（分析化学专业论文）dna与生物小分子相互作用的研究.pdf

硕 研究生学位论文d 与生物小分7 ：相互作用的研究 摘要 d n a 是生物体遗传信息的载体，具有存储和传递信息的功能。对d n a 的研 究是生命科学研究中一个极其重要的方面。d n a 是大多数抗癌，抗病毒试剂在 体内的主要靶向分子，而所有细胞和病毒中都含有d n a ，d n a 在生物遗传中具 有特殊功能，能否行使正常的遗传功能依赖于与其他分子的物理、化学相互作用。 小分子物质与d n a 的作用，会影响到d n a 的生理和物理化学性质，改变 d n a 的转录和复制。因此，研究小分子物质与d n a 的相互作用有助予人们对 d n a 与小分子物质、蛋白质相互作用方式的了解，并且对一些致癌化合物的致 癌机理，抗癌药物的药理和毒性，以及新型药物的设计合成方面都有很大的意义。 在医药研究中，d n a 与靶向分子相互作用的研究不仅对阐述一些抗肿瘤抗病 毒药物及致癌物的作用机理，而且对进一步指导人工核酸的合成及d n a 高级结 构的研究具有重要意义。 目前有很多方法应用于实验室研究d n a 与其他物质的相互作用，比如：凝 胶电泳分析，核磁共振，电化学分析、d n a 足印分析，荧光分析，紫外可见光 谱分析以及黏度分析等。 基于上述事实和观点，本文中首先对近年来人们关于具有生物活性的物质和 d n a 相互作用的研究进行了概述和总结，然后研究了槲皮素与d n a 的相互作 用，并对灿烂甲酚蓝的电子转移机理和灿烂甲酚蓝与d n a 的相互作用进行了研 究具体叙述如下： 第一部分：绪论 d n a 的电化学研究已经成为生物电化学的一个非常有生命力的研究领域。 本部分主要综述t d n a 的电化学研究进展，d n a 与其他靶向分子的相互作用以 及d n a 修饰电极的剑备及应用，包括修饰电极的理论和研究方法及在分析化学 中的应用。确立了课题的立论依据，阐述了小分子与d n a 相互作用在生物分子 化学中的重要理论和实际意义。 第二部分：d n a 与槲皮素相互作用的电化学研究 采用表面化学的方法，即用d n a 修饰电极来研究槲皮素与d n a 在微观条 件下的相互作用，力图从分子水平探讨槲皮素与d n a 的作用方式。采用循环伏 安法、交流阻抗法、扫描电化学显微镜对其作用模式进行了验证，证实槲皮素与 研究生：陈仪娜 指导教师：卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 研究方向：电分析化学 硕士研究生学位论文o r 与生物小分子相互作用的研究 d n a 以嵌插方式相结合，并且得到了氧化还原探针在膜上的电荷转移速率常数。 第三部分：灿烂甲酚蓝的电化学性质及其与d n a 相互作用的研究 用循环伏安法研究了b c b 在裸玻碳电极上的电化学行为。发现，b c b 有两 对很好的氧化还原峰，并且推断出，b c b 在裸玻碳电极上是两个一电子一质子 氧化还原过程。 此外，借助循环伏安法、s e c m 法、e i s 法、紫外可见光谱法以及黏度法研 究了d n a 与b c b 的相互作用实验发现，带正电的b c b 与带负电的d n a 磷 酸基团以静电模式结合，键合常数为2 9 7 x 1 0 m - 1 关磨i 蟊o n a ：槲皮素：灿烂甲酚蓝；相互作用 研究隹：陈仪娜 指导教师：卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 研究方向：电分析化学 颈e 研究生学位论文d n a 与生物小分子相互作用的研究 a b s t r a c t d n ai st h ec a r r i e ro fg e n e t i ci n f o r m a t i o na n dp l a y sa l le s p e c i a l l yi m p o r t a n tr o l e i nt h eo d u i o fg e n e t i c i n v e s t i g a t i o no fd n ai si m p o r t a n ti nt h el i f es c i e n c e sf i e l d d n ai st h em a i nt a r g e tm o l e c u l et h a te x i s t si na n t i e a n e e ra n da n t i v i r a lt h e r a p i e s a l l c e l la n dv i r u sc a r r yd n a n o r m a lh e r e d i t yf u n c t i o no fd n a d e p e n d s o nt h ep h y s i c a l a n dc h e m i c a li n t e r a c t i o no f o t h e rm o l e c u l e sw i t hd n a i n t e r a c t i o no fd n aw i t hs m a l lm o l e c u l e s ，a f f e c t e dp h y s i o l o g i c a la n dp h y s i c a l