙蓉花总黄酮的工艺参数；四种大孔吸附树脂对 菜芙蓉花总黄酮的静态吸附和动态吸附效果进行比较研究。 ( 4 ) 对菜芙蓉花总黄酮的抗氧化活性进行研究。 9 江苏大学硕士学位论文 第二章菜芙蓉组成分分析 本章主要对菜芙蓉花、籽进行水分和总灰分的测定；利用微量凯氏定氮法测 定菜美蓉花、籽中蛋白质的含量；利用索氏提取法测定菜芙蓉花、籽中粗脂肪的 含量，并利用气相色谱定性测定菜美蓉花与籽中的脂肪酸；利用氢火焰原子吸收 光谱法研究菜美蓉花与籽中c a 、m g 、z n 、c u 元素的含量；利用n a n o z - a i ( n 0 3 ) 3 显色法测定菜芙蓉花、根、茎、叶和籽等不同部位的总黄酮含量。 2 1 试验材料与仪器设备 2 1 1 试验材料与试剂 菜芙蓉江苏省扬中市绿健天然植物有限公司提供 芦丁标准品南京青泽医药科技开发有限公司，1 0 5 。c 干燥至恒重； 食用酒精9 5 n a n 0 5 ( 分析纯) ，a l ( n 0 ，) 。( 分析纯) ，n a 0 h ( 分析纯) 浓h c l ( 分析纯) ，浓刚0 3 ( 分析纯) ，去离子水， 2 1 2 主要仪器设备 c a r y l 0 0 紫外一可见分光系统 美国瓦里安公司 r e 一5 2 a 真空浓缩旋转蒸发器上海哑荣生化仪器厂 l d 5 2 a 医用离心机北京医用离心机厂 b r 4 i 冷冻离心机法国j o u a n 仪器公司 马福炉，坩埚南京真空电炉厂 电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司 h h - 6 数显恒温水浴锅江苏会坛富华仪器有限公司 电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司 p h 计 上海天达仪器有限公司 z f 超卢波发生器上海致丰电子科技有限公司 j j 1 型定时电动匀速搅拌器江南仪器厂 原子吸收分光光谱仪美国p e r k i ne l m e r 公司 1 0 江苏大学项士学位论文 微量凯氏定氮仪索氏提取器 2 2 试验方法 2 2 1 水分的测定 水分的测定法通常可分为直接法和自j 接法两类。利用水分本身的物理性质和 化学性质测定水分的方法，叫作直接法，如重量法、蒸馏法和卡尔费休法；利用 食品的比重、折射率、电导、介电常数等物理性质测定水分的方法，叫作间接法。 测定水分的方法要根据食品性质和测定目的来选定。【3 2 l 2 2 1 1 莱芙蓉花水分的测定 参照g b t1 4 7 6 9 9 3 1 9 9 4 进行试验，平行做三个样作对照。 2 2 1 2 菜芙蓉籽水分的测定 参照2 2 1 1 进行试验。 2 2 2 总灰分的测定 食品在5 0 0 6 0 0 c 灼烧灰化时，发生了一系列的变化：水分及挥发物质以气态 放出；有机物质中的碳、氢、氮等元素与有机物质本身的氧化及空气中的氧生成 二氧化碳、氮的氧化物及水分而散失；有机酸的金属盐转变为碳酸盐或金属氧化 物；有些组分转变为氧化物、磷酸盐、硫酸盐或卤化物；有的金属，或直接挥发 散失，或生成容易挥发的金属化合物。” 2 2 2 1 莱芙蓉花总灰分的测定 参照g b t1 4 7 7 0 9 3 1 9 9 4 进行试验。 2 2 2 2 莱芙蓉籽总灰分的测定 参照2 2 2 1 的方法进行试验。 2 2 3 蛋白质的测定 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，蛋白质是含 氮的有机化合物，是有机态氮的表现形式。将样品、硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼 酸吸收后再利用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质 1 1 江苏大学硕士学位论文 含量【3 3 1 。 2 2 3 1微量凯氏定氮法测定菜荚蓉花中蛋白质的含量 参照g b t5 0 0 9 5 一1 9 8 5 进行试验。 