形态学实验技术(研究生)PPT课件.ppt

形态学实验技术,华北理工大学医学实验研究中心李琪佳,1,组织切片制作技术石蜡切片常规染色技术石蜡切片特殊染色技术免疫组织（细胞）化学技术免疫细胞化学的理论基础免疫荧光细胞化学技术免疫酶细胞化学技术亲和免疫细胞化学技术,重点介绍：,2,电子显微镜技术（electronmicroscope,EM）1.透射电子显微镜2.扫描电子显微镜3.电镜技术与生物医学超微结构4.细胞超微结构与超微结构病理,3,激光扫描共聚焦显微镜技术（ConfocalLaserScanningMicroscope）集高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器突破了普通光学显微镜不能对细胞或组织内部进行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞内pH、Ca离子浓度、膜电位、过氧化物、细胞间通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究开辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺少的的工具。,4,流式细胞仪技术（FlowMicrofluorimetry）是一种单细胞定量分析和分选的新技术。其范围包括了细胞表面或细胞内的各种抗原、蛋白、酶以及基因表达产物；还有细胞内的核酸定量或DNA倍体、细胞周期分析；尤其是癌基因的检测、血细胞表型分析、细胞分子和粘附分子的检查、细胞凋亡分析、肿瘤相关抗原及单种细胞的纯化。,5,第一章组织切片制作技术,第一节概述组织切片的制作技术属于组织病理学范畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支持物质，使组织保持一定的硬度，然后利用切片机切成薄片，经染色在显微镜下观察。根据支持物的不同，有石蜡切片、明胶切片、塑料切片、冷冻切片等类别。制成的切片捞置于载物网上，经烘干后可进行染色或备用。,6,组织切片技术包括组织的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染色等。组织病理学标本大致可分为：手术标本、内镜取材标本、穿刺标本、细胞学标本,7,第二节组织的处理,取材固定脱水透明浸蜡与包埋,8,一、取材（tisssueprocessing）1材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最迟不能高于30分钟。2取材部位及切面：纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部位就必须熟悉机体的组织结构和解剖特点，原则上应在病变与正常组织的交界处取材，避开坏死出血区。,9,，甚至卷曲变形，特别是神经肌肉组织，可将其两端扎在木片或小木棍上进行固定。3.勿使组织受挤压：取材刀剪应锋利，切开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结构变形、细胞破碎。4.防止变形：固定后的组织或多或少会产生收缩现象,10,5组织块力求小而薄：切块的大小、厚度及质地决定了固定的效果，一般情况下，取材大小为21cm，厚度为24mm。二、固定（fixation）固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到需要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中，使其所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置。,11,固定的目的：1.迅速防止组织细胞的死后变化,防止自溶与腐败使之尽量保持生前的形态结构。2.使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等成分变为不溶性物质，以保持其原有形态及特定位置。,12,3.能将细胞的半液体状变成半固体状，使组织变硬以利切片。4.可使组织内的各种成分产生不同的折光率。5.某些固定液可起助染作用而增进染色。,13,固定方法浸泡固定注射、灌注固定微波固定蒸汽固定,14,常用的固定剂单纯性固定剂：甲醛（福尔马林formalin）乙醇；乙酸。混合固定剂：中性甲醛pH7.0（甲醛、磷酸缓冲液）；A-F液（甲醛、酒精）,15,三、脱水（dehydration）将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程脱水的目的标本经固定和水洗后，组织内有大量水份，不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。,16,常用的脱水剂和脱水方法脱水剂有：乙醇、丙酮等80酒精30分钟95酒精12小时95酒精12小时100酒精12小时100酒精12小时,17,四、透明（clearing）为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡包埋前的一个特定步骤。透明的目的：便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡）相混溶，起到桥梁作用。,18,大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶，故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进行后续程序。常用的透明剂二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、易挥发；沸点1380C-1400C,长期接触对粘膜有刺激作用。