c h e m i c a lc h a r a c t e ro fd n aa n dc h a n g e dt h et r a n s f e ra n dc o p yo fd n a h e n c ei ti s m e a n i n g t h a ti n t e r a c t i o n so fs m a l lm o l e c u l e sw i t hd n aa r ei n v e s t i g a t e dt ou n d e r s t a n d b i n do fd n aw i t hp r o t e i n ，a n t i c a n c e rm e c h a n i s ma n dt od e s i g na n ds y n t h e s i z en e w d r u g i nm e d i c a m e n t , i tp o s s i b l et of o r e s e em a j o rs t e p sf o r w a r di no u ru n d e r s t a n d i n g o ft h em o l e c u l a rb a s i so fd i s e a s e , b o t hf r o ma t t a c kb ye x t e r n a lp a t h o g e n sa n d i n t e m a l l yf r o mv a r i a t i o n sw i t h i nt h eh u m a ng e n o m er e s u l t i n gi nap l e t h o r ao fn e w m o l e c u l a rt h e r a p e u t i ct a r g e t sf o rd r u gd e s i g na n dd i s c o v e r y a v a r i e t yo ft e c h n i q u e sf r o mm o l e c u l a rb i o l o g yh a v eb e e nu s e di nr e s e a r c h l a b o r a t o r i e st os t u d yt h ee f f e c t so fd n a b i n d i n gs m a l lm o l e c u l e s , s u c ha t ；t h eg e l m o b i l i t ys h i f ta s s a y , 1 hn m r , e l e c t r o c h e m i s t r ya n a l y s i s d n af o o t p r i n t i n ga s s a y , a n df l u o r e s c e n c e - b a s e da s s a y s ，u v - v i ss p e c t r u ma n dv i s c o m e t r y t h ef w s tp a r t ：g e n e r a li n t r o d u c t i o na n dc o n c l u s i o n i nt h i sp a r t ，t h ed e v e l o p m e n ti nt h es t u d i e so fd n a , i n c l u d i n gs t u r c t u r eo fd n a , i n t e r a c t i o no fd n aw i t ho t h e rm a t t e ra n dt h em o t h o d sa b o u ti n t e r a c t i o no fd n aa n d s m a l lm o l e c u l ea r er e v i e w d t h ei m p o r t a n tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c eo f t h er e s e a r c ho ft h ei n t e r a c t i o no fd n aa n db i o a c t i v em o l e c u l e si nb i o c h e m i s t r ya l e d i s c u s s e d t h es e c o n dp a r t ：e l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e so ft h ei n t e r a c t i o no fq u e r c e t i nw i t hd n a i nt h i sp a r tw es t u d i e dt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro f q u e r c e t i ni n t e r a c t i o nw i t h d n a b ys e c ma n de i s t h ei n t e r a c t i o nh a