2 2 3 2 微量凯氏定氮法测定菜芙蓉籽中蛋白质的含量 参照2 2 3 1 的方法进行试验。 2 2 4 粗脂肪的测定 用低沸点的有机溶剂回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之 差计算粗脂肪含量。 2 _ 2 4 1索氏提取法测菜芙蓉花中粗脂肪的含量 参照g b t5 0 0 9 6 1 9 8 5 进行试验。 2 2 4 2 索氏提取法测菜芙蓉籽中粗脂肪的含量 参照2 2 4 1 的方法测定菜芙蓉籽中粗脂肪的含量。 2 _ 2 4 3 气相色谱对菜芙蓉花和籽脂肪酸的测定 利用气相色谱对菜芙蓉花和籽脂肪酸进行定性测定，试验方法参照参考文献 【3 4 - 3 6 1 。 2 2 5 部分矿物质元素的测定 2 2 5 1 样品的预处理 参照文献【3 7 - 4 4 】进行试验，将干燥的菜荚蓉花、籽粉碎，过6 0 目筛，放入干 燥器中备用。分别准确称取1 0 0 0 0 9 的菜美蓉花粉末和菜美蓉籽粉末样品于2 5 0 m l 的消化管中，分别加入4 0 m l 王水( 浓h n 0 3 ：h a = 1 ：3 ) ，放置过夜。将样品置 于电热炉上微火加热，近干，再各加入1 0 m l 王水消化近干，用去离子水冲洗消化 管内壁，再稍加热，赶尽余酸，稍冷却，用少量去离子水在超声辅助下溶解消化 后的物质，在4 0 0 0r m i n 离心过滤1 5 r a i n , 用去离子水定容至1 0 0 m l 容量瓶刻度 线处，待测。 2 2 5 2 标准溶液的配制 配制含王水体积比为4 的去离子水溶液，作为空白溶液备用。 ( 1 ) z n 离子标准曲线的绘制 1 2 江苏大学硕士学位论文 取lm g m lz n 离子的标准溶液，分别用去离子水稀释到0 0 、1 0 0 、2 0 0 、 3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 m g l 于5 0 m l 容量瓶中，以空白溶液作对照，用原子吸收光谱仪 在2 1 3 9 n m 处测定z n 的原子吸收值； ( 2 ) c a 、m g 和c u 离子标准曲线的绘制 参照z n 离子标准曲线的绘制进行试验。 2 2 5 3 样品中z n 、c u 、c a 和m g 元素含量的测定 以空白溶液作对照，用原子吸收光谱仪按照2 2 5 2 的方法分别测定已经配 制好的菜芙蓉花和籽样品液中的z n 、c u 、c a 和m g 四种元素的吸收值，对照相应 的标准曲线可以得到样品中z n 、c u 、c a 和m g 四种矿物元素的含量。 2 2 0 菜芙蓉不同部位总黄酮含量的测定 分别称取2 o g 菜芙蓉花、根、茎、叶和籽的干粉于洁净的锥形瓶中，以8 0 乙醇作浸提溶剂，料液比为1 ：1 0 0 ( g ：m l ) ，在8 0 水浴条件下浸提2 次，每次浸 提2 h ，提取液经过滤、浓缩、定容，得到菜芙蓉不同部位的总黄酮提取液”“。 利用n a n 0 2 - a i ( n 0 3 ) a 显色法测定菜芙蓉花、根、茎、叶和籽不同部位总黄酮 的含量。 2 3 试验结果与分析 2 3 1 水分含量 新鲜菜芙蓉花中水分含量较高，达到9 2 2 7 ，而菜芙蓉籽中水分含量较低， 仅为1 0 7 3 。 2 3 2 灰分含量 菜芙蓉花中灰分含量为4 0 7 ，菜芙蓉籽中灰分含量为5 4 6 ，由试验结果 可知菜芙蓉籽中灰分的含量高于花中厌分的含量。 2 3 3 蛋白质含量 菜芙蓉花中蛋白质的含量为7 3 2 ，菜美蓉籽中蛋白质的含量为1 4 8 8 ，由 试验结果可知菜美蓉籽中蛋白含量远高于花中蛋白质的含量。 江苏大学硕士学位论文 2 3 4 粗脂肪含量 2 3 4 1 菜芙蓉花和籽粗脂肪含量 菜芙蓉花中脂肪含量为2 8 8 ，菜芙蓉籽中脂肪的含量为1 8 1 0 ，由试验 结果可知菜荚蓉籽中脂肪的含量较高。 2 3 4 2 菜芙蓉花和籽脂肪酸的气相色谱图 利用h p 5 8 9 0 气相色谱仪，1 9 0 9 1 n - 1 3 3 毛细管柱，f i d 检测器，柱温为2 1 0 ，进样温度为2 5 0 ，分流比为4 0 ：1 ，得到的气相色谱图如图2 卜2 。 