（微生物学专业论文）发酵法生产透明质酸下游提取工艺方法的研究.pdf

摘要 透明质酸( h a ) 是一种广泛存在于人和动物体各组织中的酸性粘多糖，具 有重要的生理功能，己被广泛的应用于医药及化妆品等各领域。但目前我国的 h a 生产主要是通过组织提取法获得，其产品不能满足市场曰益增长的对h a 的 需求，因此开发先进的发酵法生产h a 的技术就十分必要，而开发出一套完整的 h a 下游分离工艺则是将发酵法应用于实际生产的关键。 目的：研究出一条可用于微生物发酵法生产h a 的完整的下游分离工艺路 线及其技术参数，使发酵的h a 产品达到化妆品级h a 的质量标准。方法：采用 兽疫链球菌s t r e p t o c o c c u sz o o e p i d e m i c u s 进行分批补料式发酵培养。对得到的发 酵液进行h a 分离提取；分别对发酵液的预处理、除菌体、分离、纯化、干燥、 粉碎等工艺条件进行了研究。通过检测h a 得率，分子量损失和蛋自去除率等指 标，选择出最佳的提取方法和条件，并通过中试检验其效果。结果：得到了一条 适用于发酵法生产h a 的工艺路线及相关工艺条件，并通过了中试检验。最后得 到的h a 产品为白色粉末，h a 得率约7 0 ，分子量高于1 4 1 0 6 ，蛋白含量低 于o 5 ，葡萄糖醛酸含量为3 9 1 ，并经红外，紫外光谱分析，基本达到了化 妆品级h a 的要求。结论：获得了一套可用于发酵法生产h a 的下游分离工艺路 线和技术参数，对h a 的工业化发酵生产具有实用意义。 关键词：透明质酸；发酵；中试；分离提取：化妆品级 a b s t r a c t h y a l u r o n i ca c i d ( h a ) i so n ek i n do fa c i d i cm u c o p o l y s a c c h a r i d ow h i c he x i s t s e x t e n s i v e l yi nm a n yt i s s u e s o fp e o p l ea n da n i m a l s h ah a sm a n yi m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a la c t i o n s s o i t i s a p p l i e dt o s u c he v e r yf i e l d s a st h em e d i c i n e sa n d c o s m e t i c s b u tt h em a i np r o d u c t i v em e t h o d o l o g yo fh ai no u rc o u n t r ys t i l lr e m a i n s e x t r a c t i o nm e t h o da tp r e s e n t i tc a n tm e e tt h ei n c r e a s i n gd e m a n df o rh ad a yb yd a y , s o i ti sv e r ye s s e n t i a lt o p o p u l a r i z et h ea d v a n c e dt e c h n o l o g yo fp r o d u c i n gh a f e r m e n t a t i o nm e t h o d d e v e l o p i n go n ed o w n s t r e a mc r o f tw h i c hc o a td r a wh af r o m t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hi st h ew a yb yw h i c hf e r m e n t a t i o nm e t h o dc a nb eu s e di n c o m m e r c i a lp r o d u c t i o n p u r p o s e ：d e s i g n i n ga s e to fd o w n s t r e a me x t r a c t i n gc r a t ta n dt e c h n i c a l p a r a m e t e r st h a tc a nb eu s e di nc o m m e r c i a lp r o d u c t i o n m a k i n gt h eh ap r o d u c tr e a c h t h eq u a l i t yr e q u i r e m e n t so fc o s m e t i cg r a d eh a m e t h o d ：u s i n go n ek i n do fb a c t e r i a s s t r e p t o c o c c u sz o o e p i d e m i c u s ，f e r m e n t a t i o n b r o t hc a r lb e g o tb y b a t c ha n d s u p p l e m e n t a r yf