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非水相蛋白酶合成蔗糖基聚合物 摘要 蔗糖基聚合物是以蔗糖为原料合成的高分子聚合物，由于聚合物结构 单元中含有比较完整的蔗糖分子结构，所以具有亲水性、生物相容性、生 物降解性等特点，在吸水材料、药物缓释材料等方面有应用前景。 制备蔗糖基聚合物的方法主要有酶法、化学法和预辐照法。而在非水 相使用酶化学法合成蔗糖基聚合物既具有单纯使用酶法高区域选择性的优 点又兼具了化学法引发聚合时简便高效的特点，是一种理想的合成蔗糖基 聚合物的方法。 本实验使用蛋白酶n 分别在毗啶、d m f 中合成了蔗糖基聚合物的单体 蔗糖甲基丙烯酸酯。在吡啶中，使用不同p h 值的碳酸盐氢氧化钠溶液处 理蛋白酶n 制备得到p h 记忆酶。使用甲基丙烯酸三氟乙酯做酰化试剂， 使用蔗糖作为冷冻干燥保护剂，考察了反应摩尔比、反应时间、温度、体 系含水量和酶的p h 等因素对蔗糖酯含量的影响。通过设计正交实验，合成 蔗糖酯的最佳条件为：酶p h 值8 ，体系含水量1 5 ，温度3 5 c ，反应时 间5 d 。在该条件下，产物蔗糖酯的含量达到了9 8 5 。 在d m f 中，使用不同p h 值的磷酸盐缓冲液处理蛋白酶n 制得p h 记 忆酶，考察了反应摩尔比、反应时间、温度、体系含水量和酶的p h 等因素 对蔗糖酯含量的影响。通过设计正交实验，得出产蔗糖酯的最佳条件为： 酶p h 值1 2 ，体系含水量7 ，温度3 5 c ，反应时间3 d 。在该条件下，产 物蔗糖酯的含量达到了2 2 1 5 。 使用红外光谱、质谱、核磁共振碳谱鉴定蔗糖甲基丙烯酸酯的结构， 确定了蔗糖与甲基丙烯酸三氟乙酯发生酯交换反应生成了甲基丙烯酸蔗糖 单酯，酯交换的部位发生在蔗糖的1 位。 使用过硫酸钾过氧化氢的混合体系和硝酸铈铵作为引发剂引发蔗糖甲 基丙烯酸酯聚合成蔗糖基聚合物，考察了引发剂含量、反应时间等因素对 于蔗糖基聚合物分子量的影响。在常温条件下制备出了分子量从5 千到6 0 万的蔗糖基聚合物。 考察了蔗糖基聚合物对非诺洛芬钙的药物缓释作用，在人工肠液中缓 释时间可以达到1 2 h 。人工肠液中的缓释效果优于人工胃液。 关键词：蔗糖基聚合物酶化学法蔗糖甲基丙烯酸酯蛋白酶n 药物缓释 p r o t e i n a s es y n t h e s i ss u c r o s e c o n t a i n l n g p o l y m eri nn o n a q u e o u sm e d i a a bs t r a c t s u c r o s e - c o n t a i n i n gp o l y m e rm e a n st h a tl e a d i n gs u c r o s et ot h ep o l y m e r m o l e c u l a rc h a i ng r o u pt of o r mm a c r o m o l e c u l a rp o l y m e r s d u et ot h ei n t e g r a t e d s u c r o s em o l e c u l e c o n f i g u r a t i o n ，s u c r o s e c o n t a i n i n gp o l y m e r h a st h e h y d r o p h i l i c i t y , b i o l o g i c a la c t i v i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y i th a st h ea p p l i e df o r e g r o u n d i nt h eh y d r o p h i l em a t e r i a l ，d r u gc o n t r o l l e dr e l e a s em a t e r i a lf i e l d t h e r ea r et h r e em e t h o d st o p r e p a r e t h e s u c r o s e c o n t a i n i n gp o l y m e r ： e n z y m em e t h o d ，c h e m i c a lm e t h o d ，p r e i r r a d i a t i o nm e t h o d t h ec h e m o e n z y m a t i c m e t h o dc o m b i n e st h eh i g h r e g i o s e l e c t i v i t yo fe n z y m em e t h o da n dh i g h p o l y m e r i z a t i o ne f f i c i e n