谷氨酰内切酶与果糖氨基酸氧化酶的原核表达及其在糖化血红蛋白检测中的应用.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 目的： 原核表达和纯化谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶，研究谷氨酰内 切酶的生物化学特性；以重组谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶为基础， 建立糖化血红蛋白酶法检测方法并对其初步评价。 方法： 以p q e 6 0 g l u c m u t 5 质粒转化大肠杆菌ml5 ，经i p t g 诱导、n i n t a 亲和层析等步骤获得重组谷氨酰内切酶；以偶氮酪蛋白为底物测定谷氨 酰内切酶活性和米氏常数，分析底物浓度、温度、p h 、金属离子和e d t a 对酶活性的影响，并用s d s p a g e 电泳和质谱研究其对h b 的水解作用。 以烟曲霉菌总i a 为模板，通过i m p c r 方法扩增出果糖氨基酸氧 化酶基因，克隆至原核表达载体p e t 3 2 a ( + ) 中，构建重组质粒 p e t 3 2 a ( + ) 】认o x ，转化大肠杆菌r o s e t t a ( d e 3 ) ，经i p t g 诱导表达和 n i n t a 纯化，获得重组果糖氨基酸氧化酶：以糖基化六肽为底物检测重 组果糖氨基酸氧化酶活性。 利用谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的特性，建立糖化血红蛋白 酶法检测方法，测定其准确度和精密度，并将其对临床标本的检测结果 与实验室己建立的h p l c 法和日本爱科来h a 8 1 6 0 型全自动糖化血红蛋 白仪检测结果作相关性分析。 结果： 谷氨酰内切酶可以在m l5 菌中高效表达，纯化后重组蛋白质纯度高， 相对分子量为3 3k d a ，比活性为5 4 0 3u m g 。重组谷氨酰内切酶对偶氮 酪蛋【fi 的k m 值为o 2 6m m o l l ，最适反应温度为5 5 ，最适p h 为8 o ， c a 2 。和m 9 2 + 能激活脯活性，f e 2 + 、z n “、m n 2 十和e d t a 则对酶f 剐生有 谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用 抑制作用。s d s p a g e 电泳和质谱显示重组谷氨酰内切酶对血红蛋白有 特异性水解作用。 用t r i z o l 试剂提取烟曲霉菌培养后的菌体，获得了烟曲霉菌的总 l a 。以c d n a 为模板，通过p c r 扩增出约1 3 0 0b p 的果糖氨基酸氧化 酶基因。将构建的重组质粒p e t 3 2 a ( + ) f a o x 进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶 电泳可见约1 3 0 0b p 的目的片段，测序结果显示所含目的基因序列正确。 阳性重组质粒经诱导表达后，上清液纯化后进行s d s p a g e 电泳，结果 显示重组果糖氨基酸氧化酶的相对分子量约6 5k d a 。以糖基化六肽为底 物，检测其比活性为2 2u m g 。 依据酶法检测糖化血红蛋白的原理和谷氨酰内切酶、果糖氨基酸氧 化酶的特性，建立了糖化血红蛋白a l c 双试剂测定方法。该法对临床高 值、低值标本的c y 值分别为1 0 5 和o 8 9 ；对b i o r a d 公司质控品的 实测值在可接受范围之内。与h p l c 法进行比较，其回归方程为 y = 0 9 7 7 2 x o 3 4 3 2 ( r = o 9 8 4 5 ) ；与h a 8 1 6 0 型全自动糖化血红蛋白仪 测定结果也有良好的相关性，回归方程为y = o 9 8 5 3 x o 5 6 0 4 ( ( r = o 9 9 3 2 ) 。 结论： 谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶可以分别在大肠杆菌m l5 和 r o s e t t a ( d e 3 ) 中获得高效表达。纯化后的重组蛋白质具有较高的生物活 性，并可以用于糖化血红蛋白a l c 的测定。建立的糖化血红蛋白酶学测 定法具有准确度高、精密度好等优点。 蛋白 关键词：谷氨酰内切酶，果糖氨基酸氧化酶，原核表达，糖化血红 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e t 1 0 p r o k a 叫o t i c a l l ye x p r e s st 1 1 e9 1 u t a m y le n d o p e p t i d a s ea n df m c t o s y la m i n oa c i d o x i d a s e ( f a o x ) a n di n v e s t i g a t et h eb i o c h e m i c a lc h a r a c t e s t i c so fg l u t a m y le n d o p e p t i d a s e t be s t a b l i s h 卸dp r e “m i n a r i i ye v a l u a t et h ee n z y m a t