o o di nf e r m e n t o r s t u d y i n gt h es i xs t e p so fe x t r a c t i n g ：p r e t r e a t m e n t ，g e t r i do fi m p u r i t y ，d i s e n g a g e m e n t ，p u r i f i c a t i o n ，d r y n e s sa n dg r i n d w h i l es t u d y i n ge v e r y s t e p ，m e a s u r i n gt h eh ar e c o v e r yr a t e ，t h el o s sr a t eo fm o l e c u l a rw e i g h t ，a n dt h e e l i m i n a t i o nr a t eo fp r o t e i n s c h o o s i n gt h eb e s tm e t h o d sa n dc o n d i t i o n s j o i n i n gt h e m i n t oo n er o u t e ，a n de x a m i n ei t sr e s u l tt h r o u g ht h ep i l o tt e s t r e s u l t ：h a dg o tac r a f t r o u t ea n ds o m et e c h n i c a lp a r a m e t e r s i nt h ep i l o tt e s t ，t h eh a p r o d u c ti sw h i t ep o w d e r , t h eh a r e c o v e r yr a t ei s7 0 ，t h em o l e c u l a rw e i g h ti sh i g h e rt h a n1 4 1 0 6 t h ec o n t e n t o fp r o t e i ni sl o w e rt h a n0 5 。t h ec o n t e n to fg l u c u r o n a t ei s 3 9 1 a n a l y s i n gw i t h i n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n du l t r a v i o l e rs p e c t r o s c o p y , i tc a nb es e e nt h a tt h e p r o d u c t sh a v er e a c h e dt h eq u a l i t yr e q u i r e m e n to fc o s m e t i cg r a d eh a c o n c l u s i o n ： g e t t i n ga s e to fd o w n s t r e a me x t r a c t i n gc r a f ta n dt e c h n i c a lp a r a m e t e r st h a tc a nb eu s e d i nt h eh a p r o d u c t i o np r o c e s st h r o u g hf e r m e n t a t i o n i th a sp r a c t i c a lm e a n i n gf o rt h e f e r m e n t a t i o nm e t h o do fh a p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：h y a l u r o n i ca c i d ；f e r m e n t a t i o nm e t h o d ；p i l o tt e s t ；e x t r a c t i o n ；c o s m e t i c g r a d e ； 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权鲍规定，即：研究生在校攻读 学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和 借阕。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同 时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作 者单位为西托大学。 茎差蓑妻纂：兰霎? 疆指导教师签名：丝 学位论文作者签名： 鳟指导教师签名：丝 6 f 年6 强( 一疆口，每其勿b 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其饱入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含力获褥西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： p 才年 日呜幻 第一部分前言 1 透明质酸的结构和理化性质 1 1 透明质酸的结构 透明质酸c h y a l u r o n i ca c i d ，简称h a ) 又名玻璃酸，是由m e y e r 1 1 于1 9 3 4 年 首先从牛眼玻璃体中分离得到的一种直链酸性粘多糖。