c yo fc h e m i c a lm e t h o d ，i ti st h ei d e a lm e t h o dt op r e p a r e s u c r o s e - c o n t a i n i n gp o l y m e r i nt h i sp a p e r p r o t e i n a s en c a t a l y z e ss y n t h e s i so fs u c r o s em e t h a c r y l a t e ，t h e m o n o m e ro fs u c r o s e c o n t a i n i n gp o l y m e r , i nt h ep y r i d i n ea n dd m f i np y r i d i n e ， u s et h ed i f f e r e n tp hc a r b o n a t e s o d i u mh y d r o x i d et op r e p a r et h ep hm e m o r y p r o t e i n a s en t r if l u o r o e t h y lm e t h a c r y l a t e i su s e da sa c y ld o n o r s u c r o s ea s l y o p r o t e c t a n t s t u d yt h ee f f e c t so fr e a c t i o nd o s a g er a t i o 、r e a c t i o nt i m e 、 i i i t e m p e r a t u r e 、s y s t e mh 2 0c o n t e n t 、p ho fp r o t e i n a s en t ot h ec o n c e n t r a t i o no f s u c r o s e m e t h a c r y l a t e d e s i g n t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r ef o u n du s i n gp h8a n d1 5 h 2 0a n d3 5 * ca n d5 d a y s t h e h i g h e s tc o n c e n t r a t i o no fs u c r o s em e t h a c r y l a t e9 8 5 w a so b t a i n e di nt h i s c o n d i t i o n i nd m f , u s et h ed i f f e r e n tp hp h o s p h a t eb u f f e rt op r e p a r et h ep hm e m o r y p r o t e i n a s en t r if l u o r o e t h y lm e t h a c r y l a t ei su s e da sa c y ld o n o r , s u c r o s ea s l y o p r o t e c t a n t s t u d yt h e e f f e c t so fr e a c t i o nd o s a g er a t i o 、r e a c t i o nt i m e 、 t e m p e r a t u r e 、s y s t e mh 2 0c o n t e n t 、p ho fp r o t e i n a s ent ot h ec o n c e n t r a t i o no f s u c r o s e m e t h a c r y l a t e d e s i g n t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r ef o u n du s i n gp h12a n d7 h 2 0a n d3 5 * c a n d3 d a y s t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o no fs u c r o s em e t h a c r y l a t e2 2 15 w a so b t a i n e di nt h i s c o n d i t i o n i d e n t i f yt h es t r u c t u r eo fs u c r o s em e t h a c r y l a t eb yi r 、m s 、1 3 c n m r ，e n s u r e t h a t ：e s t e re x c h a n g er e a c t i o nh a p p e n e