i cm e t h o df o rd e t e r m i n g9 1 y c o s y l a t e d h e m o g l o b i nb a s e do nt h er e c o m b i n a n tg l u t a m y le n d o p e p t i d a s ea n d f a o x m e t h o d s t l l ep q e 6 0 g l u c m u t 5w a st r a n s f o m e di n t 0 最z fml5 t 1 1 er e c o m b i n a n t9 1 u t a m y l e n d o p e p t i d 嬲ew a so b t a i n e da r e ri n d u c t i o nw i t hi p t gp u r i f i e db yn i n 1 am e t a la 衢n i t y r c s i n t h ea z o c a s e i n1 i ) l 髑u s e dt od e t e m i n et h ee n z y m a t i ca c t i v 时锄dt h em i c h a e l i s c o n s t a n t ( 1 洫) t h ee a e c t si nd i n e r e n ts u b s 仃a t ec o n c e m t r a t i o n ，t e m p r e t u r e ，p h ，m e t a l i o n s 锄de d t ao nt h er e c o m b i n a n tg l u t a m y le n d o p e p t i d 蹴w e r es t u d i e d t h es d s - p a g e 锄d m a s ss p e c t r o m e t 】拶、e 代u s e dt 0 鲫a l y 趵t h eh y d r o l y s i so fg l u t a m y le n d o p e p t i d a s eo n h e m o g l o b i n t h e c o d i n gg e n eo ff a o xw 弱o b t a i n e d b yr t p c r 舶m 彳印孵以协乃所忉沁 t o t a lr n a ，t h 饥c l o n e di n t om ep l 弱m i dp e t 3 2 a ( + ) o fp r o l ( a r y o t i ce x p r e s s i o n 锄d c o n s t r u c t e dt h ep l a s m i dp e t 3 2 a ( + ) f a o x t h er c c o m b i n 觚tp l a s m i dw 舔衄蚰s f 0 彻e di n t 0 e ，fr o s e t t a ( d e 3 ) 1 1 1 ei n d u c t i o nw 油i p t g 锄dn i n 1 am e t a la f f i n 时r e s i nw e r eu s e d t 0o b t a i n 锄dp u r i 矽t h er e c o m b i n 锄tf a o x t h eg l y c a t e dh e x a p e p t i d e sw 觞u s e dt 0 d e t e m i n et h er e c o m b i n a n tf a o xa c t i v i 吼 a c c o r d i n gt 0t h ec h a r a c t e r i s t i c so fg l u t a m y ie n d o p e p t i d a s ea n df a o x ，a ne n z y m a t i c m e t h o df o rd e t e m l i n gg l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i nw 粥e s t a b l i s h e d t h er e s u l t so fp r e i i m i n a 叫 e v a l u a t i o nw e r eo b t a i n e db ym e a s u r i n gt h ea c c u r a c y ，p r e c i s i o n 龃dc o r r e l a t i o nw i t h m e t h o d so ft h ed e v e l o p e dh p l ca s s a ya n da r k r a yh a - 8l6 0a u t o m a t e dg l y c a t e d h e m o g l o b i na n a l y z e r r e s u l t s t h eg l u t a m y ie n d o p e p t i d a s ew a sh i g h l ye x p r e s s e di n 点_ c 口，fml5a n dt h er e c o m b i n a n t p r o t e i nh a dh i g h e rp u r i t y