（微生物学专业论文）bacillus+subtilis+zjutzy发酵生产γ聚谷氨酸及其絮凝特性研究.pdf

浙江工业大学硕士论文 b a c i l l u ss u b t i l i sz j u t z y 发酵生产丫聚谷氨酸 及其絮凝特性研究 摘要 1 , - p g a ( 丫聚谷氨酸) 是一种通过微生物合成的均聚氨基酸化合物， 它由谷氨酸单体以丫_ 羧基与氨基相缩合而成，是一种水溶性和可生物 降解的新型生物高分子材料，近年来由于其被作为增稠剂，保湿剂， 药物载体等而一直被广泛应用于工业领域，是一种有极大开发价值和 前景的多功能性生物制品。 本文以菌落粘度为初筛标记，从纳豆及实验室保藏菌种中筛选得到 了一株产丫- p g a 的菌株，该菌株发酵液经过有机溶剂沉淀，得到的产 物经过水解和h p l c 分析，主要成分为证明主要组分为谷氨酸。通过 形态以及生理生化性质测定，初步鉴定为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) ，进一步通过1 6 sr d n a 扩增和测序( g e n b a n k 中登录号为 e f 6 9 4 9 5 0 ) ，也证明该菌株为b a c i l l u ss u b t i l i s ，命名为z j u t z y 。 s d s p a g e 法电泳结果表明，b a c i l l u ss u b t i l i sz j u t z y 产1 , - p g a 的分子 量分布范围在4 0k d a - v l1 0k d a 之间。 利用2 。4 二硝基氟苯能和氨基发生反应并在3 5 6n l n 处有紫外吸收 的性质，建立了一种简易的检测方法，能同步测定丫聚谷氨酸的产量 和平均相对分子质量，并用于对b a c i l l u ss u b t i l i sz j u t z y 产丫聚谷氨酸 条件的单因素初筛，获得该菌株的较佳发酵条件为：甘油6 0g l ，蛋 浙江工业大学硕士论文 白胨6 0g l ，谷氨酸钠1 6 0g l ，磷酸氢二钾o 5g l ，发酵温度2 8 ， 培养基初始p h 值为6 0 ，摇床转速为2 0 0r m i n ，v p g a 产量可达到5 6 0 7 g l ，平均相对分子质量为5 9k d a 。 以c a ( o h ) 2 作为絮凝介质，得到pp g a 溶液絮凝活性的最佳絮凝 条件为：丫p g a 浓度为o 0 8g l ，体系的p h 为6 0 ，适宜温度为4 0 ， 絮凝作用4 0m i n ，不同的金属离子对1 - p g a 溶液的絮凝活性具有不同 的影响，f e ”、c 0 2 + 、m n 2 + 对絮凝作用起削弱作用，而m 9 2 + 、c a 2 + 、 k + 则对絮凝作用起到很好的促进作用，丫p g a 溶液的絮凝活性最高为 4 6 9 9 。 关键词：丫聚谷氨酸，枯草芽孢杆菌，生物絮凝剂，2 , 4 一二硝基氟苯 浙江工业大学硕士论文 s t u d yo np o l h r g u t a m i ca c i dp r o d u c e db y b a c i l l u ss 己腰刀l 酪z 儿丁t z ya n di t sf l o c c u l a t 玳g c h a r a c t e r a bs t r a c t p o l y 吖一g u t a m i ca c i d ( 丫p g a ) w a sac o m p o u n do fe q u a lp o l ya m i n o a c i dp r o d u c e db ym i c r o b e ，w a sc o n d e n s e db ys i n g l e7 - g l u t a r n i ca c i d ，a n d w a san e w b i o p o l y m e rm a t e r i a l sd u et oi t sw a t e r - s o l u b l ea n db i o d e g r a d a b l e c h a r a c t e r s r e c e n ty e a r s ，i tw a sw i d e l yu s e da sat h i c k e n e r , m o i s t u r i z i n g a g e n ta n dd r u gd e l i v e ri nt h ea r e ao fi n d u s t r y , a n dw a sam u l t i f u n c t i o n a l b i o l o g i c a lp r o d u c t sw i t hg r e a tp r o s p e c ta n dd e v e l o p m e n tv a l u e i nt h i s s t u d yan o v e lp o l y - 7 - g l u t a m i ca c i dp r o d u c i n gs t r a i nw a s i s o l a t e df r o mn a t t oa n