di nt h e1 7 co fs u c r o s e k 2 5 2 0 8 i - - 1 2 0 2a n d c e ( n h 4 ) 2 ( n 0 3 ) 6p o l y m e r i z et h es u c r o s em e t h a c r y l a t em o n o m e rr e s p e c t i v e l yt o g e tt h es u c r o s e c o n t a i n i n gp o l y m e ri nt h en o r m a lt e m p e r a t u r e ，s t u d yt h ee f f e c t o fd o s a g e 、r e a c t i o nt i m et ot h em o l e c u l a rw e i g h to f p o l y m e r sa n dt h et r a n s l a t i o n r a t eo fs c r o s em e t h a c r y l a t em o n o m e r m o l e c u l a rw e i g h to fs u c r o s e - c o n t a i n i n g p o l y m e ri sf r o m5 , 0 0 0t o6 0 0 ，0 0 0 t h ea p p l i c a t i o no fs u c r o s e - c o n t a i n i n gp o l y m e ro nd r u gc o n t r o l l e dr e l e a s e ， t h ed r u gc o u l db es l o w l yr e l e a s e di n12 hs t e a d i l y i th a sb e t t e rr e l e a s ee f f e c ti n i v m a n m a d ei n t e s t i n a lj u i c et h a ni nm a n m a d es u c c u sg a s t r i c k e y w o r d s ：s u c r o s e c o n t a i n i n gp o l y m e r ；c h e m o e n z y m a t i cm e t h o d ； s u c r o s em e t h a c r y l a t em o n o m e r ；p r o t e i n a s en ；d r u gc o n t r o l l e dr e l e a s e v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 渺扫 独8 年6 只弓e l 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求 提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供 目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在 不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 叼即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：辨恳 导师签名 训8 年b 月歹日 非水相- j 白酶合成蔗糖基聚合物 1 1 综述 第一章蔗糖基聚合物的研究进展 广义的含糖聚合物可以分为天然多糖和人工合成的含糖聚合物两种类型。天然多 糖从其组成结构上讲，有由一种类型的单糖组成的葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等；和 由二种以上的单糖组成的杂多糖，如含有氨基糖的葡糖胺葡聚糖等，在化学结构上实属 多种多样。结合了蛋白质和脂类的寡糖，分子量属于高分子范围的也称为广义上的复合 多糖。多糖具有通常具有贮藏生物能( 如：淀粉、糖原、菊粉) 和支持结构( 如：纤维 素、几丁质、粘多糖) 等的生物学功能。人工合成的含糖聚合物是通过不同的途径将糖 组分引入到聚合物结构单元中形成的功能高分子材料，由于其单元结构中有较完整的糖 基分子，使得聚合物可能拥有亲水、生物相容、生物降解等特性。在世界范围内环保意 识日益浓厚的背景下，利用可再生资源糖制备出具有环境友好特性的新材料，这一思路 成为世人关注的焦点之一。目前，国外以糖为原料合成功能聚合物的研究很活跃，近几 年也引起了国内各方面的重视。 蔗糖基聚合物是含糖聚合物的一种，顾名思义，就是以蔗糖作为原材料制备而成 的一系列聚合物的统称。蔗糖是所有糖类中含量最丰富的，每年的全球产量过亿吨，主 要用作传统意义上的食品甜味剂。