图2 1 菜美蓉花脂肪酸气相色谱图 f i g 2 1 g a sc h r o m a t o g r a mg r a p ho fh i b i s c u sm a n i h o tf l o w e rf a t t ya c i d 图2 2 菜美蓉籽脂肪酸的气相色谱图 f i g 2 2 g a sc h r o m a t o g r a mg r a p ho fh i b i s a r i sm a n i h o ts e e df a t t ya c i d 1 4 江苏走学硕士学位论文 对照参考文献和图2 2 的气相色谱图，在3 8 4 6 r a i n 处有峰值的是棕榈酸，在 4 0 9 0 m i n 处有峰值的是棕桐油酸，在6 2 2 3 r a i n 处有峰值的是亚油酸，6 7 0 7 r a i n 处 有峰值的是弧麻酸。由试验结果可知菜英蓉花和籽中富含多种不饱和脂肪酸，又 由2 3 a 1 可知菜芙蓉籽中脂肪含量较高，而不饱和脂肪酸对人体十分有利，因此 可以对菜芙蓉籽中的不饱和脂肪酸进行开发利用。 2 3 5 部分矿物元素的含量 c a 、m g 、c u 、z n 四种元素的标准曲线回归方程发相关系数如表2 1 。 表2 1 标准曲线的回归方程及相关系数 l 、a b l e 2 1 i n e a r i t ye q u a t i o n a n dr b l a t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e c r i t e r i o n c l i p e 元素 回归方程相关系数， 根据c a 、m g 、c u 和z n 四种矿物元素标准曲线的叫归方程利用原子吸收光 谱仪测得菜芙蓉花和籽中四种矿物元素的含量如图2 3 所示， 孪 3 枷 啦 粕 l 黑 霹 b c a 劲 m g c u 图2 3 菜芙蓉花与籽干粉中c a 、m g 、c t l 和z n 四种元素含晕 f i g 2 3 c o n v e n to f f o u re l e m c n l so f c a 、m s 、c u 、办 i n h i b i s c u s m a n i h o t l k f l o w e m a n d s e e d sp o w d 日 由试验结果可知，菜美蓉花和籽中c a 和z n 的含量较高，其中菜英蓉花干粉 中c a 元素的含量达到5 6 2 5 0 峙偿，z n 的含量为4 1 3 0 g g ，较苋菜、黄瓜中c a 和 o 0 o 0 o o o 一 哪 哪 o b 5 4 a 2 1 江苏大学硕士学位论文 z n 元素的含量要高。 2 3 6菜芙蓉不同部位总黄酮的含量 利用显色法测定菜芙蓉不同部位花、根、茎、叶和籽中总黄酮的含量，如图 2 a 所示。 8 o o 7 o o 2 0 0 1 o o 0 0 0 6 6 4 花根茎叶籽 图2 4 菜芙蓉不同总部位总黄酮含鼍 f g 2 4 t o t a lf l a v o n c sc o n t c mo fh i b i s c u sm a n i h o t sd i f f e r e n tp a r t s 由图2 4 可知在菜芙蓉不同部位中，菜芙蓉花中的总黄酮含霞最高，达到千重 的7 4 8 ，因此试验选择用菜芙蓉花作为原料提取总黄酮。然而由试验结果町知 菜美蓉叶中总黄酮含量也较高，且原材料丰富，也可以将其作为提取总黄酮的原 料。 2 4 本章小结 ( 1 ) 菜荚蓉花和籽中水分含量分别为9 2 2 7 和l o 7 3 ，菜芙蓉花和籽中总 灰分含量分别为4 。0 7 和5 4 6 ，菜芙蓉花和籽中蛋白质含量分别为7 3 2 和 1 4 8 8 ，菜芙蓉花和籽中粗脂肪含量分别为2 8 8 和1 8 1 0 ，气相色谱图显示菜 芙蓉花和籽中富含多种不饱和脂肪酸。 ( 2 ) 利用原子吸收光谱