t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tw a s3 3k d a ，t h er e s u l t so ft h e e n z y m a t i cd y n a m i c sr e v e a l e d t h a tt h ek mw a so 2 6m m o l l ，t h es p e c i n ca c t i v i t yw a s 5 4 0 3u m g ，t h eo p t i m u l l lt e m p e r a t u r ew a s5 5 a n di h eo p t i m u mp hw a s8 o c a 2 a n d 谷氨酰内切酶和果镛氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用 m 9 2 + c o u l di n c r c a s et h ee n 2 y m ea c t i v i 劬b u tf e 2 + ，z n “，m n 2 + a n de d l ac o u l di n h a b i t t l l ea c t i v 咄1 1 1 er e s u l t so fs d s p a g e 锄dm a s ss p e c 仃o m e 仃yr e p r e s e n t e dt h a tt h ep u r i f i e d e n 2 y m ec o u l ds p e c i f i c a l l yh y d r o l y z eh b t h et 0 伽r n a 舶m 彳蹦批扣研扣觚c o u l d b e e x 仃a c t e d b yu s i n g 嘶z o lr e a g e n t t h ee n c o d i n gg e n e ( 13 0 0b p ) o ff a o x 、a so b t a i n e db yr b p c r a f t e re n z y m a t i c a n y d i g e s t i n gt i i er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 3 2 a ( + ) f a o x ，t h el3 0 0b pf h g m e n t c o u l db es e e n b ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l to fs e q u e n c i n gr e v e a l e dt l l a t t i l es e q u e n c eo f t a 唱e tg e n e w a sc o r r e c t r h er e c o m b i n 绷tf a o xw 弱o b t a i n e da f t e rt h e p o s i t i v e r e c o m b i n a i l tp i a s m i dw 嬲i n d u c e d 锄dt h es u p e m 咖tp 嘶f i e d 锄dt h es p e c i f i ca c t i v 时 w 勰2 2u m gu s i n gt h eg l y c a t e dh e x a p e p t i d e s 弱s u b s t r a t e s d s p i a g es h o w e dt h a tt h e r e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fr e c o m b i n a n tf a o x 、v a sa b o u t6 5k d a a c c o r d i n gt 0t h ep r i n c i p l eo f 朗巧m a t i cm e t h o da n dc h a r a c t 州s t i c so fg l u t a m y l e n d o p e p t i d a s e 明df a o x ，ad o u b l er e a g e n tm e t h o dw 弱s u c c e s s m l l ye s t a b l i s h e df o r d e t e m i n i n gg l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i na lc t h ec 殆o fc l i n i c a lh i g hv a l u e 锄dl o wv a l u e s p e c i m e n sw e r e1 0 5 锄d0 8 9 r e s p e c t i v e l y 1 1 h e 眦a s u r e dv a l u eo fb i o r a dc o n 仃0 l s w 船w i m i nt 1 1 ea c c e p t a b l em n g e t h er e 舀e s s i o ne q u a t i o nb e t 、e 锄t h er e s u l t so fe n z y m a t i c m 劬o d 粕dh p l ca s s a yw a sy = o 9 7 7 2 x 一0 3 4 3 2 ( 