ds t r a i n sp r e s e r v e di nl a bo nt h eb a s i so fb r o t h v i s c i d i t ya sam a r k e ro fi s o l a t i o n t h ep r o d u c to b t a i n e df r o mt h eb r o t ho f t h i sn o v e li s o l a t eb yo r g a n i cs o l v e n td e p o s i t i o na n do r i g i n a lp u r i f i c a t i o n w a si d e n t i f i e dt ob ef o r m e df r o mg l u t a m i ca c i dt h r o u g ht h ep r o c e s so f h y d r o l y z ea n dh p l c t h i si s o l a t en a m e dz t z yw a si d e n t i f i e da sa m e m b e ro ft h e g e n u s b a c i l l u ss u b n l i so nt h eb a s i so fs t a n d a r d i i i 浙江工业大学硕士论文 m o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n dn u c l e o t i d es e q u e n c e a n a l y s i so f16 sr d n a ( g e n b a n kd a t a b a s ea c c e s s i o nn u m b e re f 6 9 4 9 5 0 ) t h er e s u l to fs d s p a g es h o w e dt h a tm o l e c u l a r w e i g h to f7 - p g a w a si n t h er a n g ef r o m 4 0k d at o1 1 0k d a an e wm e t h o do fe x a m i n a t i o nw a se s t a b l i s h e du s i n gt h ec h a r a c t e ro f r e a c t i o nb e t w e e n2 ，4 - d i n i t r o f l u o r o b e n z e n ea n da m i d o ，a n da b s o r p t i o n u n d e r3 5 6n l t l ( u v ) t h i sm e t h o dc a nd e t e r m i n et h ea v e r a g eq u a l i t ya n d y i e l do fp o l y 一丫- g l u t a m i c a c i d s y n c h r o n l y t h e nt h e e f f e c t so ft h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e db ys i n g l ef a c t o rt e s t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r e ，r o t a t i o ns p e e da n di n i t i a lp hw e r e 2 8 ，2 0 0r m i na n d7 0r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mm e d i u mw a sg l y c e r i n 6 0g l ，p e p t o n e6 0g l ，g l u t a m i ca c i d16 0g l ，k 2 h p 0 40 5 g l t h e a m o u n ta n da v e r a g em o l e c u l ew e i g h to fp o l y 吖一g l u t a m i ca c i dw a s5 6 0 7 g la n d5 9 kd a ，r e s p e c t i v e l y t h ef l o c c u l a t i n g a c t i v i t yo fab i o f l o c c u l a n t sp o l y - 7 一g u t a m i ca c i d ( 丫p g a ) w e r es t u d i e du s i n gc a ( o h ) 2a sf l o c c u l a t i n gm e d i a n t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h eo p t i m u mf l o c c u l a t i n