分子量为1 0 1 0 5 4 0 1 0 6 d a 之间。其分子结构是由n 乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过p l ，4 和p l ，3 糖菅键反复交替连接而成。分子中两种单糖p - d 一葡萄糖醛酸( g l u c u r o n i ca c i d ) 和 n 乙酰氨基d 葡萄糖胺甜a c e t y lg l u c o s a m i n c ) 按1 ：1 的摩尔比组成。其双糖结 构如下图： 1 2 透明质酸的理化性质 h a 为白色、无定形固体、无臭无味。其具有强烈的吸湿性、溶于水、不溶 于有机溶剂，水溶液的比旋度为- - 7 0o 一8 0 0 ，在氯化钠溶液中由于葡萄糖醛酸 中的- - c o o h 基解离，产生h + 使得h a 呈现为酸性多聚阴离子状态，赋予了h a 酸性粘多糖的性质。h a 具有高分子量和大分子体积的特性，分子在溶液中高度 伸展与随机卷曲的构型使其占有很大区域，其流体力学体积较未水化时所占空间 大1 0 0 0 倍。并且由于直链轴上单糖之间氢键的作用，h a 分子在空间上呈刚性的 螺旋柱型【2 】，其半径为2 0 0 r i m ，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强烈的亲水 性；同时羟基的连续定向排列，又在分子链上形成高度的憎水区，h a 分子的亲 水和憎水特性，使得浓度低于l 的h a 也能形成连续的三维蜂窝状网络结构 3 1 ， 水分子则在网络内通过极性键和氢键与h a 分子相结合，使得这些水在柱内固定 不动，不易流失。从而使h a 像“分子海绵”样，可以吸收与保持其自身重量 上千倍的水分，是国际上公认的最好的保湿剂 4 1 。 h a 最突出的特点是有较高的粘度特性，其溶液的粘度，遇到下述条件( 1 ) p h 低于或高于7 ；( 2 ) 透明质酸酶的存在；( 3 ) 许多还原性物质如半胱氨酸， 焦性没食子酸，维生素c 或金属离子存在：( 4 ) 紫外线，电子束照射等。可发 生不可逆的下降。( 1 ) 和( 2 ) 可能是因引起糖苷键的水解造成的，还原剂的作 用机制还不十分清楚，辐射破坏可能是因分子之间的解聚造成的。在h a 及其制 剂的生产中，应尽量减少分子链的降解，保持其大分子特性【5 l 。 2 透明质酸的用途 2 1 透明质酸的生理功能 h a 广泛存在于各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼 玻璃体、卵细胞、血管壁等。在不同的组织中h a 的生理作用也有所不同：在皮 肤中主要表现为保水作用；在关节滑液中主要为润滑作用；在血管壁中主要调节 通透性。在结缔组织中，透明质酸可以与蛋白结合成分子量更大的蛋白多糖分子， 它是保持疏松结缔组织中水分的重要成分。若将蛋白多糖的糖链分解，则丧失保 持细胞外水分的能力。分布在结缔组织中的蛋白多糖，通过氨基多糖与水结合， 这种透明质酸一蛋白质一水形成的凝胶状态将细胞粘合在一起，发挥正常的细胞 代谢作用及组织保水作用并保护细胞不受病原菌的侵害，防止感染，使皮肤具 有一定的韧性与弹性。另外h a 作为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷， 可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性。 2 2 透明质酸在医学上的应用 h a 本身就是人和动物体内的组成成分，无毒，无免疫原性，具有生物相容 性和降解性【6 j ，作为医药原料安全可靠，因此其是深受欢迎的新型生物医学材料， 具有很高的医用价值。 明质酸在i 缶床医学方面也有广泛的应用。m i l l e r 和s t e g m a r m l 7 1 曾把h a 用于 眼外科人工晶体植入手术，发现它能保护角膜内皮，也能保护虹膜免受人工晶体 支撑袢损伤。在其它眼科手术中h a 的使用可使成功率增高，并发症减少。特别 是对于粘性手术来说，h a 是理想的和唯一使用的材料。预计对视网膜剥离手术、 开放性玻璃体切除术、外伤眼球的修复、角膜移植术和抗青光眼手术等，h a 可 能会有更重要的价值 8 】【9 】。 用h a 治疗骨关节疾病，主要利用h a 独特的流体力学性质。它的主要作用 在于保护关节软骨，润滑关节腔，改善关节液和抑制疼痛，而且外源性高分子量 2 的透明质酸注射在关节腔内，改善了关节腔的生物环境，促进患者自身合成高分 子量的h a 。r y d e u 等【l o 】用粘稠的h a 溶液治疗关节炎并取得了很好的疗效，这 种方法后为许多同类治疗方法所证实。 1 9 9 1 年k i n g 等发现，h a 有益于伤口愈合。这种作用的机制尚不清楚。但 认为h a 在组织的再生，重塑和愈合过程中具有促进作用。 在外科手术后，可应用h a 作为手术后防治组织粘连，使粘结的发生率大大 降低。