氯仿:易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、苯等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组织变脆，使大块组织的良好透明剂,19,常用的透明方法二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织块二甲苯1二甲苯2，此二步总的时间不超过40分钟。氯仿透明法：彻底脱水的组织块按3：1氯仿、纯酒精混合液1小时氯仿1-2小时1：1氯仿石蜡混合液1小时。,20,五、浸蜡与包埋浸蜡(paraffininfiltrating)和包埋(embedding)是指标本经过前期处理后，再置于支持物中，使支持物透入组织内部，并将组织埋入、包裹的过程。常用的支持物有明胶、石蜡、火棉胶、树脂、炭蜡等，他们及时浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是石蜡。,21,浸蜡的方法此法应在560C620C的温箱内进行，液状石蜡的量应为标本的2530倍。方法：透明后的组织520C540C（软蜡）1小时540C560C石蜡1小时580C600C（硬蜡）1小时540C560C石蜡进行包埋,22,第三节组织切片,切片（section）1.整修蜡块：组织四周应留有24mm蜡边，蜡块的上下两边应平行。2.镶装：镶装平面应尽可能与切片刀刃平行。3.调整：切片机的进度尺常定在46m，切片刀的倾斜角在20度左右。4.修切平面：修切的组织片不能过厚，以免造成组织块的人为损失，标准为15m次。,23,5.切片：要求质量，左手毛笔，右手眼科镊，转速均匀。6.展片、捞片：常用水温为450C左右，组织膜与玻片附着的位置为，右手持片，玻片的左23正中。7.烘片：烘烤箱的温度为630C以下，时间常为12小时。,24,25,26,27,第二章石蜡切片常规染色技术,第一节概述染色的意义及目的:染色（stainning）是用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。组织染色属于生物染色的范畴。染色种类：包括普通染色、特殊染色、单一染色、多色染色等。,28,第二节苏木素伊红染色（HE染色）苏木素（haematoxylin）又称苏木精，一种天然碱性染料，对细胞核具有优良的染色能力。伊红Y（eosin）又称曙红Y,简称伊红，属酸性染料，是良好的细胞质染色剂。苏木素(haematoxylin)伊红染色法，简称HE染色，是医学领域中最广泛应用于细胞和组织的染色方法，也被称为常规染色。,29,一、HE染色的基本原理细胞核染色的原理：细胞核主要由DNA构成，带负电荷，呈酸性，易于带正电荷的碱性染料结合。细胞质的染色原理:细胞之内主要成分是蛋白质,为两性化合物，细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。,30,必须将pH调至等电点以下时，再染液中加入醋酸使胞浆带正电（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y:是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电的阴离子，与蛋白质的带氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染成红色。,31,二、染色方法1.自温箱中取出切片后，立即放入二甲苯、中脱蜡各5分钟。2.入纯酒精1、2中各5分钟以洗去二甲苯。3.入95%酒精和80%酒精中各5分钟。4.入自来水洗涤（水化）。5.入苏木素染液5-10分钟。6.自来水洗。,32,7.0.5-1%盐酸酒精分化数秒钟。8.充分水洗蓝化30分钟。9.0.5-1%伊红1-2分钟。10.80%、95%、纯酒精1、2(脱水)各5分钟。11.二甲苯1、2中(透明)各510分钟。12.中性树胶封固。,33,HE染色中二甲苯、酒精和水洗作用：1.二甲苯的作用:二甲苯可以洗去石蜡，使染料更易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明切片的作用。以利于光线的透过。2.酒精的作用:酒精用于苏木素染色前由高浓度向低浓度逐渐下降处理切片,洗脱用于脱蜡的二甲苯。酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精(95%,80%)使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形态结构的人工改变。,34,伊红染色后的梯度酒精(80%,90%,95%,100%)是为了逐渐脱去组织中的水分,为二甲苯进入细胞(透明)创造条件。否则切片组织不能显示清晰的细胞和组织结构。3.水洗:水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染料。,35,HE染色中分化和蓝化的作用：1.分化作用:苏木素染色后,水洗去未结合在切片中的染液,但细胞核内结合过多的染液和细胞浆中吸附过多的染料必须用分化液(1%盐酸酒精）脱去，以保证核与浆的染色分明。将此过程称为染色的分化作用。但不能过度。,36,2.蓝化作用:当分化以后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于兰色离子状态。所以分化后用水洗去酸而中止分化，也可用稀氨水或温水变蓝。此过程称蓝化作用。,37,38,39,第三节组织切片特殊染色(Masson三色染色)为了显示组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变、病原体等，需要选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，这些是常规染色所不能的。故称特殊染色。如细胞中的黑色素或含铁血黄素的区别，用特殊染色即可做到。,40,结缔组织含有三种纤维，即胶原纤维、网状纤维和弹力纤维。