gc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w i n g ：tp g a a d d i t i o n a lc o n c e n t r a t i o no 0 8g l ，s y s t e mp h 6 0 ，t e m p e r a t u r e4 0 i tw a s f o u n dt h a tm 9 2 + c a 2 + , k + c o u l di m p r o v et h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo f t p g a h o w e v e r , f e 3 + 、c o “、m n 2 + w o u l di n h i b i tt h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo f7 p g a t h em a x i m a lf l o c c u l a t i n ge f f i c i e n c yc o u l dr e a c h4 6 9 9 i v 浙江工业大学硕士论文 k e yw o r d s ：p o l y 吖- g u t a r r f i ca c i d ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，b i o f l o c c u l a n t s ， 2 ，4 一d i n i t r o f l u o r o b e n z e n e v 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙 江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明 的法律责任。 作者签名：张豸墨日期：口子年旷月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密蹦 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 欷氲 勺日期：髫年6 月夕日 翩签名：纫踢名日期坞彩月岁日 浙江工业大学硕士论文 1 17 - p g a 的结构和性质 第一章文献综述 ，七t 时打h - ( - - n - - - d - - - 占c _ 矗占矗占0 _ 矗 1 占 胁i q 。 生物合成的p g a ( 1 - p g a ) 化学合成的p g a ( a - p g a ) 图i - i 微生物合成和化学合成的聚谷氨酸的化学结构 f i g 。1 - 1c h e m i c a ls t r u c t m c so f 7 - p g ab ym i c r o b i o l o g i c a lf o r m a t i o na n dc h e m i c a ls y n t h e s i s 1 1 27 - p g a 的性质 7 - p g a 最早发现于1 9 3 7 年【3 1 。研究人员在炭疽芽孢杆菌( b a c i l l u sa n t h r a c i s ) 与糖化菌( 及z c 删妇班缈朗舀洲瓯，) 的细胞荚膜中发现7 - p g a h i ，是某些微生物荚膜的 浙江工业大学硕士论文 主要成分之一。之后在枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 和纳豆杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) d p 也发现7 - p g a i 5 。 采用酸碱滴定法【6 】测定游离型7 - p g a 的p k a 值，得到7 - p g a 的p k a = 2 2 3 ，该 值与谷氨酸的( i t 羧基的p k a 值大体一致。7 - p g a 金属盐f n a 型) 的旋光度为一7 0 ，平 均重量分子量为1 2 3 1 0 4 。利用t g a 和d s c 进行热性质的分析 7 1 ，得出其热分 解温度为2 3 5 9 c ，熔点为2 2 3 5 c 。为了进一步研究7 - p g a 的功能，研究人员对 7 - p g a 的可溶性溶剂的研究结果表明【8 】：1 og ? - p g a 可溶于1 0 0m l 二甲基亚砜、 热的n ，n 二甲基甲酰胺、n 甲基2 毗咯烷酮。7 - p g a 酸水解后用g i t c 做衍生化 试剂，h p l c 测得7 - p g a 中d 一谷氨酸和l 谷氨酸的比值稳定在d ：l = 6 0 ：4 0 。 , - p g a 的分子量也和其他高分子一样是一个平均值。s h i h 等【9 】对7 - p g a 分子 量的控制进行了专门的研究。一般而言，由芽孢杆菌产生的7 - p g a 的平均分子量 ( m w ) 在1 0 5 8 1 0 6 之间，而多分散性在2 - - - 5 之间。t - p g a 分子量大，很难被化 学试剂修饰，从而限制了其应用。可采用碱水解、超声波降解、微生物降解或酶 降解以及改变培养基成分等方法来得到不同分子量的p g a 。 