多年来这一思维根深蒂固，限制了蔗糖的深度开发利 用。从化学结构上讲，蔗糖分子中的多个羟基可以与很多试剂进行修饰反应，是一种很 有价值的原料；从资源类型方面讲，蔗糖是可再生资源，每年新生产的蔗糖可以源源不 断的满足各种产业使用的需要；从生物功能方面，蔗糖分子中含有多个羟基，它的高亲 水性提示其具有高度生物相容性，以蔗糖为原料可以开发一系列化学产品，其特征是可 生物降解、安全无毒、对环境友好。国际上早在上世纪五十年代就出现了用蔗糖作为化 工原料的“蔗糖化学”，制备出的各种蔗糖衍生物已经形成了诸如s u c r a l o s e ，i s o m a l t ， s u c r a l f a t e ，a n do l e s t r a i l j 等品牌产品。 蔗糖基聚合物作为一种无毒、可降解、高吸收性的凝胶聚合物，可用于普通的水 吸收剂、水净化助剂和生物医学材料等【2 1 。近些年的研究表明，除了以上这些特点以外， 对于玉米的增产3 1 、荔枝的增甜4 1 、平菇的增产【5 1 以及芒果保鲜【6 1 等方面有着不错的效果， 在药物缓释1 7 】方面也具有良好的应用前景。 广西大学硕士掌位论文 非水相蛋白酶合成蔗糖基聚合物 1 2 蔗糖基聚合物的特点 将蔗糖分子引入高分了的纡i 构单元，可以的方式：一是以天然的多糖类为例，蔗 糖分子彼此之间脱水形成高分f 聚合物；人工合成的蔗糖基聚合物是对蔗糖进行修饰， 使其具有能够进行共聚或缩聚的客观条件，这些物质可能是聚糖，或者聚酯、胺、丙烯 酸酯或其它化合物【8 j 。目前的研究l ! 要以聚蔗糖甲基丙烯酸酯、丙烯酸蔗糖酯为主。 国内外制备蔗糖基聚合物卜要订化学法、预辐照法和酶法三种方法。化学法和预辐 照法具有操作简便易于大规模 l - e 的优点。但由于化学试剂和辐照从机理上讲都有选择 性比较差的特点，很难得到结构单。明确的蔗糖基聚合物。而酶法利用了酶对蔗糖不同 活性羟基的选择酰化得到酰化位置明确的单体，从而有利于制备线性的蔗糖基聚合物。 甲基丙烯酸或丙烯酸型的蔗糖基聚合物一般成浅黄色凝胶，具有一定的粘性和力学 强度。扫描电镜显示蔗糖基聚合物具有疏松多孔的立体网状结构，如图1 1 ，这预示着 蔗糖基聚合物在吸湿性和药物缓释方面具有一定的潜力p j 。 图1 1 蔗糖基聚合物冰冻十燥样的表面结构( 扫描电子显微镜图谱) f i g 1 1s e mp i c t u r e so fc r o s s - s e c t i o n so fs u p e r p o r o u ss u c r o g e l s 蔗糖基聚合物的前体蔗糖酯可以用f t i r ，1 hn m r ，1 hd q f c o s yn m r 和1 3 c n m r 分析确定结构。单体的分离纯化用硅胶柱层析法。聚合物结构主要由蔗糖构成， 保持了蔗糖的完整结构使得蔗糖基聚合物具有安全无毒、生物友好、可生物降解性。用 蔗糖酶、脂肪酶、酰基转移酶、蛋l ；1 酶均不能使蔗糖凝胶降解。在酸性溶液中降解速度 很慢，在碱性溶液中降解速度很快。 非水相蛋白酶合成蔗糖基聚合物 1 3 蔗糖基聚合物的合成 目前国内外报道合成蔗糖基聚合物的方法主要有化学法、酶法和预辐照法三种。化 学法和酶法合成蔗糖基聚合物第一步都是合成含糖不饱和单体。目前报道较多的含糖不 饱和单体是蔗糖酯。蔗糖酯除了是合成蔗糖基聚合物的f j 仃体，同样也是一种新型的多元 醇非离子表面活性剂【1 0 。1 ，白色至黄褐色粉末或无色至微黄色黏稠液体，易溶于乙醇和 丙酮；蔗糖酯中单酯含量越高，亲水性越强；二酯和三酯含量越高，亲油性越强。蔗糖酯 溶于水时有一定的黏度，有润湿性，对油和水有良好的乳化作用，h l b 值为3 1 6 ，亲水亲 油平衡值范围宽，高亲水性产品能使水包油乳状液非常稳定。根据蔗糖羟基的取代度，可 获得很宽h l b 值的蔗糖酯系列产品，有很好的乳化能力和表面活性，能降低表面张力， 同时有良好的分散、增溶、润滑、渗透、起泡、粘度调节、防止老化、抗菌等性能【1 2 1 。 取代度在6 以上的蔗糖酯具有食用油脂的表观性能和口感，但它不被人体内的脂肪酶水 解，不提供能量，在食品中可代替部分或全部脂肪。 1 3 1 化学法 化学法合成蔗糖酯已经有5 0 多年的历史，经过各国科学家的努力已经成功实现了工 业化。使用化学法对蔗糖进行选择性酰化是一个复杂的过程，经常要先屏蔽其它羟基的 活性，在反应结束后再恢复其活性，很容易发生副反应，使得产物体系是一个复杂的混 合物，给分离纯化带来一定网难。化学法对于蔗糖分子中的8 个羟基的选择顺序大体为 6 6 4 l ， 2 3 ，3 ，4 位。 1 9 5 6 年o s i p o w 开发了s n e l l 法，即以d m f 或d m s o 为溶剂，在k 2 c 0 3 催化下蔗 糖与脂肪酸甲酯发生的酯交换反应。但由于溶剂损失和蔗糖精制到食用水平费用很高， 所以未得到推广。改进的s n e l l 法以丙二醇作溶剂，形成微乳化液，使得反应顺利进行。 