h a 防治术后组织粘连的机理是：h a 具有高分子纤维网状结构，涂布于 组织表面起到阻隔作用，在腹膜修复期起到一个临时的屏障；抑制术后出血和渗 血，减少能形成永久粘连骨架的数量，避免组织接触面的纤维蛋白沉着；高浓度， 高分子量的h a 能抑制粒性白细胞迁徙和巨噬作用，并且抑制血小板的沉积显示 出h a 的抗炎特性；h a 与间质细胞和成纤维细胞表面的高亲和力和h a 受体蛋 白相互作用，提高这些细胞的迁徙能力并使其迁徙定向，从而改善内源性修复过 程；h a 凝胶覆盖于创伤浆膜表面，维持充分的时间不降解代谢，使早期的刨伤 组织修复规则而有序地生长，直至形成连续的间皮细胞层覆盖于刨伤表面，达到 生理性修复】。 h a 还可作为疾病诊断指标。因为血中的h a 很容易检测，于是它可作为一 种观察指标辅助诊断某些疾病。现已证实，h a 是反映肝内皮细胞功能和肝硬化 的有实用价值的新指标【1 2 。患恶性肿瘤时，h a 的量变与肿瘤细胞的浸润有关。 h a 加药物可作缓释试剂或靶向诱导【1 i i 。h a 作为一种载体，可将各釉药物 导向各病理部位，让药物定位于作用部位同时缓慢释放，这样可大大增加药物的 疗效【7 1 。 2 3 透明质酸在化妆品工业中的应用 h a 既具有强吸水性，又有调节人体表皮水分的特殊功能。它可以吸收超过 自身重量1 0 0 0 倍的水分，但在外部环境湿度变化时，它的保湿性又可调节至适 度，这也是h a 较其它保湿剂的最大优越性。h a 具有较强的消皱功能，可增加 皮肤弹性，延缓皮肤衰老，使皮肤柔嫩、光滑，在保湿的同时又是良好的透皮吸 收促进剂，这就是h a 保湿性和营养性的双重作用，是其它任何保湿剂无法比拟 的。同时，h a 是具有直链结构的生物高分子制品，其水溶性具有很高的粘度， 可使水相增稠，与油相乳化后的膏体细腻均匀，具有稳定乳化作用。由于h a 的 营养性、增稠性，特别是其良好的保湿性使其成为化妆品，特别是高档化妆品不 可缺少的主要保湿成分。 2 0 世纪8 0 年代初，h a 优异的保湿功能受到了国际化妆品界的广泛关注。 在国际化妆品行业中，许多著名的化妆品生产商都在竞相开发含h a 系列的护肤 品当今在国内外化妆品市场上添加h a 的高档化妆品日益增多，含有h a 的化 妆品被公称为“仿生化妆品”，添加h a 的化妆品已成为国际日化界的主流产品。 有关文献资料和国内外近几十年大量的应用表明，h a 可以用于膏霜、乳液、面 膜、美容液、化妆水、口红、粉底、精华素等护肤化妆品中，也可以用于洗发、 护发、摩丝、洗面奶等产品。如日本资生堂公司的“b h 2 4 ”精华素，美国r e v l o n 公司的“m o o n d r o p 5 ”保湿剂，法国m a y b e u i n 公司的h y d r o b e u a 润肤露， 国内的永芳、自然美等品牌的化妆品都添加有h a t l 3 】，尽管产品价格昂贵，仍深 受消费者的喜爱。 化妆品对h a 分子量和添加量的要求，因产品的特性不同而有所差异，分子 量越大，成膜性越好，但渗透性相对欠佳；分子量较低的产品，成膜性相对较差， 但渗透作用明显。因此，应根据化妆品的不同需要选择不同分子量的h a 。添加 量一般在l 左右，特殊用途的化妆品添加量高达5 。一般来说，抗皱去皱类、 防晒类化妆品应选择分子量较高的产品，添加量应在l o a o 至5 范围内。而洗面 奶、面膜等化妆品，主要利用h a 的通透性，分子量应选择低一些，添加量一般 在1 左右【1 4 】。 h a 还可作为口服美容保健食品【嘲。其理论依据是：h a 通过口服经消化吸 收，增加体内h a 合成的前体，使皮肤和其他组织的合成量增加，从而使皮肤 的保水性能增加，富有弹性，皱纹减少。口服h a 可补充体内h a 的不足，预防 老化，维持老龄化人群的健康。 2 4 透明质酸的市场价值 2 0 0 4 年全球的h a 在化妆品和医疗用途上，销售总值高达3 0 , - 4 0 亿美元， 每年以很高的速率增长，估计在未来的几年内，每年将超过1 0 0 亿美元。h a 的 级别不同，售价差额很大；化妆品级的h a 的价格已由5 0 0 0 美元k g ( 8 0 年代) 降 至目前的3 0 0 0 4 0 0 0 美元k g ，医用级h a 的价格为2 6 万美元k g 。1 9 8 5 年国际 市场h a 的总销售额达1 亿美元，1 9 9 0 年达2 亿美元，1 9 9 5 为6 亿美元1 9 9 7 年 4 全世界仅用于眼科手术中的h a 产品已超过1 亿美元且每年都有上升趋势美国 l 5 f e c o r e 公司认为仅作为外科手术防粘连产品这一项h a 在世界市场上每年就可 高达1 2 亿美元国外的焦点已集中在医药级的h a 的研发上美国b j o m s a r i 公 司采用h y l a n 技术开发了一种商品名为s y n v i s c 的产品，用于补充人体骨关节滑 液并可治疗关节炎、肩周炎等疾病，1 9 9 6 年1 2 月份德国b i o m s a r t 公司以8 0 0 万美元的代价向b i o m s s r i 公司购买了s y n v i s c 的部分专营权，1 9 9 7 年初 b i o m s a r t 公司又以2 3 0 0 万美元的价格将s y n v i s c 的部分专营权卖给了美国的 w y c a y c 公司据市场预测分析表明、这种产品全球每年能有5 万美元的销售市 场m s a t r i 公司目前正在对原有发酵设备进行政造，同时在兴建新的生产工厂， 建成投产后能使产量增加4 倍加拿大h y a l 制造公司开发的一种名叫5 0 1 r a s e 的 药物，用于治疗角膜化病、皮肤病，抑制癌病变h y a l 公司估计s 0 1 r a s e 仅在 美国的年销量就可达2 亿多美元呻i 。 