用不同菌株和不同发酵工艺生产的7 - p g a 分子量会不同，并且光学异构体比 值也有较大差异。例如在& l i c h e n i f o r m iw b l 3 的发酵培养基中，随着m n 2 十离子 浓度的增加，d 谷氨酸的含量不断增加，当m n 2 + 离子的浓度( m n s 0 4 h 2 0 ) 为0 1 3 班 时，组成t - p g a 的谷氨酸基本上为d 谷氨酸【1 0 1 。 由于在t - p g a 分子中有大量的游离的亲水性羧基，使它具有很多优良特性：可 在分子内部或分子之间形成氢键，水溶性好；对金属离子的吸附性强；优良的生 物降解性，主链上存在大量肽键，在体内环境下受酶的生物作用，会降解生成无 毒的短肽、小分子或氨基酸单体，在自然环境中，会受到微生物的作用而降解； 可食无毒；良好的生物相容性，无自身抗原性；抗冻特性；在生理功能方面可防 止细胞脱水、保护细胞免受蛋白酶的降解等f 1 1 1 4 1 。同时，1 , - p g a 在放射线照射下 会增加分子间的结合，提高吸水性能，由此可开发出一种强吸水性的生物树脂。 由于7 - p g a 易在冷水中分散，可制成水凝胶，7 - p g a 水凝胶有良好的粘弹性，并 在一定范围内具有耐高温，耐酸、碱、盐，耐渗透压，抗冻融等优良特性【1 5 】。 1 2t - p g a 的制备 2 浙江工业大学硕士论文 1 2 1 化学法合成 1 2 1 1 传统的肽合成法【1 6 】 传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这个过程一般包括基团保护、 反应物活化、偶联和脱保护。化学合成法是肽类合成的重要方法，但合成路线长、 副产物多、收率低，尤其是含2 0 个氨基酸以上的纯多肽合成。 1 2 1 2 二聚体缩聚法【1 7 】 由l g l u ，d g l u 及消旋体( d l g l u ) 反应生成a 一甲基谷氨酸，后者凝聚成谷 氨酸二聚体后，再和浓缩剂1 ( 3 二甲氨丙基) 3 乙基碳亚二胺盐酸盐及1 羟 苯基三吡咯( 1 一h y d r o x y b e l l z o tr i a o l e ) 水合物在n n 二甲基甲酰胺中发生凝聚， 获得产率为4 4 9 1 、相对分子质量为5 0 0 0 - 2 0 0 0 0 的聚谷氨酸甲基酯，经碱 性水解变成7 - p g a 。化学合成法难度很大，没有工业应用价值。 1 2 2 提取法合成【1 8 】 早期，日本生产丫- 聚谷氨酸大多采用提取法，用乙醇将纳豆( 一种日本的传统 食品) 中的p g a 分离提取出来。由于纳豆中所含的丫- 聚谷氨酸浓度甚微，且有波 动，因此，提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以大规模生产。 1 2 3 微生物发酵合成法 迄今为止的发酵生产仍处于试验室阶段，小试生产方法归纳起来主要有分批 发酵法、连续发酵法、液体两相发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法、固体发酵 法和固定化酶法等6 种，分批发酵法简单方便，容易操作和控制，因此在实验室 研究中用的较为广泛。 1 3y - p g a 的生物合成途径 7 - p g a 生物合成的机理至今尚不清楚。c r o m w i c k 等1 明通过1 3 c 标记的柠檬酸 和谷氨酸作为培养基，对7 - p g a 的生物合成进行了研究，结果表明b a c i l l u s s u b t i l i s a t c c 9 9 4 5 a 在谷氨酸培养基中，如果不添加另外的碳源，则7 - p g a 合成量很少， 添加带有1 3 c 标记的柠檬酸后，产生大量带有1 3 c 标记的7 - p g a 。这说明7 - p g a 浙江工业大学硕士论文 谷氨酸单体主要是柠檬酸和硫酸铵产生的。因此，在添加柠檬酸的培养基中，胞 内的谷氨酸是通过柠檬酸在t c a 循环产生的异柠檬酸和叶酮戊二酸合成的。另外， 在培养基中添加t c a 的中间产物如苹果酸、琥珀酸或者延胡索酸，由于糖异生的 作用，这些碳源将合成大量多糖。 由于产物中存在二种构型的谷氨酸单体，但是在多数7 - p g a 合成过程中，并 没有添加外源性d 谷氨酸，d 谷氨酸如何通过菌体代谢合成是解决7 - p g a 单体来 源的重要问题【2 0 1 。一般细菌的细胞壁含d 丙氨酸，而细菌细胞都具有丙氨酸消旋 酶，细胞质中瞬间会有d 丙氨酸存在，据此推测d 谷氨酸来自d 一转氨酶催化d 丙氨酸转氨的结果，7 - p g a 生物合成的可能途径如图1 2 所示，但这条途径并没有 今人信服的数据【2 l 】。 l 电l u + p y r u v i ca c i d i l l ：l i l l = a - k e t o g l u t a r i ca c i d + l - a l a i 呐隋n s 墨m 碉睡s 0 l卜 r 二一可= 4 浙江工业大学硕士论文 自身合成谷氨酸并将其转化为产物7 - p g a 则需要进一步研究。 