间9 8 4 5 ) t h ec o 盯e l a t i o nb 咖e e n e n z y m a t i cm e t h o da n dh a 8 l6 0a u t o m a t e dg l y c a t e dh e m o g l o b i na n a l y z e rw 嬲a l s og o o d ( y = o 9 8 5 3 x 一0 5 6 0 4 ，f o 9 9 3 2 ) c o n c l u s i o n s t h eg l u t a m y le n d 叩e p t i d a s e 锄df a o xc a nb eh i g h l ye x p r e s s e di ne z fml5 锄d r o s e t t a ( d e 3 )r e s p e c t i v e l y 觚dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sh a v eh i g h e re n 刁，m a t i ca c t i v 时 a 舵rp u r i f i e d n er e c o m b i n 锄te n 驴e sc 肌b eu s e dt 0m e a s i 鹏h b alc t h ee n 纠m a t i c m e t h o dh 觞a d v a n t a g e so f h i 曲a c c u r a c ya n dg o o dp r e c i s i o n k e yw o r d s ：g l u t a m y ie n d o p e p t i d a s e ，矗1 j c t o s y la m i n o i do x i d 嬲e ，p r o k a 眄o t i c e x p r e s s i o n ，g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i n i v 江苏大学硕士学位论文 第一章引言 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，d m ) 是由于胰岛素分泌缺陷和( 或) 胰岛素作用缺 陷，以血浆葡萄糖( 简称血糖) 水平升高为特征的常见的内分泌代谢疾病，可引起全 身多系统损害。无论在发达国家还是在发展中国家，糖尿病正在迅猛发展而成为现代 社会的流行病。就中国而言，糖尿病的患病率正在呈快速上升趋势，成为继心脑血管 疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要疾病，因此加强糖尿病的诊断与预 防具有现实而重要的意义。目前，糖化血红蛋白( g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i n ，g h b ) 作为 糖尿病流行病学研究、病情诊断和疗效考核的有效检测指标，在临床中得到了广泛使 用，已经成为糖尿病血糖控制的金标准【l l 。研究发现，与空腹血糖和餐后2h 血糖相 比，h b a l c 水平用于诊断糖尿病能更好地反映长期血糖水平和慢性并发症风险，具 有生物变异性较小、无需空腹采血等优点【“j 。美国糖尿病控制及并发症试验( d i a b e t e s c o n 仃0 la n dc o m p l i c a t i o n st r i a l ，d c c t ) 和英国糖尿病前瞻性研究( u kp m s p e c t i v e d i a b e t e ss t u d y ，u d s ) 均把糖化血红蛋白作为糖尿病控制的一个重要评价指标， 且都充分肯定了强化治疗在预防血管并发症发生、发展中的重要作用【5 6 】。2 0 0 7 年中 国2 型糖尿病防治指南【7 】中指出，我国糖尿病以2 型为主，占9 3 7 ，并将糖化血红 蛋白作为血糖控制状态的指标。2 0 0 9 年，美国糖尿病协会( a m e r i c 锄d i a b e t e s a s o c i a t i o n ，a d a ) 、欧洲糖尿病研究协会( e u r o p e 锄a s s o c i a t i o nf o rt h es t u d yo f d i a b e t e s ，e a s d ) 和国际糖尿病联盟( i n t e m “o n a ld i a b e t e sf e d e r a t i o n ，i d f ) 共同组 织的国际专家委员同意推荐使用糖化血红蛋白a l c ( h b a l c ) 诊断糖尿病，而且将 h b a l c 6 5 作为诊断非妊娠相关的糖尿病的切点【列。 1 1糖化血红蛋白的检测及其标准化 1 1 1 糖化血红蛋白概念及特性 血红蛋白由4 条多肽链构成的珠蛋白和4 个血红素辅基组成，珠蛋白的肽链共有 a 、p 、丫、6 、和入种，a 链由1 4 1 个氨基睃残基组成，p 、丫和6 链均由1 4 6 个氨 荩酸残肛组成。正常成人血红篮广1 有3 种1 8 】：血红蛋白a ( h b a ) ，为止常人的主 谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用 要血红蛋白，由一对q 链和一对p 链组成( 瑾2 p 2 ) ，占血红蛋白总量的9 5 以上； 血红蛋白a 2 ( h b a 2 ) ，由一对a 链和一对6 链组成( 仅2 6 2 ) ，约占血红蛋白总量的2 5 ：胎儿血红蛋白( h b f ) ，由一对0 【链和一对丫链组成( a m ) ，约占血红蛋白总 量的o 5 。 