这三种纤维广泛分布于身体各处，常见于器官与器官之间，组织与组织之间以及细胞和细胞之间，这些纤维具有支持、连接、营养、防御、保护和创伤修复等功能，在H.E染色中有时难以区别，特别是在某些病理改变时，则要借助于特染鉴别。,41,特殊染色的方法很多，在此仅介绍胶原纤维染色。显示胶原纤维的方法很多，最常用的是Masson三色染色和V.G染色。应用：判定多种组织、器官的病变程度及修复情况；区分肿瘤组织中的纤维与平滑肌成分。,42,Masson三色染色技术操作Masson复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄G、醋酸亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）：亮绿、醋酸染色过程：1.切片脱蜡至水2.苏木素染5分钟,水洗3.盐酸酒精分化,水洗4.染于丽春红复红液5分钟,水洗,43,5.磷钼酸水溶液分化5分钟,水洗6.染于亮绿2-5分钟7.脱水、透明、封固结果判定:胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。,44,45,脑尼氏体,46,星形细胞,47,肾淀粉样变刚果红染色,48,肝表面抗原维多利亚蓝,49,第三章免疫组织（细胞）化学(immunohistochemistry,IHC),第一节免疫组织化学概论免疫组织化学是利用免疫学抗体与抗原结合的原理及组织化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位和定量的技术，是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科。若想学好免疫组织化学，必须先了解与之相关的免疫学基础。,50,免疫组织化学主要原理是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。,51,凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其用免疫细胞化学手段检出和研究。,52,乳腺导管癌ER,53,细支气管肺泡癌TTF-1,54,55,56,免疫细胞化学的突出优点是：1.高度的特异性抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。,57,2.敏感性高免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物的抗原性，采用多种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。,58,3.方法步骤统一虽然免疫组化技术的方法很多，但基本程序相同只要掌握了原理和一种方法，其它方法大同小异。4.既可定位、定性又可定量免疫组化技术用于组织或细胞成分定性、定位及定量的研究,59,有关的免疫学理论一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系抗原(Antigen)凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性。抗原可以是可溶性物质（如病毒和蛋白质）或微粒（细菌或组织细胞）。也可有外源性和内源性之分。,60,抗体(Antibody)是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五类即IgG,IgM,IgA,IgE,IgD。抗体的种类：根据获得抗体的途径或来源不同分类免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完全抗体。,61,抗原与抗体的关系抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决定免疫反应的特异性，机体与抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质，是机体排除异体物质的保护性反应。没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体可以检测抗原物质。,62,二、免疫细胞化学的分类根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术；免疫酶细胞化学技术；免疫铁蛋白技术；免疫金银细胞化学技术；亲和免疫细胞化学技术；免疫电子显微镜技术等。,63,不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括:抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，可直接应用市售产品。我国自制抗体种类较少。,64,三、免疫染色可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：标记抗体与标本中抗原反应结合；用PBS洗去未结合的成分；直接观察结果(免疫荧光直接法)；或显色后再用显微镜观察(免疫酶直接法)。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法。,65,第二节免疫荧光细胞化学免疫荧光细胞化学技术(immunofluorescencecytochemistrytechnique）是将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再与组织切片或涂片中相应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下借助紫外光激发呈现出黄绿色或橘红色荧光，由此检测抗原或抗体并定位。此方法称荧光抗原（抗体）法。以荧光抗体方法较为常见。,66,直接法:用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体。直接用于组织抗原的检查。常用于肾穿和病原体的检查。,67,间接法：是直接法的重要改进。