1 , - p g a 合成酶是t - p g a 合成途径中的关键酶，该酶位于细胞质膜上【2 5 1 。i - p g a 合成酶是一个多酶体系，其中包括丫谷氨酰转移酶、d 和l - 氨基酸转氨酶、丙氨 酸消旋酶、谷氨酸异构酶和聚合酶，以及f a d ，n a d 等辅助因子构成。丫谷氨酰 转移酶可以将谷氨酸聚合为2 - - - 6 个单体的的谷氨酰小肽，但是不能进行高聚物的 合成。但是由于1 ，谷氨酰转移酶也具有7 - p g a 的降解活性，因此推测该酶的主要 作用是水解? - p g a 而不是合成7 - p g a 。研究结果还表吲2 6 ，2 7 1 ，枯草芽孢杆菌不能 将培养基中l - 谷氨酰多肽和d 谷氨酰多肽两种异构体合成到一条肽链中。因此判 断在7 - p g a 生产菌株中可能存在两种不同的酶系统合成? - p g a ，一种专一用来聚 合l - 谷氨酸，另一种专一用来聚合d 一谷氨酸。鉴于该酶系统中的多数酶活性极不 稳定，迄今未能将各种酶组分分离纯化。 1 47 - p g a 的应用 1 4 1 医药 聚谷氨酸在医药上的应用专利非常多，在其所有相关专利中约占5 0 ，主要 用于抗肿瘤药物的载体、靶向药物的载体、外用药物的载体和药物缓释等【2 引。 利用聚氨基酸作为药物的载体或介质，制成一定的剂型，控制药物在人体内 的释放速率，使药物按照设计的剂量，在要求的时间内按一定的速率在体内释放， 以达到有效治疗的目的。例如，红豆杉中紫杉烷类化合物，如紫杉醇( p a c l i t a x e l ， t x l ) ，具有抗肿瘤活性，但水溶性差，使药用开发受到很大限制。c e l lt h e r a p e u t i c s 公司( c t d 开发的抗肿瘤药物一聚谷氨酸紫杉醇p g t x l ( c t - 2 1 0 3 ) ，该产品用水 溶性生物可分解的聚合体载体以增加紫杉醇输送到肿瘤部位的能力，注射剂量为 1 2 0m # k g ，小鼠的p g t x l 可使肺癌细胞减少7 5 ，而只用紫杉醇( p a c l i t a x e l ) 只使肺癌细胞减少5 8 t 2 9 1 。同时p g t x l 比紫杉醇更能抗肿瘤细胞的耐药【3 0 1 。 聚谷氨酸用糖基修饰后的衍生物可作为肝细胞特殊药物的载体，把药物运输 到肝细胞内。动物静脉内给药试验表明药物和糖酯化的p g a 复合物在肝脏中有 很大积聚，起g u t 靶向作用【3 l 】。糖酯化的p g a 在肝脏中由酶作用能被迅速降解成 内源性物质谷氨酸，不会在体内产生积蓄和毒副作用【3 2 1 。 浙江工业大学硕士论文 聚谷氨酸作为生物降解型高分子，其降解产物能通过正常的新陈代谢或被机 体吸收利用或被排出体外，主要用于药物释放和送达载体及非永久性植入装置， 它除了可满足一般物理、化学性能要求外，还可满足生物相容性要求。p g a 的 医药用途还表现在它可作为外用药物的载体，p g a 与明胶有较好的兼容性，适 用制作外科及手术用的粘胶剂、止血剂及密封剂3 3 1 。 1 4 2 化妆品与日化用品 聚谷氨酸最大特点之一是保湿性极强。利用这一特性，国外已成功开发了一 种滋润肌肤效果极佳的化妆液。这种新型化妆乳液能在皮肤上形成薄膜防止水分 蒸发，这一点与许多传统化妆液差不多。但它在进入皮肤深层之后，还具有恢复 甚至重造皮肤自我湿润系统的功能。原来，随着年龄的增长或生理疲劳的加剧， 皮肤的自我湿润功能会逐渐减弱乃至消失，而这种化妆液起到促使自我修复系统 “起死回生 的作用【3 4 】。 利用多聚谷氨酸还可制取一种新型护发液。头发的最外层覆盖有一种叫毛鳞 片的物质，如毛鳞片脱落，头发就易受到损伤。而将这种新型护发液涂抹在头发 表层，形成的薄膜不仅能防止头发内水分的蒸发，而且其中的粘性成分还能发挥 类似胶水的作用，把即将脱落的毛鳞片完全或部分修复。 用放射线照射多聚谷氨酸，其分子结构即会发生变化，由此吸收水分的特点 还会增加。据试验，每克经过放射线处理的多聚谷氨酸竟然可吸收多达l 蚝的水。 利用这一特点，掺入多聚谷氨酸成分的尿布吸收尿液的性能可比传统纸质尿布强 2 5 倍【3 5 】。此外，普通纸尿布都是以化学合成物质为原料制取的，作垃圾处理时 并不能完全还原到土壤中去，于是对环境会造成污染。 1 4 3 农业 高吸水树脂是近2 0 年迅速发展起来的一种功能高分子材料，通常可吸收自身 质量几百倍到几千倍的水，且保水能力极强，已被广泛应用于农业、园艺、建 筑、涂料、食品、医药卫生、环境保护、石油化工等方面。但是传统的丙烯酸吸 水树脂生物分解性差，对环境易造成污染，加之原料来自不可再生的石油资源， 因此，近年来，开发新型的生物可降解的吸水树脂引起人们的极大重视【3 6 j 。 聚谷氨酸等既具有生物可降解性、又具有高吸水性，向人们展示了其土壤、 6 浙江工业大学硕士论文 植物的保水剂广阔应用前景。 将聚谷氨酸吸水树脂与土壤结合，不仅可以改进团粒，还能改进土壤的保墒、 保湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠方面发挥积极作用。日本九州大学农 学系教授原敏夫等人，以日本的纳豆丝( 聚谷氨酸) 为原料，开发出了一种吸水性 极强的纳豆树脂( 可吸自重5 0 0 0 倍的水) ，从而使沙漠及缺水地区绿化有了理想 的种子包衣材料。