糖化血红蛋白的形成是由于h b 分子中潜在的糖基化位点( p 链氨基末端、a 链 和赖氨酸残基末端) 与碳水化合物( 主要为葡萄糖) 经非酶促结合而成，其合成过程 是缓慢而且不可逆的，不受血糖浓度暂时波动的影响。因此， n ) a 可分为未被糖基 化部分( h b a 0 ) 和含糖基化部分( h b a l ) 。h b a l 包括h b a l a l 、h b a l a 2 、m a i b 、 h b a l c 等，其中h b a l c 是主要形式，约占8 0 【9 ，10 1 。国际临床化学联合会( i n t e m a t i o n a l f e d e r a t i o no f c l i n i c a ic h e m i s t 巧，i f c c ) 把h b a l c 定义为h b a 0 一条或两条d 链氨基 末端与葡萄糖形成的稳定、不可逆的的四聚体加成化合物( n 1 脱氧果糖基h b ) 【1 1 1 ， 其糖基化反应分两步：首先葡萄糖羰基与h b 的d 链氨基末端缬氨酸残基的自由氨基 缩合，生成不稳定醛亚胺即希夫式碱( s c h i 行b a s e ，前h b a l c ) ，此反应可逆；第二步 醛亚胺经不可逆的a m a d o r i 重排形成稳定的酮胺，即糖化产物【1 2 j 。 h c = o i h c o h i r 毗+ 帕宁h h c 洲 i h c o h l c 如o h g i u 舱 h c = 扣r 车h r n 卜r l l h e o hc = o ii 叫h o c h h o c h h 占洲石h 占伽h c 洲 朋咖酣1 h c 伽 i n 硼m g 蛐删 i h c o hh c o h il c h ，o hc h ，o h s c u 厅h 0 ek h 咖i l i e 图1 - 1 糖化血红蛋白形成反应示意图 f i g1 1 s c h 锄a t i cd i a g r 锄o fg h bf 0 册a t i o nr e a c t i o n 因为葡萄糖可自由透过红细胞，h b 可在红细胞的1 2 0 天生命期内持续糖基化，因 此糖化血红蛋白形成速率与葡萄糖浓度成正比，可反映过去2 3 个月血糖控制水平， 其含量和平均血糖波动有直接关系。h b a l c 每增加1 ，平均血糖水平大约增加3 5 m d l ( 2m m o l 几) 。 1 1 2 糖化血红蛋白主要检测方法 江苏大学硕士学位论文 目前，临床实验室常用的糖化血红蛋白检测方法有离子交换法、亲和层析法、免 疫比浊法、酶法等，多采用h b a l c 占总血红蛋白的比例( ) 来表示。 1 1 2 1 离子交换法 阳离子交换层析法是以血红蛋白p 链氨基末端缬氨酸糖化后所带电荷差异为基 础，与离子交换树脂的吸附和交换能力不同而分离糖化血红蛋白。血红蛋白各组分中， h b a l a 的p i 为6 8 8 ，h b a l b 的p i 为6 9 2 ，h b a l c 的p i 为6 9 4 ，h b a o 的p i 为6 9 5 【1 4 l 。 因此在p h6 0 6 5 时，h b 均带正电荷，g h b 带正电荷较少，而非糖化h b 带正电荷 较多。采用不同p h 和离子强度的洗脱液，可将h b a l a 、h b a l b 、h b a l c 、h b a o 和 h b a 2 分别洗脱并监测，计算h b a l c 的含量。测定结果受到环境温度、缓冲液的离子 强度和p h 的影响。以离子交换树脂为固定相的h p l c 法是测定g h b 的金标准，可 发现和检测异常血红蛋白。 1 1 2 2 亲和层析法 利用糖化血红蛋白中葡萄糖的二元醇结构和硼酸盐形成可逆性结合，致使g h b 选择性地结合于交联了氨基苯硼酸的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶柱上。该法受血红蛋白 变异体和衍生物存在的干扰影响小，但样本中胎儿血红蛋白( f e t a lh 锄o g l o b i n ，h b f ) 超过2 0 会影响亲和层析【1 5 j ，且与硼酸基团结合的不完全是二元醇结构，并且二元 醇结构与硼酸基团也不是完全结合。有分析显示【1 6 】，与树脂结合的糖基化部分含有 l o 的h b a l a + b 、5 2 的h b a l c 、3 8 的h b a 0 ，未结合的非糖化部分经则含有2 6 的h b a l a + b 、6 7 的h b a 0 、7 的h b a l c 。 1 1 2 3 免疫法 采用糖化血红蛋白p 链氨基末端4 1 0 个糖基化氨基酸的单克隆抗体作为识别 位点，利用抗原抗体特异性结合反应原理，结合比色、比浊方法，以糖化蛋白为标准， 测定h b a l c 的含鼍。该法快速简单，可在自动化仪器上检测，但需要做标准曲线， 结果容易受到血红蛋白变异体h b s 和h b c 的干扰，并且任何能导致血红蛋白p 链氨 基末端前4 1 0 个氨硅酸改变的变异体都使结果；带来误差| 1 7 】。用不同物质标记抗体可 衍生出不同方法，如胶乳凝集免疫比浊法i 。8 l 、胶乳凝集抑制法、酶联免疫吸附法、放 射免疫法、荧光免疫泄：用i 离r l | i 扶法i l9 l 等。 谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用 1 1 2 4 酶法 2 0 0 4 年，h i r o k a w a 等【2 0 1 报道了联合谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶，建立酶 法分析体系来检测h b a l c 的方法，利用谷氨酰内切酶的水解特异性先将h b 水解释放 果糖基氨基酸，然后利用果糖氨基酸氧化酶氧化果糖基氨基酸产生h 2 0 2 ，在过氧化 物酶作用下使底物显色而得出h b a l c 的含量【2 。该法具有简单、快速，检测灵敏度 高等优点，维生素c ( v c ) 、清蛋白、胆红素对结果没有影响【2 2 】。在临床h b a l c 检测 中受到日益关注。 1 1 3 糖化血红蛋白检测的影响因素 1 1 3 1红细胞寿命的影响 g h b 生成与红细胞生存时间有关，任何导致红细胞寿命缩短的疾病都会降低 h b a l c 值【2 3 1 。因此，肾病、肝病、溶血性贫血、异常血红蛋白病、失血恢复期以及 地中海贫血等h b a l c 均降低。缺铁性贫血、脾切除和维生素b 1 2 缺乏时延长红细胞 生存期，再生障碍性贫血减缓红细胞生成过程，均可使h b a l c 增加【1 2 】。 1 1 3 2 常见化学衍生物以及药物的影响 氨基甲酰化和乙酰化h b 是干扰g h b 检测的最常见的化学衍生物。临床上氨基 甲酰化h b 多发生在肾功能减退和血尿素水平增多病人，氨基甲酰h b 与h b a l c 的 等电点相似，对离子交换层析法、电泳法有干扰，而对亲和层析法和酶联免疫法g h b 检测没有干扰。常规剂量乙酰水杨酸盐引起的乙酰化h b 对g h b 结果没有明显影响 1 2 钔。一些使用高剂量阿司匹林病人显示少量乙酰化h b 。杨锦云等报道维生素c 和e 可能通过抑制糖基化降低h b a l c 测定结剥2 5 2 6 1 。 1 1 3 3 不稳定h b a l c 干扰 不稳定的h b a l c 即糖基化反应第一步生成的不稳定醛亚胺结构( 希夫氏碱) 产物， 也称为p r e a l c ，正常约含0 3 1 2 7 1 。其所带电荷与h b a l c 相近，干扰离子交换树脂 法检测h b a l c 。c a m a 唱。等例研究发现不稳定的h b a l c 可使离子交换色谱法测定的 g h b 值比实勋：值高1 6 4 。 4 江苏大学硕士学位论文 1 1 3 4h b 变异体的影响 h b 有7 0 0 余种变异体，大多数起源于h b 的q 、p 、丫或6 链的点突变。许多新 的h b 变异体并无表型异常。临床中最常见的h b 变异体是h b f 、h b s 和h b c 。离 子交换色谱法和亲和色谱法的检测结果不易受h b f 影响，而免疫法受到h b f 的干扰 较大。h b s 对离子交换色谱法的检测结果有不同的影响取决于所使用的方法和平台。 有研究报道显示，用离子交换色谱法检测含有h b s 的样本时测定值低于硼酸盐亲和 色谱法和免疫法，而对酶法无影响【2 9 】。 1 1 3 5 储存温度对检测结果的影响 样本贮存时间延长，测定结果会逐渐升高。大多数检测方法的样本都可在7 0 低温冻干条件下保存1 年，检测结果不受影响【3 0 】。在4 时，全血样本可保存l 周， 室温条件下，全血样本只能保存数天。3 7 条件下，未经任何处理的全血样本稳定 性最差，无论何种检测方法的样本有效保存时间均小于1d 【3 1 1 。 1 1 3 6 其他 据文献报趔3 2 1 ，糖化血红蛋白测定有季节性差异。l 、2 、3 、4 、5 、l l 、1 2 月份 测定结果比9 月份高，冬季高夏季低；一年中3 4 月最高，9 1 0 月最低，h b a l c 相差大约o 2 2 。 一般认为糖化血红蛋白测定与年龄、性别、饮食等无关，但p a n i c 吲等在调查性 别、体重指数、空腹血糖、餐后2h 血糖等因素后，发现年龄每增加l 岁，h b a l c 测 定值升高0 0 3 。 不同种族问h b a l c 也存在差异，据h e m a n 等【3 4 】报道，在调整其他影响因素后， 美国白种人、西班牙裔人、亚洲裔人、印第安人的h b a l c 平均值分别为5 7 8 、5 9 3 、 6 0 0 、6 1 8 ，美国黑种人比白种人高o 4 o 7 ，不同种族间的差异程度还有待 进一步研究。 1 1 4 糖化血红蛋白检测的标准化 1 1 4 1 国际相关组织推荐的参考方法 【k i 际棚火纠i 织一f ：敛jj ：g h b 枪洲的标准化和参考方法的建屯。近年来，h b a l c 谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用 的标准化检测己在全球不断完善，仪器在出厂前就能被标准化。尤其是在2 0 0 3 年开发 了一种新的更特异的检测参照【3 5 】，不仅建立了h b a l c 检测的参考方法和高纯度的 ) a l c 参考物，同时也建立了一个参考实验室网络，促进了h b a l c 检测的标准化。 d c c t 和美国糖化血红蛋白标准化计划( n a t i o n a lg l y c o h e m o g l o b i ns t a n d a r d i z a t i o n p r o g m m ，n g s p ) 推荐阳离子交换树脂h p l c 法为参考方法。