sd i f f e r e n te l e c t r o c h e m i c a li n f o r m a t i o n o u e r c e t i nc a ni n t e r c a l a t ed n aa n df o r mak i n d o fe l e c t r o c h e m i c a li n a c t i v e s u p r a m o l e c u l a rc o m p l e x t h ec h a r g e t r a n s f e r r a t ec o n s t a n tf o rt h e 研究生：陈仪娜 指导教师；卢小泉教授，康敬万教授 专业：分析化学 i i i 研究方向：电分析化学 硕士研究生学位论文蜊 与生物小分子相互作用的研究 k 3 f c ( c n ) 6 i f c ( c n ) 6c o u p l ew a so b t a i n e d t h er e s u l t sp r o v i d en e wi n s i g h ti n t o r a t i o n a ld r u g sd e s i g na n dw o u l dl e a d 憾t of u r t h e ru n d e r s t a n d i n gt h ei n f o r m a t i o no f i n t e r a c t i o nb e t w e e na n t i c a n c e rd r u g sa n dd n a t h et h 硼p a n ：e l e c t r o c h e m i c a l s p e c t r a la n dv i s c o m e t r i cs t u d i e so ft h ei n t e r a c t i o no f b r i l l i a n tc r y s t a lb l u ew i t hd n a f r o mr e s u l t sp r e s e n t e di nt h i sp a r t ，w ec o n f i r mt h a ti nb u f f e rs o l u t i o nb c b u n d e r g o e st w os i n g l ee l e c t r o nr a d o xp r o c e s s e si n v o l v i n gt w op r o t o n sr e s u l t i n gi n r e d o xo f3 - a m i d o g e na n d6 一n i t r o g e n a l s o ，t h er e s u l t sf r o mt h ev a r i o u se x p e r i m e n t s s h o wt h a tb c bc a l lb i n dw i t hd n a b ye l e c t r o s t a t i cm o d e i na d d i t i o n ，t h ea p p a r e n t r a t ec o n s t a n to ft h er e d o xa c t i v ep r o b ei ns o l u t i o nw e r eo b t a i n e ds i m u l t a n e o u s l y t h e r e s u l t sp r o v i d en e wi n s i g h ti n t or a t i o n a ld y e sd e s i g na n dw o u l dl e a du st of u r t h e r u n d e r s t a n d i n go ft h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e nd y e sa n dd n a a n da p p l i c a t i o n i nt h ec h e m i s t r y ，i a t m l o g ya n d b i o l o g yk i n g d o m k e y w o r d s ：d n a , o u e r c e t i n ，b r i l l i a n tc r y s t a lb l u e ，i n t e r a c t i o n 研究生：陈仪娜 指导教师：卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 研究方向：电分析化学 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：监垡塑日期唑冱! l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：竖! 墨煎导师签名： 硕i ：研究生学位论文i ) n a 与生物小分子相互作用的研究 第一章绪论 1 1 研究背景 自1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 创立生物遗传分子脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺旋 结构f 1 】，建立生物遗传基因的分子机理以来，如何充分利用新序列信息资源成 为生命科学工作者的共同课题。