只要用这种树脂把植物种子包起来，在沙漠及缺水地区种植， 可很快发芽，效果十分理想【3 7 1 。 此外，y - p g a 还可用于农药、肥料的缓释剂等。在肥料、杀虫剂、除草剂、 驱虫剂等使用时，加入适量的聚谷氨酸盐可以延长这些药物在作用对象表面上的 停留时间，不易因干燥、下雨而被刷掉【3 8 l 。 1 4 4 其他应用 聚谷氨酸是一种出色的绿色塑料i 可广泛用于从食品包装到一次性餐具及其 他各种工业用途中，它在自然界可迅速降解，不会造成环境污染：寡聚谷氨酸可 作为各种食品的苦味掩盖剂，是高钠调味剂的替代品，可为糖尿病患者和高血压 患者所用，正作为健康饮食的组成成分丽被广泛使用【3 9 1 。此外，7 - p g a 还可作 为增稠剂、膳食纤维、保健食品、安定剂等应用于食品工业和作为蔬菜、水果的 防冻剂等应用于农业领域【删：水或废水处理中可作为金属鳌合剂或吸附剂和生 物絮凝剂f 4 1 郴】：研究发现聚谷氨酸的衍生物p g a 酯是一种性能良好的耐热塑料 f 删，p g a 苄酯可制成高强度纤维1 4 5 。聚氨基酸耐有机溶媒、耐热，抗逆性良好。 日本已经工业化生产了聚谷氨酸千甲酯( p m g ) ，主要被用于合成皮革或纤维处理 剂。 1 5 一、- p g a 生产工艺 研究比较集中的是地衣杆菌假l i c h e n i f o r m i s ) 和枯草芽孢杆菌s u b t i l i s ) 。大 量研究工作对这两类菌体生长所需的营养物质，菌体生长和产物合成的培养条件 进行了研究。 1 5 1 培养基 7 浙江工业大学硕士论文 7 - p g a 的合成、分子质量、t - p g a 分子中d g l u 与l g l u 的组成与培养基的 配方关系密切，对培养基的研究主要集中在碳源、氮源和金属离子的种类和含量 对7 0 p g a 的影响方面。 7 - p g a 产生菌需要大量的碳源和氮源，大约是7 - p g a 产量的2 2 0 倍【4 6 1 。碳源 主要有葡萄糖、蔗糖、谷氨酸、柠檬酸、甘油等，碳源的种类、浓度和不同碳源 的比例对7 - p g a 的产量影响很大。葡萄糖比甘油更利于丑l i c h e n f o r m i s a t c c 9 9 4 5 a 生长，然而，葡萄糖和甘油的混合物却有利于7 - p g a 的合成【4 7 1 ，如果将培养基中 的甘油含量从0 提高到4 0 班，最l i c h e n 掘，r m i sa t c c 9 9 4 5 a 产7 - p g a 的量将从5 7 g l 提高到2 0 5g l 。以葡萄糖、柠檬酸、乙酸、l 苹果酸、琥珀酸、富马酸等作 为b s u b f i l i si f 0 3 3 3 5 碳源，( n h 4 ) 2 s 0 4 为氮源，发酵生产i - p g a ，研究发现柠檬 酸是该菌发酵生产7 - p g a 的最佳碳源，l - g l u 添加到培养基中能大大刺激t - p g a 的生产，且没有副产物【4 引。对屋l i c h e n i f o r m i sw h b 3 ，柠檬酸和甘油是最佳碳源。 7 - p g a 发酵所用氮源一般为无机氮源，如氯化铵等，利用有机氮源时副产物 的生成量较大。在反硝化条件下，反硝化细菌地衣芽孢杆菌a 3 5 在含有葡萄糖、 氯化铵或谷氨酸的培养基中，生产t - p g a 产量达到8g l ，被纯化的t - p g a 中d 一 和l 谷氨酸的比例是4 ：1 ，1 , - p g a 的分子量约为3 1 0 5 d a 【4 9 】。 通过研究不同氨基酸对丑s u b t i l i sf 2 0 1 生产t - p g a 的影响，发现l g l u 起的 作用最明显，d g l u 作用略弱，其他氨基酸没有明显的影响，当l g l u 浓度为7 o 时，t - p g a 对l g l u 的转化率为6 8 。利用统计试验法( s e m ) 对b 1 i c h e n f o r m i sc c r c 1 2 8 2 6 菌株的摇瓶发酵试验研究发现：对7 - p g a 产量影响最为明显的因素依次为 谷氨酸、柠檬酸、甘油，初始p h 影响不大【5 0 1 ，通过响应面方法确定柠檬酸、谷氨 酸和甘油的浓度为2 4 5 0 ，5 7 2 0 和1 5 7 1 1g l 时，可使该菌株的t - p g a 生产能力从 5 2 7g l 提高到1 9 6 2e e l 【5 。 一些金属离子对b s u b t i l i s 生产 y - p g a 也有影响，m n 2 + ，k + ，f e 3 + ，m f + 和 c a 2 + 是最s u b t i l i s 生产 t - p g a 所必需的，低浓度的m n 2 + ( 1 5 4 x1 0 ：7m o l l ) 更易促 进丑s u b t i l i s 在含有l 谷氨酸的培养基中的生产7 - p g a ，而提高m n 2 + 浓度则菌体 生长受到抑制，但t - p g a 的产量可得到提高【5 2 , 5 3 。