欧洲则采用瑞典的标准 化方案，应用h p l c m o n os 离子交换法，在检测中h b f 能与h b a l c 分离开来，测定值 比n g s p 约低1 1 。日本的糖尿病协会临床检验协会体系( j d s j s c c ) 标准化方法则应 用h p l c k 0 5 0 0 离子交换法，测定值比n g s p 约低o 2 【1 6 l 。目前，i f c c 建议同时报告 百分比单位和m m o l m 0 1h b ，换算公式为 n ) a l cm m o l m o l = ( h b a l c 2 1 5 ) 1 0 9 2 9 1 3 6 j 。 由于糖化血红蛋白的检测方法较多且相互之间无可比性，也没有可溯源的参考体 系，所以l f c c 工作组发表了全球h b a l c 的标准化测定共识，推荐了全球h b a l c 测定的 参考方法。该法利用谷氨酰内切酶在醋酸铵或碳酸氢铵缓冲液中能特异性地水解h b 肽链中谷氨酸残基，将h b 水解成糖基化六肽和非糖基化六肽，然后通过h p l c 和电喷 射离子化质谱或使用h p l c 二维法和紫外测定的毛细管电泳进行分离和定量，通过测 定糖基化六肽与非糖基化六肽的比率作为h b a l c 值，同时应用高纯度的h b a l c ( h b a l c 9 8 5 ) 和h b a 0 ( h b a 0 9 9 5 ) 混合液作为标准溶液进行校准1 3 7 3 引。该方 法能统一各实验室之间的结果，改进结果的准确性和可靠性，但该法操作费时成本高， 不能批量测定，仪器昂贵，需标准品做标准曲线，目前只适用于标准化。 1 1 4 22 0 l o 年全球h b a l c 标准化测定共识 2 0 1 0 年，美国糖尿病协会、欧洲糖尿病研究协会、国际糖尿病联盟、国际儿童 和青少年糖尿病协会( i n t e m “o n a ls o c i e t yo fp e d i a 仃i c 锄da d o l e s c e n td i a b e t e s ， i s p a d ) 及i f c c 共同发表了2 0 l o 年全球h b a l c 测定标准化共识1 3 7 】。内容包括： h b a l c 的检测必须在世界范围内标准化，包括参考系统和结果报告；i f c c 的参 考系统是唯一能够满足标准化要求的方法；将来h b a l c 以国际统一单位i f c c 单位 ( m m o l m 0 1 ) 以及衍生的n g s p 单位( ) 报告，使用i f c c n g s p 换算公式： 要确保基层糖尿病中心容易获得国际统一单位( i f c c ) 和n g s p 单位的转换公式； 杂志编辑和出版物建议采用国际统一单位i f c c 和n g s p d c c t 双重单位报告 h b a l c ；以h b a l c 表示糖化血红蛋白，在指南或教育材料中也可以简写为a l c 。 6 江苏大学硕士学位论文 1 2 谷氨酰内切酶的研究现状 1 2 1谷氨酰内切酶的来源及结构 谷氨酰内切酶( g l u t a m y le n d 叩r o t e i n a s e ，e c3 4 2 1 1 9 ) 属于丝氨酸蛋白酶，具有 严格的底物特异性，能水解多肽链中谷氨酸和( 或) 天冬氨酸残基的a 羧基形成的肽 键【3 9 l ，主要来自于金黄色葡萄球菌v 8 菌株，故又称为金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶 ( & 印厅y d c d c c 淞口“陀淞v 8p r o t e a s e ) 、g 1 u v 8 或g l u c 。除金黄色葡萄球菌v 8 菌 株外，从芽胞杆菌h 1 ，4 羽、链霉菌和放线菌 4 3 j 、葡萄球菌属中的表皮葡萄球菌j 和华纳 葡萄球菌【4 5 】以及金黄色葡萄球菌标准菌株a t c c 2 5 9 2 3 和a t c c l 2 6 0 0 【蜘也可获得该 酶。 通过对克隆基因的核苷酸序列分析，金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶的完整氨基酸序列 已经清楚，其蛋白编码区由3 3 6 个氨基酸组成，包括由6 8 个氨基酸残基组成的前肽和由 2 6 8 个氨基酸残基组成的成熟部分。氨基酸序列中富含谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，未 发现半胱氨酸残基。成熟部分氨基酸序列的c 端尾部含有由5 2 个氨基酸残基组成的1 2 个重复折叠的三肽结构( p r 0 ，a s p 和a s n ) ，在第7 个重复折叠中g l u 占据了a s n 位置， 这些特殊的重叠结构的功能至今尚未阐明，推测在酶从无活性形式转为活性形式时起 着一定作用【4 5 4 7 1 。 n e m o t 0 等【删发现来源于表皮葡萄球菌的谷氨酰内切酶含有2 8 2 个氨基酸，前肽和成 熟部分分别为6 6 个和2 1 6 个氨基酸，但c 端没有重复序列；华纳葡萄球菌的谷氨酰内切 酶则由31 6 个氨基酸组成，在它的c 端有一富含天冬氨酸和天冬酰胺的氨基酸区域。 