基因控制着人类生命的生老病死过程，随着对基 因与癌症及其它与基因有关病症的了解，在分子水平上检测易感物种及基因突 变，对于疾病的治疗及预后也有着重要的意义，并可望实现对疾病的早期诊断乃 至超前诊断。 d n a 与小分子化合物的相互作用是生物化学和分子生物学中的重大研究课 题，在医学研究和新药设计中，为了寻求符合要求的d n a 靶向分子，必须详尽 地了解d n a 与靶向分子的相互作用。它对于理解生命过程及在疾病研究中都具 有深远意义。影响d n a 靶向分子与d n a 相互作用的因素很多，最重要的是分 子结构。因此，探讨d n a 靶向分子的结构与其对d n a 的识别模式和其生物活 性之问的关系，对于设计具有特定功能的d n a 靶向分子至关重要，它可指导新 药物的合成及体外筛选工作。合成出既具有高度专一性，又能按照人们预先设计 的位点切割d n a 的人工核酸酶，对于基因分离、大片断基因序列分析以及肿瘤 基因治疗等方面的研究将有助于理解一些生命过程的机理，阐明d n a 高级结构 的生物学意义。 1 2 研究意义 小分子化合物与生物大分子d n a 特异性的定位结合，在基因表达的调控过 程及许多小分子化合物的体内作用方式的研究中非常重要，越来越多的工作证实 了相当数量化合物的活性及毒性与d n a 的选择性作用有关，它们对d n a 的分 子识别作用及其与d n a 所形成的复合物的结构、构象分析，尤其是在三维空问 结构上互补性的研究，已经成为评价其活性、毒性的重要组成部分，也是当前的 研究热点。 以核酸为靶向分子的药物设计则起步较晚，在对核酸的研究中，探讨小分子 化合物与d n a 的作用模式长期以来一直是各国科学家极感兴趣的课题之一，因 为它能够对d n a 的结构和功能、蛋白质和d n a 的相互作用，药物的机理和研 制等许多问题作出合理而有效的解释，为新型高效药物的设计提供指导性信息。 研究生：陈仪娜 指导教师；卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 研究方向；电分析化学 硕士研究生学位论立d n a 与生物小分子相互作用的研究 1 3 研究概况 1 3 i d n a 的结构i “m 】 核苷酸是核苷的磷酸酯，其基本重复单位是核苷酸，即核苷的磷酸酯。核苷 酸主要由碱基、戊塘及磷酸三部分组成。在d n a 中含有四种主要碱基，即腺嘌 呤( a d e n i n e ) 、鸟嘌呤( g u a n i n e ) 、胞嘧啶( c y t o s i n e ) 和胸腺嘧啶( t h y m i n e ) 。 双链d n a 中a 与t 以及c 与g 之间碱基互补配对，因此a = t ，g = c 。d n a 的组成可分为三级结构。它的长条核 苷酸序列为一级构造，是由核苷酸通 过3 ，5 磷酸二酯键连接而成的。 d n a 的二级结构指d n a 分子的空 间结构，即三维空间的结构。1 9 5 3 年， j a m ew a t s o n 和f r a n c i sc r i c k 通过x 射线衍射实验研究解析了d n a 的双 螺旋结构。双螺旋分子呈不对称扭曲， 因而产生有大沟区及小沟区。d n a 的 三级结构是指双螺旋链的扭曲，包括 多重螺旋，分子内单链形成的环等。 噩1 1d n a 辨一凝结构朋( 左) 和= 蜢结构墨( 右) 1 3 2d n a 与不同靶向物质的相互作用 1 3 2 1 靶向物质的种类 1 金属配合物 金属配合物能对d n a 链上的某些位点进行特异性剪切。有关这方面的研究 进展文献l 锚l 有详尽论述。 铂配合物 自从6 0 年代r o s e n b e r g l 9 l 发现顺二氯二氨合铂( ) 的抗癌活性以来，有关 顺铂及其具有类似结构的平面四边形铂配合物的抗癌活性研究一直非常活跃 【1 0 ，1 1 j 。大量的研究表明，这类药物的抗癌活性与其能和d n a 链共价结合并导致 d n a 结构变化的能力密切相关1 1 2 , t 3 1 金属卟啉配合物 金属卟啉是类广泛存在于自然界中的生物活性物质。对铜卟啉的研究表明 研究生：陈仪娜 指导教师二卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 2 研究方向：电分析化学 t。j m，。1 硕f + 研究生学位论文 d n 与生物小分子相臣作用的研究 0 4 1 ，c u ( p 难 e ) 可能主要靠卟啉中带正电荷的毗啶基与d n a 上带负电荷的磷 酸基团通过静电作用结合。c u t m y p 和c h ( n a c n ) 则分别主要通过嵌入和沟 槽作用与d n a 结合。现在，虽然已有很多有关卟啉一d n a 之间相互作用的研究， 但不同结合模式与其生物活性问的关系尚未阐明，因此探讨在生物体内具有最佳 活性的作用模式是十分重要的。 稀土离子、过渡金属离子及其配合物 一些金属离子，特别是一些过渡金属离子，它们能与d n a 发生缔合作用， 使某些d n a 的结构发生改变【“，埘。