先用特异性抗体（一抗）与组织标本反应，再用间接荧光抗体（二抗）与结合在抗原的抗体结合，形成抗原抗体荧光抗体的复合体。是荧光亮度增强，灵敏性高，目前应用广泛。,68,检测操作流程(直接法）,在制备或购得高质量的荧光抗体的前提下，可按直接法进行如下的操作：1.细胞爬片、涂片经丙酮固定10min后进入PBS充分洗涤；石蜡切片脱蜡入水后，0.1%胰蛋白酶消化40min左右入PBS洗涤。2.适当稀释的荧光抗体于湿盒内370C环境下孵育50min。3.PBS洗33min。4.0.1%伊文氏兰衬染3min。5.蒸馏水洗，水溶性封固剂封片。,69,切片的观察及保存,染色好的标本应立即在荧光显微镜下进行观察异硫氰酸荧光黄（FITC）为黄绿色荧光；四乙基罗达明（BR200)为明亮橙色荧光；四甲基异硫氰基罗丹明（TRITC)为橙红色荧光；CY3为鲜红色荧光。随着时间的推移及观察次数的增加，荧光逐渐减弱。12小时后衰减25，一周后衰减60。,70,坏死和凋亡的比较：绿色细胞为凋亡；红色细胞为坏死,71,第三节免疫酶细胞化学,免疫酶细胞化学技术（immunoenzymecytochemistrytechnique）是在抗原抗体特异性反应的前提下，借助酶细胞化学原理探测细胞内抗原或抗体及其存在部位的一门技术。该方法将抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机地结合，通过酶催化底物进而发生一系列的化学反应，使溶液呈现出颜色反应，从而显示抗原抗体特异性反应的存在。,72,方法：按照酶是否预先与抗体结合在一起可分为酶标抗体法和非标记抗体酶法常用的标记酶依次为：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）。酶的成色反应取决于产生不同色素的底物（如DAB）及适当的反应条件。,73,免疫酶直接法,74,免疫酶间接法,75,（一）直接法：用酶（如HRP）标记的特异性抗体（一抗）直接与标本中的相应抗原结合，形成抗原抗体HRP复合物，最后用酶底物DABH2O2（二胺基联苯胺）呈现棕色或深棕色产物。优点：简单、省时、特异性高、非特异性染色较轻；缺点：敏感性差。（二）间接法：先用未标记的特异性抗体（一抗）与标本中相应的抗原反应，再,76,用酶标记的“抗抗体”（二抗）与已形成抗原抗体复合物的第一抗体分子反应，然后再进行显色反应。优点：用途广泛，只要标记一种抗体，就可以检测多种抗原。一般免疫组化多采用此法。上述免疫酶直接法和间接法属酶标抗体法。,77,酶底物显色剂,DAB,BCIP-NBT,AEC,NewFuchsin,卡巴唑,78,（三）过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（peroxidaseantiperoxidase，PAP）此种方法属非标记抗体酶法（抗酶抗体法）。由于在酶标记过程中，酶与抗体之间的结合损害部分抗体和酶的活性，降低了抗体的效价。另外，血清中非特异性抗体也可被酶标记，增加非特异性背景染色。因此，在酶标记的基础上，发展了不标记抗体的免疫酶技术。,79,此方法先用酶（HRP）制成高效价特异性抗体，再将酶与抗酶抗体形成复合物（PAP复合物）。此复合物稳定性好，灵敏度高。可以避免酶标过程中酶和抗体的减弱。基本染色流程：抗原抗体结合后，依次滴加第二抗体和PAP复合物，最终形成抗原特异性一抗第二抗体PAP复合物,80,PAP法原理,81,第四节亲和免疫细胞化学亲和免疫细胞化学技术（affinitycytochemistytechnique）是利用两种物质之间的高度亲和能力而互相结合的化学反应。此种具有高度亲和能力的物质是卵白素生物素。生物素（biotin）即维生素H。卵白素（avidin）称抗生物素，具有4个与维生素H亲和力极高的结合点，他们之间的亲和力比抗原抗体的亲和力高100万倍，既能牢固结合以又不影响彼此生物活性。,82,称抗生物素生物素系统。其技术方法有：抗生物素生物素过氧化物酶复合法(avidin-biotinperoxidasecomplextechnique,ABC法)、标记生物素抗生物素法(labelledavidin-biotintechnique,LAB)、链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-peroxidasecomplex,SP)等。,83,ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备。将抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶，第一抗体为非标记抗体，生物素标记的二抗与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。,ABC法,84,一、抗生物素生物素过氧化物酶复合法（ABC）原理,85,特点：1.敏感性高:比PAP法高20-40倍,这是由于生物素与抗生物素间有较强的结合力。2.特异性强:背景染色淡。3.方法简便:节约时间,PAP法需两天,而ABC法仅需几小时。,86,ABC-HRP法操作流程,1.石蜡切片脱蜡至PBS。2.0.10.05胰蛋白酶消化30min。3.PBS洗涤。4.0.3H2O2甲醇液或3H2O2室温孵育20min。5.正常动物血清(5-10%)室温孵育10min。6.不洗，滴加适当稀释的一抗370C60min或40C过夜。,87,7.生物素标记的第二抗体室温30-60min8.PBS洗涤。9.ABC复合物1:1001:150（A和B液于临用前等量混合）370C60min或40C过夜。10.PBS洗涤。11.DAB-H2O2显色（镜检控制），水洗、复染、封片。,88,二、标记生物素抗生物素法（LAB）原理,用生物素标记抗体为一抗体，以酶标记抗生物素为第二抗体，经成色反应而显示抗原物质。特点:方法简便，但灵敏度低。,89,LAB法操作流程,切片在含有1:100生物素标记的第一抗体孵育1h,室温。PBS洗2次，每次5min。