而我国化妆品级h a 市售价1 3 万元k g ，医药级h a 市售价8 万元k g 。我 国目前的h a 年需求量从上世纪9 0 年代中期的i - 2 吨已经增长到现在的5 - 6 吨， 并且将会继续大幅度增长叩1 。 3 透明质酸的制备方法 制备h a 主要有两种途径：一种是从动物组织中提取；一种是通过微生物发 酵获得【1 8 】，其比较见表1 1 。 表1 i 提取法与发酵法生产h a 的比较 t a b l 1t h ec o n t r a s to f e x t r a c t i o nm e t h o da n df e r m e r l t a t i o nm e t h o d 其中从动物组织提取的工艺已相当成熟，是目前生产h a 的主要手段，而发 酵法由于菌种和生产工艺的限制，尚未得到广泛应用。 3 1 从动物组织中提取透明质酸 国内目前有十几家透明质酸的生产厂家，如山东福瑞达公司、山东东营东辰 集团公司、上海聚源生物科技公司、广州申强化工有限公司、浙江瑞邦制药厂、 江苏无锡柯兰精细化学制品厂、重庆团结生化制品有限公司、江苏吴江振兴生物 制品厂、杭州嘉伟生物制品有限公司等，他们大都是用动物组织提取法【1 5 】。从动 物组织中提取h a 常用的原料有鸡冠( 公鸡冠中h a 含量达7 5 啦g ) 、脐带、猪皮 等岬】 2 q ，主要工艺过程包括脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。从动 物组织提取h a 的一般过程如下：先将组织匀浆，再用水和稀盐溶液提取；提取 液用氯代十六烷基毗啶或十六烷基三甲基溴化铵沉淀；将所得的沉淀溶解除渣 后，用2 3 倍乙醇沉淀即得粗产品【7 l o 纯化可用乙醇或季铵盐反复沉淀进行处 理，或采用酶解、超滤【2 1 1 、离子交换田1 等技术进一步去杂质及蛋白。这种方 法的特点是工艺流程简单，适用于原料来源分散的小规模生产。但由于原料有限， 且原料中h a 的含量低，同时h a 又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中， 致使其收率低，提纯难，成本过高，产品质量差，且难于应用于大规模生产。随 着h a 需求量的不断增大，迫切要求生产大量的高质量h a ，动物组织提取法已 不能适应这种要求，需要有新的方法来替代它。 3 2 发酵法生产透明质酸的现状 微生物发酵法生产h a 是开发h a 生产的一个新途径，该方法具有原料来源 丰富、成本低、提制工艺简便、产品纯度高、易形成规模化生产等特点嘲，因而 具有广泛的市场应用前景。 可产生h a 的微生物主要为链球菌的a 组和c 组菌【2 钔，如酿脓链球菌( a 群) 、 兽疫链球菌( c 群) 、马链球菌( c 群) 、类马链球菌( c 群) 、缺乳链球菌( c 群) ，a 组菌群是人类致病菌，较少用作菌种大规模的发酵；c 组致病性较弱，从大量的 报道资料看，大部分的研究者所采用的c 组菌种，如马腺疫链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s e q u i ) 、兽疫链球菌( s t r e p t o c o c c u s z o o e p i d e m i c u s ) 、类马链球菌等。 直接用野生菌发酵，发酵液中会有一定量的h a ，但含量极低，一般情况下不会 超过2 l ，得到的h a 分子量也很低。因此必须经过诱变、筛选等手段选育出优 6 良菌种1 2 5 l ，才能在发酵液中得到大量的高分子量h a ，为以后的工业化生产 打下坚实的基础。 国外自上世纪7 0 年代开始研究利用发酵法生产h a 。日本资生堂在上世纪 8 0 年代后期实现了发酵法生产h a 的工业化，并将h a 成功地应用于其生产的 各种化妆品中。至今国际上发酵水平已达到6 7 l p ”。 我国的h a 年产量在2 吨左右，山东福瑞达等几家已开始通过发酵法生产 h a ，但总体规模较小，还远远不能满足市场的需求，每年还需从国外进口透明 质酸以弥补国内需求。 发酵法之所以没有得到广泛应用其原因是多方面的，其中对发酵液中h a 产 物的提取工艺不成熟是一个重要方面。具体表现在缺少一条被广泛认可和接受的 完整的可用于工业生产的下游分离工艺，分离纯化发酵液中的h a 有多种报道， c i f o n e l l i 3 2 佣活性炭和纤维素粉末混合制成吸附柱：而w a r r e m 采用丙酮浓缩， 冰乙酸和乙醇沉淀法；t h o n a r d t 3 3 】等先用5 0 的( n h 4 ) 2 s 0 4 除杂蛋白，将( n h 4 ) 2 s 0 4 的浓度增至6 5 ，通过盐析作用沉淀h a ，用氯仿一丁醇混合液洗涤，1 5 倍体 积的乙醇沉淀h a 。