v o j t a l l 刀等的研究发现，c 0 0 n h 3 ) 6 3 + 等离子的 正电荷可以使d n a 集结，浓缩，并进一步产生沉淀。但如果在溶液中存在n a + ， m 9 2 + 等一价或二价离子时，就可以抑制d n a 的集结。 2 抗生素类 蒽环类抗生素 蒽环类抗生素是一类研究的比较多的抗癌抗生素。其共同结构特征是含有一 个由3 个共平面的六元环所组成的氢并四醌发色团。关于阿霉素( a d r i a m y c i n ， a d m ) 的生物活性机理研究迄今由两种观点：一种认为阿霉素直接与d n a 相互 作用( 嵌插结合) 而导致d n a 复制及转录过程的抑制；另一种观点则认为阿霉 素能诱导氧自由基的形成，从而导致对d n a 的切割【1 s t l 9 l 。道诺霉素( d a u n o m y c i n ， d n m ) 通过嵌插方式与d n a 结合。它在d s d n a 修饰电极上的峰电位比在s s d n a 修饰电极上的有明显正移，两者的峰电位相差约3 4 m v ，这说明道诺霉素与 d s d n a 和s s d n a 的相互作用方式有所区别l 冽。柔红霉素( d a u n o r u b i c i n ，d n r ) ， 和阿霉素一样，芳环部分可嵌入d n a 碱基对之剐2 1 1 。 烯二炔类抗生素 烯二炔是一类在临床和理论研究中都有很大价值的抗癌抗生素，这类抗生素 结构上的独特之处在于其分子中含有一个张力比较大的烯二炔环，一个能与 d n a 接近的引导系统，另外有激发系统以激发并启动反应【矧。 乙撑亚胺类抗生素( 氨丙啶类抗生素) 乙撑亚胺类抗生素是一类非常重要的烷化剂，丝裂霉素c ( m i t o m y c i i nc ， m c ) 作为临床上常用的抗肿瘤剂，是这类化合物的代表。研究表明，m c 所具 有的抗肿瘤能力及强细胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力有关。m c 在 与d n a 结合之前，必须经过还原活化过程，活化后的m c 先与d n a 结合使之 研究生：陈仪娜 指导教师；卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 研究方向：电分析化学 硕 研究生学位论文d n a 与生物小分子相互作用的研究 单烷基化，然后产生双烷基化产物。m c 在单烷基化d n a 时具有高度的序列选 择性，即有限与5 c g 和5 g g 序列上的鸟嘌呤结合。丝裂霉素c 的还原以及形 成与d n a 的亲核中心共价反应的机理研究已经证明，这个抗生素紧紧地结合在 d n a 的大沟区 2 3 , 2 4 1 。 多肽及蛋白质类抗生素 博莱霉素( b l c o m y c i a ，b l m ) 在f c 或c u 等具有氧化还原活性的金属离子 与氧同时存在的条件下，对d n a 的单链及双链进行切割2 5 矧。h i g hm o b i l i t yg r o u p ( h m g ) 是一类分子量比较小的酸性非组蛋白质，研究表明h m g 主要通过沟 槽作用在d n a 小沟区富含a t 碱基的部位结合i 卅。 其他种类的抗生素 纺锤霉素( n e t r o p s i n ) 是一种抗病毒物质，结合到d n a 双螺旋的a a t r 中 心，并取代了游离寡聚核苷酸区域中的水和骨架部分i 矧。此外还有氨茴霉素、茅 屋霉素、西伯利亚霉素以及新乳霉素a 和b 偏端霉素等，均有与d n a 相互作用 的相关文献报道 2 9 , - 1 。 3 烷化剂 烷化剂即烃化剂，具有平面结构的多环芳烃分子主要以嵌插方式键合d n a ， 它作用于d n a 分子碱基对，在碱基对之间相对滑动，对d n a 产生作用。含氮 原子的平面杂环分子，由于分子结构和荷电性的差异，对d n a 的作用也不同， 同分异构体或旋光异构体的作用也有差异。 4 有机染料 早在一个世纪以前，人们就发现微生物的细胞核可与碱性染料结合显色，便 于在显微镜下观察。由于染料往往具有氧化还原活性，有机染料与d n a 的作用 便成为电化学研究的一个重要课题。 蒽醌类染料 l i l 3 1 3 2 l 等使用了悬汞电极和化学修饰玻碳电极研究了9 ，1 0 氮基荩醌 ( a n t h r a q u i n o n e ，a o ) 与d n a 的相互作用。在悬汞电极上的研究表明中性和 酸性环境重，a q 与d n a 作用后生成非电活性的配合物，导致a 0 的电流减小， l i 等使用计算金属配合物结合常数结合比的公式，求出d n a 与a 0 的结合比为 2 。但在碱性环境重，a o 与d n a 作用后电流增大，电流增大与试剂的加入顺序 研究生：陈仪娜专业：分析化学4 指导教师：卢小泉教授，康敬万教授研究方向：电分析化学 硕士研究生学位论文 蜊 与生物小分子相互作用的研究 有关，呈现明显的催化电流的特征，因此作者推测电流增大的原因是d n a 催化 了a o 的还原引起的。在a o 修饰的玻碳电极【，2 1 上，d n a 与a 0 在中性和酸性 环境作用后导致化学修饰电极的氧化峰和还原峰的电流均减小，峰电位不变，在 碱性环境中，化学修饰电极的峰电位负移了2 0 0 m v ，且氧化峰和还原峰电流均 增大，对照静汞电极的研究，说明了d n a 对a q 的还原具有双向的催化活性。 