同样c a 2 + 在培养基中的存在也 有利于y - p g a 的合成，它的浓度影响着细胞的活性，m 0 6 + 也影响7 - p g a 的合成， m n 2 + ，m 9 2 + 可能控制着专一性很强的d 和l 多肽合成酶系统，t - p g a 的聚合度和 d l 构型比率都与金属离子的浓度有密切关系，当m n 2 + 的浓度在0 1 2 3 0l m a o l l 范 浙江工业大学硕士论文 围内波动时，b 1 i c h e n f o r m i sn c l m b1 1 7 0 9 产聚合物的分子量在4 0 0k d a - 2 ，0 0 0k d a 之间变化，7 - p g a 中d g l u 的比例在1 0 9 0 之间。此外培养基中m n 2 + 的浓度也 可改变丑l i c h e n f o r m i sa t c c 9 9 4 5 a 合成7 - p g a 中d g l u 与l g l u 的比例，而m n 2 + 的浓度并不改变as u b t i l i st a m - 4 和且s u b t i l i s5 e 合成7 - p g a 中d g l u 与l g l u 的比例5 4 1 。 1 5 2 发酵工艺 c r o m w i o k 掣5 5 1 研究了在分批发酵中，p h 、供氧对置l i c h e n f o r m i sa t c c 9 9 4 5 a 生产7 - p g a 的影响。p h 值影响着细胞的生长、碳源的利用、丫- p g a 的合成、分子 量的大小及聚合物的空间结构。在p h 6 5 时7 - p g a 的产量最高( 1 5g l ，9 6h ) ，这 与7 - p g a 的比产出速率也较高( o 0 9 h ) 是一致的。p h 对7 - p g a 分子中d g l u 与 l - g l u 组成和分子质量影响不大。在p h 6 5 下，增大发酵罐搅拌转速( 从2 5 0r m i n 到8 0 0r r a i n ) 和通气量( 从0 5l m i n 到2 0l m i n ) ，结果细胞干重加倍( 从2e e l 到4g l ) 7 - p g a 的产量增a n ( 从6 3g l 到2 3g l 4 8 h ) ，1 - p g a 的比产出速率也增 加( 从0 0 9 h 到0 1 v h ) ，培养基中柠檬酸和谷氨酸的消耗量增加，但是随着培养时 间的延长，7 - p g a 的分子量减小。 y o o n 等1 5 6 】通过分批补料培养鼠l i c h e n f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 生产7 - p g a 研究发 现在2 5l 反应器中，e 培养基中柠檬酸即将消耗完时( 2 3h ) ，脉冲补加柠檬酸( 1 4 4 e l ) 和谷氨酸( 2 4e e l ) ，7 - p g a 的生产速率达到1 班h ，产量达到3 5g 几。 o g a w a 等【5 刁研究了在3 0l 小型发酵罐中用b s u b t i l i s ( n a t t o ) m r 1 4 l 菌株高效 生产7 - p g a 的工艺。在2 0l m s c 培养基( 含6 麦芽糖，7 酱油，3 l 谷氨酸钠， 0 2 5 k 2 h p 0 4 ，0 0 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ) 中加3 n a c i 可以有效地防止发泡。搅拌的速 度越快( 3 0 0r m i n - 4 5 0r m i n ) ，谷氨酸量越多( 3 一6 ) ，7 - p g a 产量也越高。但是 试验中由于发酵液的粘度太高，补充的空气不能充分分散。如果能补充额外的氧 气，7 - p g a 的产量还有可能提高。 r i c h a r d 等( 5 8 j 对b s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 发酵丫p g a 过程中的体积传氧速率( k l a ) ， 嫡值( q 0 2 ) 、菌体耗氧速率( o 切时以及发酵液的流变特性作了研究，从对数后期或 稳定前期开始，7 - p g a 发酵液为非牛顿假塑性流体；最大的耗氧时期在 发酵液变粘之前的对数早期。在稳定期7 - p g a 达到最大时发酵液粘度也达到最大 值，而此时菌体耗氧速率( o u r ) 最低。r i c h a r d 的这些研究为发酵罐的设计和放大， 9 浙江工业大学硕士论文 以及下游分离纯化工艺的研究奠定了一定的基础。 目前，t - p g a 的生产都是采用液体发酵工艺，由于7 - p g a 具有很大的粘度， 在液体发酵中不可避免会出现传热、传质、溶氧受阻、泡沫大量产生、产量不高 而成本较高等具体问趔5 9 1 ，液体发酵一般产量为1 o 2 5 。 1 5 - 3 提取工艺 由于t - p g a 分子量大，粘度大，同时在p h 7 左右带负电，在发酵液中比较稳 定 6 0 i 。目前7 - p g a 的分离纯化通常采用有机溶剂沉淀法、铜盐沉淀法和膜分离沉 淀法。 