但这些方法多是用于实验室小规模分离，并没有真正用于工 业生产，现有的用于工业生产分离的方法多是从动物组织提取h a 的方法借鉴来 的，如乙醇沉淀、离子交换等。但发酵法生产h a 有其自身的特点，如发酵液体 积大，且其中含有大量的菌体及其代谢物等，这就决定了从发酵液中分离h a 的 处理量和复杂程度要比组织提取法大的多，完全照搬组织提取的方法是不可行 的，必须根据发酵法的具体情况设计出一条新的工艺路线。 对发酵法生产h a 进行分析可以知道：从发酵液中提取h a 首先要解决发酵 液中有大量菌体的问题，这些菌体可以分泌一种可解离h a 的透明质酸酶，降低 h a 分子量，从而影响到h a 产品的质量，所用进行下游分离纯化时，必须尽快 杀灭和除去发酵液中的菌体，并使酶失活，所以必须经过预处理步骤。其次是发 酵液中的h a 含量高、分子量大，所以发酵液的粘度很高，这就给分离的过程带 来许多不便，如不能用离心法除菌体，收率会因h a 的黏附而降低等。最后，由 于对h a 产品分子量有十分严格的要求( 5 1 0 5 1 5 1 0 6 d a ) 3 4 ，而h a 易因 酸、碱或加热处理而分解：在铁、铜等金属离子和抗坏血酸或半胱氨酸等还原剂 共存下，经氧自由基、x 射线、y 射线、紫外线和超声波作用而降解；它还可被 透明质酸酶和硫酸软骨素酶分解。因此，对h a 的提取就要求在分离纯化的同时， 严格控制条件，减少h a 分子的降解，保证产物的高分子量。 4 透明质酸生产待解决的问题 综上所述，h a 产业前景广阑，而发酵法生产h a 的工艺急待完善。要加快 发酵法生产h a 的研究开发，应主要从以下几个方面着手： ( 1 ) 筛选性能优良的菌株，并通过诱变、基因工程等手段构建新的工程菌， 为工业化合成大分子、纯度高的透明质酸提供基础。 ( 2 ) 以现有工艺为基础，优化工艺条件，开发高效专用的生物反应器建立完 善的在线监测、将i t 技术引入发酵工艺的控制过程中。 ( 3 ) 加强提取工艺的开发，得到一条易于工业化的下游分离工艺路线。 ( 4 ) 开发快速、简便的分析技术。 本实验重点从分离提取工艺入手，通过对不同h a 提取工艺的比较，期望能 找到一条在保持h a 高分子量和高得率的前提下，尽量降低产品中的蛋白含量的 分离工艺路线，使最后分离得到的h a 产品能满足化妆品级h a 的要求( 分子量 大子1 0 1 0 e d a ，蛋白含量在0 5 左右) 阁，从而能作为化妆品级h a 原料， 并为进一步纯化为医用级h a 打下基础。 第二部分材料与方法 1 试剂 h a 标准样 葡萄糖醛酸内酯 四硼酸钠 咔唑 三氯乙酸 考马斯亮蓝 牛血清蛋白 氯代十六烷基吡啶( c p c ) 硅藻土 珍珠岩 阳离子交换树脂 a r a r a r a r a r a r a r 上海华东理工大学提供 s i g m a 太仓化工二厂 上海技术开发经营公司 上海凌峰化学试剂有限公司 上海技术开发经营公司 上海技术开发经营公司 上海青浦合成试剂厂 上海大合化学品有限公司 信阳崇真助滤剂有限公司 上海华震科技贸易公司 表2 1 硅藻土的型号及主要指标 t a b 2 1t h et y p ea n dm a j o ri n d e xo f s u r p e r - c e l l 型号 粒度 o 6 u m 6 2 0 1 a m 2 0 4 0 9 m 4 0 u m s h - 2 0 0 b5 0 6 04 0 5 01 0 1 5l 2 s h - 5 0 0 b s h - 5 0 0 c s h 8 0 0 a 化学纯 2 5 3 5 5 1 0 3 5 3 5 4 5 5 5 4 0 5 0 2 5 3 5 6 0 7 0 1 5 2 0 2 5 - - 3 0 3 5 5 0 2 0 2 5 5 2 0 5 1 0 表2 2 珍珠岩的型号及主要指标 1 h b 2 2t h et y p ea n dm a j o ri n d e xo f p e r l i t e 表2 3阳离子变换树脂的型号及主要指标 1 1 b 2 3 t h et y p ea n dm a j o ri n d e xo f c a t i o ne x c h a n g er e s i n 2 仪器 5 l 发酵罐上海伯瑞生物技术发展有限公司 5 0 l 发酵罐 上海华东理工大学生物反应器国家重点实验室 7 2 1 型分光光度计 上海第三分析仪器厂 咖乌氏黏度计 上海人和科学仪器有限公司 离心沉淀器上海手术器械厂 2 z 一2 型旋片真空泵 上海真空泵厂 板框压滤机c r l o c 一0 l o 。一1 1 上海萃工机械有限公司 紫外分光光度计u v - - p c i 6 0 1日本s h i m a d z u 红外分光光度计e q u i n o x德国b r u k e r 3 ，菌种与培养基 菌种为兽疫链球菌s t r e p t o c o c c u s z o o e p i d e m i c u s ( 华东理工大学保藏) - 种子培养基( ) ：葡萄糖o 2 ，牛肉膏1 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏0 5 ，n a c l0 2 ， n a 2 h p o 。