s v e n d s e n 等【4 8 j 报道地衣芽胞杆菌( 肋c 讲淞肠办p 砷白，聊西) 的谷氨酰内切酶在n 端有2 2 0 个氨基酸与金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶相似，其中有5 8 个氨基酸位置完全一致，来自灰 色链霉菌( 勋印，d ，1 ) 栊，g ，括p 淞) 的谷氨酰内切酶由1 8 8 个氨基酸组成，其序列未发现 和金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶有同源性1 4 3 1 。 但是多数谷氨酰内切酶在核苷酸和氨基酸序列上与金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶具有 一定的相似性和同源性。如来源于地衣芽胞杆菌的谷氨酰内切酶约有2 5 的氨基酸序 列等同于金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶，来源于放线菌和热普通链霉菌( 研唧，d ，缈嚣 砌p 删d v 材忉，括) 的谷氨酰内切酶祚：其n 端和金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶仃同源关系【4 9 1 。 m i i i g o t i n a 等1 5 0 l 祚：比较了金黄色俪恂球蒲v 8 蛋r i 酶和】e 他丝氨酸蛋白酶的氨j 走唆序列 谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用 后，构建了谷氨酰内切酶族的进化树，分化成3 个进化枝，进化枝i 包括产表皮剥脱毒 素a 金黄色葡萄球菌( 删儿拗淞口“朋姻e t a ) 、产表皮剥脱毒素b 金黄色葡萄球 菌( & 印砂如c d c c 搬口甜陀淞e t b ) 、金黄色葡萄球菌v 8 菌株；进化枝包括放线菌属、 中间型芽胞杆菌( 砌c f 加砌砌铆甜凇) 、枯草芽胞杆菌( 砒f 跏s “6 ，妇) 、地衣芽胞 杆菌、热普通链霉菌；进化枝i i i 包括弗氏链霉菌( 勋印幻，驴甜力谢跏) 和灰色链霉菌， 金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶可被视为功能特异性有主要改变的具有特征性的单独的进化 分枝。 谷氨酰内切酶虽然属于丝氨酸蛋白酶，但氨基酸序列中无二硫键存在，而胰腺丝 氨酸蛋白酶肽链结构中至少有2 个二硫键，这是与其他哺乳类丝氨酸蛋白酶的重大区 别。尽管谷氨酰内切酶的一级结构与其他丝氨酸蛋白酶差别很大，但其空间结构却非 常相似，特别是酶的活性部分。x 衍射分析表明，谷氨酰内切酶的活性区域和胰腺丝 氨酸蛋白酶相似，都是由氨基酸三联体( h i s 、a s p 和s e r ) 成线性组成，而且活性中心 的丝氨酸残基可以被丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂苯甲基磺酰氟化物( p m s f ) 抑制【5 1 1 。 1 2 2 谷氨酰内切酶的特性 1 2 2 1 底物特异性 谷氨酰内切酶对肽链的水解有着高度的选择特异性，这种特性取决于缓冲液的种 类、p h 值、肽链潜在的水解位点结构。在p h4 o 醋酸铵缓冲液或p h7 8 碳酸氢铵缓 冲液中，谷氨酰内切酶能水解肽链谷氨酸羧基端肽键。在p h7 8 的磷酸盐缓冲液中， 它对谷氨酸羧基端和天冬氨酸羧基端肽键都能水解，但对谷氨酸的反应速率是天冬氨 酸的1 0 0 1 0 0 0 倍。如果在肽链羧基端有脯氨酸存在将不会发生水解作用【5 2 1 。 1 2 2 2 米氏常数 米氏常数( k m ) 是酶的特征性参数，不同来源的谷氨酰内切酶以及所作用的底 物不同导致k m 值存在区别。金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶以z p h e l e u g l u p n a 为底 物时，k m 为0 3 9m m o l l 【4 7 1 ；从芽胞杆菌分离出的谷氨酰内切酶以z g l u p n a 为底 物时，k m 为o 5m m o l l 1 5 引。 1 2 2 3 反应适宜p h 和温度 江苏大学硕士学位论文 不同来源的谷氨酰内切酶作用的适宜p h 存在差异。金黄色葡萄球菌v 8 蛋白酶 催化作用适宜p h 范围为3 5 9 5 ，以h b 为底物时，在p h4 o 和7 8 时酶能释放出 它的最大活力【5 2 1 。来源于地衣芽胞杆菌和放线菌的谷氨酰内切酶p h 范围分别为4 o 1 0 o 和6 o 1 0 o 。谷氨酰内切酶作用温度范围一般为2 5 3 7 ，但具有较高的热 稳定性( 4 0 6 5 ) 【4 2 1 。 1 2 2 4 激活剂和抑制剂 谷氨酰内切酶的来源不同、克隆和表达方式不同，激活剂种类也有些差异。多数 报道认为c a 2 + 对该酶有较强的激活作用，作用机制可能是c a 2 + 能增强酶的活性中心 与底物作用的亲和力，从而提高酶活性。p m s f 、二异丙基氟磷酸( d f p ) 、抑肽酶 等皆可抑制酶活性。文献报道天冬氨酸和谷氨酸盐类似物二苯基磷酸盐可抑制酶的活 性f 5 1 1 。 1 2 2 5 稳定性 谷氨酰内切酶在2 0 的有机溶剂中能保持酶的特异性和活性。d r a p e a ug r 报道【5 2 】 在0 2 s d s 中谷氨酰内切酶的活性能达1 0 0 ，在lm o l 几盐酸胍和4m o l l 尿素 中也有不同程度酶活性。 1 2