吩噻嗪类染料 吩噻嗪类染料包括亚甲基蓝( m e t h y l c b l u e ，m b ) 、甲苯胺蓝( t o l u i d i n e b l u e ，t a ) 和硫堇( t h i o n i n e ) 等。m b 是一种常用的核酸染色剂。早期对m b 与 d n a 作用的光度法研究认为m b 与d n a 通过嵌插作用结合1 埘。k e l l e y 【3 4 j 等采 用含有1 5 个碱基的巯基衍生化寡聚核苷酸固定在金电极表面研究m b 与d n a 的嵌入作用。通过计时库仑数据计算得到m b 和表面固定的d n a 亲和常数为 3 8 x 1 0 6 ( m o l f l ) 1 ，结合位点数为1 5 碱基的d n a 链结合1 5 个m b 。z h a o t j 等使 用循环伏安和光谱法研究了环糊精存在条件下m b 与d n a 的相互作用。m b 可 能与d n a 形成1 ：1 的结合物，且其结合常数为1 3 x l o s ( m o l l ) k 亚甲基蓝与环 糊精之间形成了1 ：1 的包络物，且其包络常数为4 4 x 1 0 s ( m o l l ) 1 包络物仍能 与d n a 形成1 ：l 的结合物，其结合常数为7 2 x 1 0 4 ( m o l i j ，略小于m b 单独 与d n a 作用时的结合常数。该实验证明了d n a 与m b 主要通过静电作用模式 结合。 e r d c m t 3 6 l 等发现m b 在单链d n a 修饰碳糊电极( s s d n a c p e ) 上的电流要比 杂交后电极大。y a n g 等用含有不同数目的鸟嘌呤( g ) 碱基的2 1 链的寡聚核苷酸 研究了m b 和d n a 的相互作用。他们发现m b 在探针修饰电极上的电流与g 碱 基的数量成正比，推测m b 主要与d n a 的g 碱基结合。m b 可以有效的区分单 链和双链d n a ，因此常被用作d n a 的杂交指示剂 3 6 - 3 9 1 。 由于m b 具有良好的电化学活性，赵发琼l 删等以m b 为探针，研究了阴离 子、阳离子和非离子表面活性剂与电极表面固定的巯基化d n a 的相互作用。集 中表面活性剂均可通过疏水和静电作用与固定在电极表面的d n a 分子结合，改 变电极表面d n a 的状态，进而影响电活性小分子的电化学行为。阴离子表面活 性剂与d n a 之间以静电排斥为主，也有部分疏水性结合，它使m b 的氧化还原 峰的电流减小。阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化 铵均在一定浓度范围内对m b 的电化学响应有增敏作用，而溴代十六烷基吡啶、 溴代十八烷基吡啶表现出抑制效应，它们与d n a 问有疏水性作用，也有静电吸 研究生：陈仪娜 指导教师；卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 5 研究方向：电分析化学 硕l 研究生学位论文d n a 与生物小分子相互作用的研究 引。非离子表面活性剂与d n a 的结合较弱，其主要是通过改变溶液的性质( 如 黏度、极性和介电常数等) 影响d n a 的构象，从而导致m b 电化学参数的微弱 变化。此外，表面活性剂疏水链的长短及极性头基的大小对作用过程也有一定影 响。 焦奎掣4 1 l 用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了在p h 6 0 的b r 缓冲溶液 中t b 与d n a 的相互作用。t b 在玻碳电极上有一对可逆性良好的氧化还原峰。 加入d n a 后氧化还原峰电流明显降低，氧化峰电位负移。t b d n a 结合反应前 后的电化学参数如电极反应电子数、电子转移系数和电极反应标准速率常数基本 没有发生变化，说明t b 与d n a 结合发应生成了一种非电活性的复合物，而使 t b 的峰电流下降。求得两者的结合比为1 ：1 ，结合常数为7 5 0 ) 1 0 4 。 冶保献【4 2 肄用光谱电化学和电化学技术研究了硫堇与d n a 相互作用的电化 学和光谱电化学性质，发现d n a 与硫堇作用后电流减小，而通过卵磷脂固定于 电极表面的硫堇冶可与d n a 作用，但是电流减小的比例远小于硫堇与溶液中 d n a 的结合，说明硫堇能插入d n a 双螺旋结构内部。杜江燕【4 3 l 等用电化学和 光谱法研究了溶液p h 对硫堇与d n a 的相互作用的方式的影响。电化学测量结 果表明，在p h 7 2 的磷酸盐缓冲溶液中，硫堇与d n a 的作用方式以嵌插为主。 从以上研究可以看出，本类染料与d n a 主要通过静电作用或嵌插作用结合 菲啶和吖啶类 吖啶类和菲啶类染料均与d n a 通过嵌插作用结合。溴化乙锭( e b ) 属于菲啶 类染料，它可能是最典型的与d n a 通过嵌插作用结合的染料，已经有光谱、黏 度等方法对e b 和d n a 结合的性质进行过研究。吖啶类染料中研究较多的是吖 啶橙( a o ) 。1 勰g 【4 4 1 柱端射壁电化学检测系统研究了e b 和d n a 的相互作用。