有机溶剂沉淀法路线为：发酵液 ，离心除菌，乙醇沉淀水溶解 ，透析、乙醇沉淀、水溶解透析- 冷冻干燥、产品( 纯度9 7 ) ； 铜盐沉淀法路线为：发酵液 - 离心除菌- 饱和硫酸铜沉淀酸溶 - 硫化氢沉淀水溶解冷冻干燥产品( 纯度l o o ) 。 由于t - p g a 的粘度较大，给分离纯化带来了困难。d o 等6 1 】对传统的y - p g a 分离纯化的工艺进行了改进。通过降低发酵液的p h 值到3 ，在3 5 ( 2 时，发酵液的 粘度和细胞表面的电位分别降为原来的i 6 和1 3 ，发酵液酸化后，发酵液离心 ( 2 2 ，o o o g ) 所消耗的能量降为原来的1 7 ，通过中空纤维膜( m w c o5 0 0 ，0 0 0 ) 超滤使 发酵液1 - p g a 的浓度由2 0g l 提高到6 0g ，l 后，用乙醇沉淀 - p g a 的量降为原来 的i 4 ，因而大大地降低了成本。 1 6 本课题的研究意义及内容 由于石油资源的储量有限以及人类生存对环保、经济可持续发展的要求，来 自生物质加工而成的生物可降解高分子材料的研究正成为当今世界各国竞相研究 的热点。 7 - p g a 是由某些杆菌产生的一种胞外氨基酸聚合物，不依赖于石油资源，不 会产生传统化学合成高分子产生的固体废弃物问题，是一类环境友好的新一代高 分子材料，在人们越来越关心自己所处环境的今天，它越来越受到人们的关注。 我国氨基酸行业的主要竞争对手是日本，多年来与日本既竞争又合作。现在 我们可以生产氨基酸原料，对方则进行精加工。所以国内企业在产品精加工方面 l o 浙江工业大学硕士论文 应该重视，不应仅停留在生产粗原料上。国内原料企业应严格执地行内标准，改 粗品生产为精品生产，变粗品出口为精品出口，以精品占领国际市场，获取更大 利润。如若实现聚谷氨酸以谷氨酸为底物的大规模发酵生产，将为我国的氨基酸 产的发展开拓广阔的国际生存空间。 。 本论文利用产7 - p g a 的细菌菌落具有较高的表观粘度的特性，从纳豆食品以 及实验室保藏菌种中筛选出产7 - p g a 菌株，并通过生理生化性质和1 6 sr d n a 序 列的测定进行菌种鉴定。利用f d n b 能和氨基反应并在3 5 6n l n 处有紫外吸收的性 质，建立了一种能同步测定丫聚谷氨酸产量和平均分子量的新方法，并应用于对 菌株的培养条件进行单因素的优化，同步考察了培养条件对t - p g a 产量和平均分 子量的影响，条件主要包括碳源、氮源、谷氨酸前体添加量、金属离子、培养温 度、初始p h 、摇床转速等。最后对，- p g a 絮凝活性的条件及絮凝情况进行简单的 探讨，包括 i - p g a 的浓度、p h 、温度、作用时间、金属离子等。 1 7 参考文献 【1 】m c l e a nr jc ，b e a u c h e m i nd ，c l a p h a mle ta 1 m e t a l - b i n d i n gc h a r a c t e r i s t i c so f t h eg a m m a g l u t a m y lc a p s u l a rp o l y m e ro fb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa t c c 9 9 4 5 j a p p l e n v i r o n m i c r o b i o l ，19 9 0 ，5 6 ：3 6 71 3 6 7 7 2 】洼田英俊，南部洋子微生物生产的聚丫谷氨酸的性质 j 】化学与粘合，1 9 9 4 ， 2 0 4 ( 4 ) ：2 4 4 - 2 4 6 3 】i v a n o v i c s ，gb r u c k n e rvc h e m i s h ea n di m m u n o l o g c h es m d i e nu b e rd e n m e c h a n i s m u sd e rm i l z b r a n d i n j e k t i na n di m m u n i t a t ；d i ec h e m i s c h es t r u k t u rd e r k a p s e l s u b s t a n z d e sm i l z b r a n d b a z i l l u sa n dd e r s e r o l o g i s c h d e n t i s c h e n s p e z i f i s c h e ns u b t a n zd e sb a z i l l u sm e s e n t e r i c u s j z i m m u n i t a t s f o r s c h ，19 3 7 9 0 ： 3 0 4 3 1 8 4 】f u j i o y , d i s t r i b u t i o no fp l a s m i d si np o l yg l u t a m a t ep r o d u c i n gb a c i l l u ss t r a i n s i s o l a t e df r o m ”n a t t o - 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