但由于反应体系不稳定而且需要很高的真空度，在工业上不好控制，且副产物丙二醇脂 肪酸酯很难从产物中除去，故所得产品纯度不高【l3 1 。 s i m p s o n l l 4 】用原乙酸三甲酯在对甲苯磺酸的催化下，在d m f 中和蔗糖的4 、6 位羟 基形成一个环状化合物，然后水解得到4 乙酰基蔗糖和蔗糖6 酯的混合物。在有机碱的 作用下使绝大部分的4 乙酰基蔗糖转化为蔗糖6 酯。其中的原乙酸三甲酯可以用原乙酸 三乙酯代替。原乙酸三甲( 乙) 酯可用乙腈、无水甲( 乙) 醇和干燥的氯化氢气体制备 非水相蛋白酶合成蔗糖基聚合物 h o h o h m e n t e c h l l 7 1 用偶氮二甲酸异丙酯在苯甲酸催化下于d m f 中和蔗糖反应形成6 苯甲 酰基蔗糖来保护6 位羟基。但该方法中偶氮二甲酸异丙酯的用量较大、回收难，原料成 本太高。 o h o 少。h o h d m f o h o h m u f t i l l 8 1 等用乙酸酐在吡啶催化下与蔗糖反应。反应速率与蔗糖和乙酸酐的浓度成 正比，蔗糖过量有利于生成蔗糖单酯。该方法易产生多乙酰化的蔗糖酯衍生物。主产物 是蔗糖6 酯，但收率也只有4 0 左右，且产物较难分离。 篡+ 0 一邺人o o 使用二丁基氧化锡合成蔗糖酯的研究起步较早。1 9 8 4 年，h o l z a p f e l b g l 等报道了借 助于二丁基氧化锡区域选择性的对蔗糖衍生物中具有活性的仲羟基进行苯甲酰化，可高 收率得到单苯甲酰化或二苯甲酰化蔗糖衍生物，且二者的比率可以通过改变溶剂的协同 能力或添加l e w i s 酸来改变。1 9 9 0 年，n a v i a 2 0 】将二丁基氧化锡用于蔗糖衍生物的制备， 先由二丁基氧化锡与蔗糖在甲醇中回流反应，再除去甲醇后得到l ，3 - 二( 6 o 蔗 糖) 1 ，1 ，3 ，3 四丁基二氧化锡( d b s s ) ，再用d m f 稀释的乙酸酐于低温下对d b s s 进行乙 酰化得到蔗糖6 酯，收率达到了8 8 9 6 。反应后用二氯甲烷进行萃取回收有机锡，能 够节省成本。 4 o 。= 6 _ o h ，因此本实验的结果 与前人的报道是基本一致的。 本试验用酶法合成的蔗糖l 一甲基丙烯酸酯的结构如下： 5 7 小结 h c h 3 图5 1 7 蔗糖单酯的结构 f i g 5 17t h es t r u c t u r eo fs m m 2 h 通过对蔗糖酯的纯化表征证实了：蛋白酶n 在有机溶剂中催化了蔗糖与甲基丙烯酸 三氟乙酯发生酯交换反应生成了蔗糖酯，蔗糖酯在化学引发剂的作用下聚合得到了蔗糖 基聚合物。使用薄层色谱( t l c ) 监测反应进程。硅胶柱纯化蔗糖酯，洗脱条件为：三氯甲 烷甲醇水= 4 0 ：1 0 ：1 ( 体积比) ，成功的分离得到了蔗糖酯的纯品。 使用红外光谱( f t - i r ) 对产物结构进行表征，通过对比蔗糖、甲基丙烯酸三氟乙酯、 蔗糖酯和蔗糖基聚合物的红外光谱图，证实了蔗糖酯结构中既具有蔗糖多羟基的特征， 又具有甲基丙烯酸三氟乙酯结构中羰基( c = o ) 和双键( c = c ) 的特征吸收。蔗糖基聚合物比 蔗糖酯少了c = c 伸缩振动吸收峰( v c ) ，而且在1 5 0 0c m 。1 - 6 0 0c m d 的吸收峰强度要弱 很多，说明了c = c 已经打开并聚合成大分子。 高效液相色谱( h p l c ) 是用来定量测定反应体系中蔗糖酯含量的方法。使用n h 2 柱， 流动相为乙腈：水= 7 5 ：2 5 ( v v ) ，柱温3 0 的色谱条件下，成功实现了蔗糖和蔗糖酯的 4 9 广西大掌硕士学位论文非水相蛋白酶合成蔗糖基聚合物 分离，能够准确进行蔗糖酯定量测定。 使用电喷雾质谱测定了蔗糖酯的分子量为4 1 0 1 ，与蔗糖甲基丙烯酸单酯的分子量 相吻合。 通过比较蔗糖、甲基丙烯酸三氟乙酯和甲基丙烯酸蔗糖单酯的核磁共振谱图确定了 酯交换反应发生的位置是在c 1 ，。 非水相蛋白酶合成蔗糖基聚合物 6 1 前言 第六章蔗糖基聚合物在药物缓释上的应用 药物缓释及控释药物制剂是国内外医药产品发展的重要方向。由于开发周期短、 投入少、经济风险低、技术含量增加而附加价值显著提高等而被制药工业看重。国外上 市的该类制剂品种达2 0 0 余种，5 0 0 多个规格。国内缓释、控释药物制剂也在不断增加， 1 9 9 0 年版中国药典仅收录茶碱和硫氮卓酮控释片两个品种，1 9 9 5 年版中国药典已收录 包括氨茶碱、茶碱、硫酸庆大霉素、氯化钾、盐酸维拉帕米等新的缓释或控释制剂。实 际上市品种已达数十种，更多品种在研发、临床实验和审批之中。可以说，近年来我国 缓释及控释制剂的研发和生产得到很大发展，无论从生产的品种、数量还是从剂型和释 放机理的研究等多方面已经大大缩短了与先进国家的距离，但是，作为一类新剂型和新 制剂，其生产水平、质量控制和重现性等方面有待提高，方便临床用药的