在 e b 与不同浓度的d n a 结合后，用孔径0 4 5 u r n 聚四氟乙烯( p 吧) 膜将e b 与 d n a 、e b d n a 分离。他们以在n a o h 溶液中预活化的玻碳电极为工作电极， 检测e b 的平衡浓度。e b 初始浓度在1 0 0 2 5 u m o i l 之间时，测得d n a 与e b 的表观结合常数为1 7 x 1 0 s ( m o l l ) 1 该结果与其他方法所测结合常数一致。而徐 舂1 4 5 j 等以1 - ( 3 二甲氨基丙基 3 乙基碳二亚胺( e d c ) 为偶联活化剂，将e b 标记 于探针d n a 上，成功实现对靶序列d n a 片断进行识别和测定。 g h e 咄i 等使用悬汞电极研究了双链d n a 、单链d n a 和超螺旋d n a 与 e b 、a o 的作用。e b 与双链d n a 通过嵌插作用结合后，双链d n a 的链的局部 变性，导致双链d n a 在1 2 v 峰轻微增大，而双链d n a 在1 4 v 的峰电流减小。 研究生：陈仪娜 指导教师：卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 6 研究方向：电分析化学 颐t 。研究生学位论文d n 与生物小分子相互作用的研究 e b 与单链d n a 作用后，虽然没有嵌插作用，但会导致单链d n a 的磷酸二酯骨 架的重定向。e b 与超螺旋d n a 作用后，超螺旋d n a 在1 4 v 出现一个新峰， 这是由于缠绕紧密的超螺旋d n a 出现一个易还原“自由端”引起的。低浓度a o 与双链d n a 作用结果和e b 类似，高浓度的a o 嵌插入双链d n a 后会在- 0 4 4 v 啦现一个新峰。a o 与单链d n a 通过静电作用结合在- 0 3 9 v 出现一个新峰。a o 与超螺旋作用后仅在0 4 4 v 出现一个新峰。 咪唑类 w a n 扩】等综合使用循环伏安法、计时库仑法、整体电解法和扫描电化学显 微镜研究了h o e s t 3 3 2 5 8 不可逆电化学行为及与d n a 的相互作用，并首次推导了 适用于研究不可逆电活性分子与d n a 相互作用的电化学公式通过对该公式对 实验数据的回归分析，实验发现h o e s t 3 3 2 5 8 与d n a 结合后的扩散系数减小。而 电极反应标准速率常数也减小，导致电流减小。求得h o e s t 3 3 2 5 8 与d n a 的结合 常数为2 1 x 1 0 8 ( t o o l l ) 。，每个h o e s t 3 3 2 5 8 可与4 个d n a 的碱基对结合。该文 还对h o e s t 3 3 2 5 8 的分子结构进行了模拟计算，发现它可能与d n a d 沟紧密结合。 吩嗪类、吩嗯嗪类和咯嗪类 电化学对这两类染料的相互作用研究的不多，其中吩嗪类的中性2 t ( n e u t r a l r e d ，l 、r r ) 和吩囔嗪类的耐尔蓝( n i l eb l u e ，n b ) 以及光色素( l u m i c h r o m e ，l c ) 时其中代表性的物质。 周家宏l 镐l 等使用紫外可见光谱和电化学方法研究了n r 与小牛胸腺d n a 相 互作用机理。随着溶液p h 值的改变，n r 与d n a 之间相互作用的方式也随之改 变。在p h 7 0 时，二者的作用方式主要为嵌插作用，当p h = 6 0 时，二者主要的 作用方式改变为静电作用。其原因是由于n r 在p h = 7 0 的溶液中以中性分子形 式存在，而在p h 6 0 的溶液中，n r 以质子化的正离子形式存在刘殿骏【4 9 】等 用光谱法和电化学法研究了温度对n r 与d n a 相互作用的影响，在低温下和在 低浓度下，n r 嵌入d n a 的碱基内部，n r 的生色团嵌入g c 碱基对并与核酸 取螺旋的对称轴垂直，当温度升高时，部分n r 从d n a 双螺旋中脱出，嵌入的 n r 发色团的长轴转变为与d n a 双螺旋的对称轴成4 5 度角 j u 刚等研究了n b 与金电极表面固定的单链和双链d n a 的作用。n b 与双 链d n a 可通过静电作用和嵌插作用结合，而与单链d n a 通过静电结合，结合 常数分别为4 2 x l o s ( t o o l l ) 1 1 6 x 1 0 5 细o l 1 0 一，由于n b 与双链d n a 结合的更 为紧密，可以用作d n a 杂交剂。z h a o 5 1 等使用光谱和光谱电化学研究了d n a 研究生：陈仪娜 指导教师；卢小泉救授，康敬万教授 专业：分析化学 研究方向：电分析化学 预， i 研究生学位论文d n a 与生物小分子相互作用的研究 和n b 的相互作用。低浓度双链d n a 主要与n b 静电结合，生成i ：1 的配合物， 结合常数为7 0 x 1 0 4 ( m o l l ) 1 。商浓度的双链d n a 与n b 主要通过嵌插作用结合。 在高浓的d n a - n b 体系中加入环糊精，引起通过嵌插作用相结合d n a - n b 配合 物解体，因此推测是n b 的萘环嵌插入d n a 的双链之间 i b m h i m 【5 2 】等以玻碳电极和汞电极研究l c 与d n a 作用，并对比了这两种电 极的结果异同，1 - 1 2 与d n a 形成电活性较低的复合物，导致l c - d n a 在两个电 极上的电流均比l c 要小，通过d n a 滴定l c 实验，可计算出l c 与d n a 的结 合常数。