用1：200过氧化物酶标记的抗生物素液孵育45min，水洗。酶呈色反应。,90,三、SP免疫组化染色原理,SP法采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来检测细胞和组织中的抗原。特点:1.高敏感性;2.低背景;3.简便快速;4.结果稳定,91,SP法原理,92,SP法操作流程,1、脱蜡至水2、修复抗原3、0.3%过氧化氢室温10min4、非免疫血清室温530min5、特异性免疫抗体(一抗)3760min或4过夜,93,6、BiotinIgG（二抗）373040min7、StraptavidinHRP374050min8、DAB显色各步间均以PBS液充分洗涤,94,第二代聚合酶两步法(Envision),DaKOEnvision显色系统是2001年投入美国市场的，2002年引入中国，它是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体(Envision)，把传统的二抗、三抗分别孵育合成一次孵育，由于不再有二抗三抗通过生物素的结合，故整个系统不受内源性生物素的干扰，是一个高敏感性显色系统。此方法由于简单、快速、敏感性强且避免了内源性生物素所造成的背景染色，有逐渐取代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势。,95,Envision法,96,Envision法操作流程,1.石蜡切片脱蜡至PBS。2.0.3H2O2甲醇液或3H2O2室温孵育20min。3.抗原修复。4.滴加适当稀释的一抗370C60min或40C过夜。5.PBS洗涤。6.EnVision370C孵育30min或室温60min。7.PBS洗涤。8.DAB(0.04%)显色（镜检控制），水洗、复染、封片。,97,98,何杰金氏淋巴瘤R-S细胞CD30,99,甲状腺癌CD44v6,100,甲状腺乳头状癌E-cadherin,101,乳腺浸润性导管癌PR,102,乙型肝炎HBsAg,103,脑胶质瘤MAP2a&b,104,免疫组化染色应注意,免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握,但要染好免疫组化,其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作不断摸索和探讨的事,但最基本的应从以下方面加以注意。,105,提高免疫组化敏感性的方法,概述：提高免疫组化敏感性有两种途径，一是增加IHC方法的敏感性，如二步法较三步法的敏感性较为显著提高；另一途径是通过对石蜡切片酶消化和热处理是IHC检测敏感性大为提高。抗原热修复是甲醛固定组织后会使蛋白质的三级结构发生改变，尤其是蛋白质分子苯环结构上的结构位置发生改变，从而使要检测的抗原决定簇位点改变方向，通过高温使抗原决定簇的位点恢复。另外，2/3的商品化的抗体需酶消化以暴露抗原决定簇。,106,抗原修复(antigenretrieval，AR)其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗原抗体最大限度的结合，增加特异性染色，避免非特异性染色。目前常用的修复方法有以下几种。,107,蛋白酶消化可以去除覆盖抗原决定簇表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引起的交联被打开而起暴露抗原决定簇的作用。目前常用的酶有：胰蛋白酶（主要用于细胞内抗原的修复）；胃蛋白酶（主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复）。,108,热诱导的抗原修复对大多数抗原有效，尤其是对核抗原的修复作用更为明显，最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。热诱导的抗原修复包括水浴加热法、微波加热法、高压加热法。,109,0.01%mol/L枸橼酸缓冲液，pH6.0（800-1500ml）于压力锅中，大火加至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，即达到工作温度和工作压力（扣阀至喷汽以6min为最佳），开始计时，1-2min后，压力锅离开热源，1min后用自来水冲淋锅体使之冷却至室温，去阀开盖，取出玻片，蒸馏水冲，后用PBS冲三次。,高压加热法,110,抗原未修复,111,酶消化的比较,112,合适的抗体稀释度是免疫染色的关键，现市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无需摸索，但对浓缩型一抗，则应筛出最佳的滴度。抗体的过高及过低都可影响结果的准确性。应达到最大的抗原染色强度和最低的背景着色。,113,温育时间大部分抗体温育时间为30-60min，必要时可4过夜(约18h)。温育的温度常37，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。37可增强抗原抗体反应；适用于多数抗体染色，但应注意在温箱中进行，防止切片干燥而导致失败。,114,多层染色法对弱的抗原可用间接法(双层)、PAP和ABC法（三层）、四或五层PAP法或ABC法，或PAP的ABC联合染色法等，可以较大程度的提高敏感性，获得良好结果。,115,组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加第二抗体动物之非免疫血清(1:5-1:20)封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。,减少或消除非特异性染色的方法,116,非特异性着色,117,非特异性着色,118,根据所用的染色方法，可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。也可用1%-2%甲基绿复染。,复染,119,苏木精甲基绿,120,其目的在于证明和肯定阳性结