1 2 h 2 0o 1 ，k h 2 p 0 4 0 0 1 2 ，p h 7 0 - 7 2 ，1 2 1 灭菌3 0 分钟。 发酵培养基( ) ：蛋白胨2 ，酵母膏1 ，n a c l0 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 0 , ，k2 h p 0 4 o 2 5 ，葡萄糖4 ，1 2 1 灭菌3 0 分钟。其中葡萄糖单独灭菌，在接种时加入，1 2 1 灭菌3 0 分钟。 4 培养方法 甘油管中保存的兽疫链球菌一平皿涂布培养( 2 4 小时，3 76 c ) 一 斜面 培养( 2 4 小时，3 7 c ) 一种子培养( 8 小时，3 7 。c ) 一摇瓶发酵或小罐发酵( 接 种量为5 ) 。 发酵方式为分批补料式培养，搅拌转速为6 0 0 7 0 0 r m i n ，通气量2 0 l m i n ， 每1 小时补葡萄糖糖，控制葡萄糖含量约4 左右。 5 分离步骤 发酵液一预处理一除菌体一分离一纯化一干燥一粉碎 6 阳离子树脂的预处理 由于蛋白质是生物大分子，所以选择d 1 5 5 、d 0 0 1 、h d 8 这三种大孔型阳 离子交换树脂，其中d 0 0 1 和h d 8 是强酸性交换树脂，d 1 5 5 是弱酸性树脂。采 用静态交换法，阳离子交换树脂预处理方法为： 1 称一定量的湿树脂于三角瓶内，7 0 8 0 c 水洗7 次 2 强酸阳离子树脂用二倍体积1 n 盐酸分两次浸泡，每次1 h ，弱酸性阳离子树 脂用三倍体积1 n 盐酸分三次浸泡，每次1 h ，甩去离子水洗至上清液p h 5 0 3 强酸阳离子树脂用二倍体积1 nn a o h 分两次浸泡，每次1 h ，弱酸性阳离子 树脂用三倍体积1 nn a o h 分三次浸泡，每次1 h ，用去离子水洗至上清液p h 9 0 4 强酸阳离子树脂用二倍体积1 n 盐酸分两次浸泡，每次1 5 h ，弱酸性阳离子 树脂用三倍体积l n 盐酸分三次浸泡，每次1 5 h ，转换为h 型，用去离子水洗至 上清液p h 6 0 5 使用时倒掉瓶中的去离子水，加入滤液 7 测定方法 7 1 透明质酸含量测定 采用b i t t e r - m u i r 的咔唑法【3 ”。 7 1 1 原理 在沸水中h a 被浓硫酸分解成葡萄糖醛酸，在酸性条件下与咔唑结合形成鲜 艳的玫瑰红色，且颜色的深浅与糖醛酸含量成正比关系，再由糖醛酸含量除以 0 4 6 4 3 ，( 糖醛酸在h a 中含量为4 6 4 3 ) 即可知样品中h a 的量【l6 。 7 1 2 试剂的配制 ( 1 ) 4 0 b g m l 葡萄糖醛酸内酯标准溶液：称取2 0 m g 葡萄糖醛酸内酯( a r t ) ， 溶于苯甲酸饱和溶液中。 ( 2 ) 0 0 2 5 m 硫酸硼砂溶液：称取四硼酸钠4 7 7 9 ，溶于浓硫酸( a r ) 5 0 0 m l 中即得。 ( 3 ) 0 1 2 5 咔唑试剂：称取咔唑0 1 2 5 9 ，溶于无水乙醇( a r ) l o o m l 中， 置于棕色瓶中冰箱内保存。 7 1 3 标准曲线的绘制 分别配葡萄糖醛酸内酯浓度为0 、8 、1 6 、2 4 、3 2 、4 0 i t g m l 的标准溶液， 以l m l 蒸馏水为空白对照，慢慢加入5 m l 浓硫酸硼砂溶液，摇匀，放入冰浴中冷 却至4 c 左右，置沸水中煮沸l o 分钟，放入冰浴冷却，然后每根试管各加入o 2 m l 咔唑试剂，摇匀再次煮沸1 5 分钟，冰浴冷却后在5 3 0 r i m 测定吸光度以o d 5 3 0 n m 吸光度为纵坐标，以葡萄糖醛酸内酯浓度为横坐标绘制标准曲线。 n g m l 图2 1 葡萄糖醛酸标准曲线 f i 9 2 1 s t a n d a r dc u r v eo f g l u c u r o n a t e 1 2 l 8 6 4 2 0 2 0 0 0 0 0 o 嚣8 7 1 4 样品测定 取样品溶液l m l ，按照标准曲线的测定方法测定5 3 0 h m 的吸光度，从标准曲 线上查出对应的葡萄糖醛酸浓度乘以稀释倍数，由于葡萄糖醛酸的含量占整个 产量的4 6 4 3 ，因此测得醛酸的含量除以4 6 4 3 ，就可以得到h a 的产量。 h a 得率= ；：i 需兰h 垒a 耄：；燃x t o o 处理前含量样品液体积 7 2 透明质酸分子量的测定 高粘度是h a 溶液的最重要的物理性质之一，其分子量越大，粘度越高研 究发现，多种高分子聚合物的特性粘度n 】的对数值，与其分子量的对数值成线 性关系：【n = k m r ，k 和a 为常数，在一定测定条件下，只与聚合物的种类有关， 每种聚合物都有特定的k 值和a 值。对于h a 来说，其k 值和a 值主要与溶剂的 离子强度和测定温度有关，在通常的测定条件下，k 值取0 0 3 6 ，a 值取o 7 8 。 采用一点法测量【3 6 1 。将样品配成一定浓度，使得n r _ 1 3 0 1 5 0 按多点法测 定样品液的相对粘度r t ，和比粘度n 。，按下式计算特性粘度： 【r 】- 1 f , 2 1 , 7 。一l n r ，) 然后按照公式h 】= o 0 3 6 m o7 8 计算分子量 分子量损失率；( 1 一竺墨生坌王量) 。