同时发现，i x 3 与d n a 结合导致式电位正移。而在玻碳电极上的式电 位负移。该实验显示不同电极对同一种物质与d n a 作用的研究结果有差异。 三苯甲烷类 由于这类染料的电化学反应大多是不可逆的，电化学方法对此类染料与 d n a 相互作用的研究不多。焦奎1 5 3 1 等使用光谱和电化学方法研究了罗丹明 b ( p h o d a m i nb ，r b ) 对d n a 的识别作用。l i b 在+ 0 9 2 v 有一个不可逆的氧化 蜂，加入d n a 后由于r b 与d n a 发生识别作用，导致r b 的蜂电流降低，而蜂 电位基本没有发生改变。通过对该体系的电化学行为研究，电荷转移系数，电极 反应标准速率常数等电化学参数的变化。在加入d n a 后这些参数基本没有发生 变化，说明r b 与d n a 识别后形成了一种非电活性的复合物，导致溶液中游离 的r b 浓度降低，相应峰电流下降，计算得结合比为2 ：i 。 5 蛋白质等生物大分子 遗传基因的表达是受调控的艘l ，基因表达的调控有两条途径，第一条途径是 转录水平的调控；第二条是翻译水平的调控。目前的研究认为，调控主要发生在 转录阶段，并通过某些特定的蛋白质与d n a 相结合，即基因表达调控的基本方 式是靠调控蛋白与基因调控序列的特异结合。d n a 结合蛋白( d b p ) 与d n a 的结 合与否以及相互作用调控着基因是否转录。d n a 结合蛋白与d n a 的相互作用研 究对于基因调控机理的阐明以及一系列后基因时代与人类自身生命密切相关的 热点问题的解决具有重要意义。 1 3 2 2 作用方式 小分子化合物与d n a 结合的部位是d n a 的碱基、磷酸骨架和戊糖环。d n a 由平行堆积的碱基，聚合的阴离子磷酸骨架以及两条由核苷酸链形成的大沟、小 研究生：陈仪娜 指导教师：卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学8 研究方向：电分析化学 硕l 研究生学位论文d n 与生物小分子相互作用的研究 沟组成了药物识别的位点。主要的作用方式有3 种：非共价结合、共价结合和剪 切作用。 1 非共价结合 非共价结合包括静电结合、沟面键联和嵌插作用。 囊2 室萝喜 幽2 配台钧与d n a 忭用方式( 依次对应t 静电作用、沟面续台火沟插入小沟插入) 静电结合( s t a t m e l e c t r i f i c a t i o n ) ：即药物分子或离子与d n a 分子的带负电 荷的核糖磷酸基骨架之间的静电相互作用。一般认为，静电结合没有选择性， 文献1 5 5 j 认为，d n a 分子表面由静电力形成永化层中水分子的排列与碱基有关。 沟面键联( o r o o v cb i n d i n g ) ：即抗癌药物通过非特异性的静电作用结合到荷 负电的d n a 双螺旋外部。沟槽键联是药物分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对 边缘直接作用。大沟区，小沟区在电势麓、氢键特征、立体效应，水合作用上都 有很大不同。大分子蛋白质与d n a 在大沟结合。大多数药物则是在小沟区作用。 小沟区一般结合简单的芳香环结构，如呋喃、吡咯、苯环等，它们通过扭转自由 键两连接，从面配合小沟区的螺旋曲线，取代沟区内的水分子并与碱基对边缘通 过范德华力接触，即为其特异性。小沟区内是a 、t 富集区，药物通过与胸腺嘧 啶基c - 2 上的羰基氧( c = o ) 或腺嘌呤碱基n 3 上的氮形成氢键与 t 碱基结合。 嵌插作用( i n t e r c a l a t i o n ) ：嵌插结合是抗癌药物结构中平面或几乎平面的芳 香环嵌入d n a 分子双螺旋的碱基对，这是芳环与碱基间的r - f f 体系、偶极偶极 相互作用及疏水作用的结果嵌插结合是药物分子与d n a 相互作用的最重要的 形式之一。药物通过沟内或嵌插结合在d n a 的螺旋沟或碱基中，加上静电力的 作用，常会诱发许多生物效应，阻碍d n a 信息的正常表达。 2 共价键联( c o v a l e n tb o n d i n g ) ：共价结合的药物有亲核试剂( n h z - - n h 2 等) ， 亲电试剂则表现为d n a 的链内交联、链间交联等。共价结合的序列识别能力比 非共价结合要强得多。分子与特定碱基作用并形成加合物，使d n a 的双链解旋 研究生：陈仪娜 指导教师：卢小泉教授、康敬万教授 专业：分析化学 9 研究方向；电分析化学 顾 研究生学位论文蜊 与生物小分子相互作用的研究 且产生弯曲。 3 剪切作用 具有剪切作用的分子不但特异选择结合位点并最终使d n a 断链。 4 其他作用方式 近期研究表明，药物与d n a 相互作用形式还有雌 嵌插结合”( h a l f i n t e r c a l a t i o n ) 酬，不同于经典的结合。花青染料与双螺旋的d n a 作用时，花青 染料有不同的电荷分布，其第二杂环在d