1 0 0 7 3 蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝法”1 ，以牛血清蛋白( b s a ) 为标准品。 7 3 1 标准益线的绘制 配含牛血清蛋白o ，5 ，1 0 ，2 0 ，4 0 。6 0 p g 的标准溶液，分别加入考马斯亮蓝试 液4 m l ，立即混匀，5 m i n 后在5 9 5 n m 波长处用l c m 比色池测定吸光度，以b s a 微克 数对吸光度做标准曲线。 o1 02 03 04 05 06 07 0 u g 图2 2 蛋白标准曲线 f i 9 2 2 s t a n d a r dc u r v eo f p r o t e i n 7 3 2 样品测定 样品测定是取h a 5 0 0 m g 精密称定，置于l o o m l 量瓶中，加水溶解至刻度，取l m l 于具塞试管中，以下同标准曲线法测定吸光度，从标准曲线得到蛋白质的质量，以 此计算h a 样品的蛋白质含量。 蛋白去除率：( 1 一竺翌星兰鱼鱼量! 堂曼垫堡墼) 。1 0 0 处理前蛋白含量样品液体积 7 4 菌体量测定 分光光度计法 在九= 6 6 0 n m 的条件下测定菌体的光密度。 7 5 红外光谱 样品和标准品均采用k b r 压片，用e q u i n o x 红外分光光度计，在 4 0 0 0 - - - 4 0 0 c m 。范围内进行扫描。 7 。6 紫外光谱 分别将标准品和样品配成2 5 r a g 1 的水溶液，用u v - - p c i 6 0 1 紫外分光光度 计，在波长2 0 0 - - 4 0 0 n m 范围内进行扫描。 1 4 4 5 3 5 2 5 l 5 0 吣c；呲m叭n邮 凸o 1 h a 的发酵工艺 第三部分结果与讨论 h a 发酵的一般工艺流程为：试管菌署中接入三角摇瓶中3 7 c 振荡培养8 h ， 按入种子罐中，接种比例为5 左右，培养8 h ，镜检确认菌体生长良好、无杂菌 后，接入发酵罐中，接种比例为5 左右。采用通气式分批补料发酵，发酵过程 中，维持p h 为7 0 、搅拌转速7 0 0 r r a i n 、葡萄糖含量4 ，没小时取样检测h a 含量和菌体密度等。菌体密度( 以o d 6 6 0 来表示) 及h a 的产量和分子量随时间 变化的情况见图3 1 、3 2 。 8 6 o 鎏4 。 2 0 012 3 456 7 8 91 01 l1 21 31 4 】51 6 t i m e ( h ) 图3 1 发酵生长曲线 m 9 3 1t h ep r o f i l e so f h af e r m e n t a t i o n t i m e ( h ) 一m 含量- - 一分子量 图3 2 姒含量和分子量的变化 f i g s 2 t h ec h a n g eo f h ac o n c e n t r a t i o na n dm o l e c u l a rw e i g h t 结果表明，在发酵至1 6 h 时，h a 含量和分子量达到最大，可放罐，褥到的 发酵液h a 浓度在4 9 l 左右，分子量为2 0 2 2 1 0 6 d a ，蛋白含量为2 5 左右。 2 发酵液的预处理 h a 发酵液粘稠，不易将h a 与菌体快速有效地分离，而菌本身产生的透明 质酸酶，会使h a 降解，从而降低h a 的分子量。因此在从发酵液中提取h a 之 前，需要对发酵液进行预处理，使其中的透明质酸酶失活，防止h a 分子量损失。 故分别研究比较了热处理法和酸处理澍5 1 使酶变性失活的最适条件。 2 1 热处理 2 1 1 最佳热处理温度的选择 加热可使透明质酸酶失活，但温度过高会引起糖苷键的降解而使h a 分子量 降低，而温度过低则酶不会完全灭活，故选择合适的预处理温度对h a 分子量的 影响较大。将发酵液( h a 分子量约2 0 1 0 6 d a ) 用不同的温度热处理1 h ，冷却 至室温，测分子量，计算各处理温度下h a 分子量的损失率，并以标准h a ( 分 子量约1 8 1 0 6 d a ) 作对照，结果见表3 1 。 表3 1 热处理温度对h a 分子量损失率的影响 t a b3 1 t h ee f f e c to f t h e r m o - t r c a t m e n tt e m p e r a t u r e s o i lt h el o s sr a t eo f m o l e c u l a rw e i g h to f h a 由表可知，标准h a 溶液，处理温度在5 0 。c 7 0 c 时，h a 的分子量损失 较小，当温度升高到8 0 时，分子量的损失率升高，说明在高温条件下，h a 会 发生降解。发酵液的h a ，处理温度为5 0 、6 0 时，分子量的损失较大，7 0 c 时降低，8 0 时分子量损失率又升高。比较两组样品的实验结果，发现当处理温 度为5 0 0 、6 0 0 ，标准h a 的分子量损失率远远低于发酵液中h a 的分子量损 失，这是由于发酵液中的酶没有完全失活，而使h a 降解所致；而当处理温度为 7 0 、8 0 时，两者的分子量损失率接近，推测在该温度下，发酵液中的酶基本 失活，h a 分子量的损