（植物学专业论文）半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究.pdf

半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究 摘要 半夏( p i n e l l i at e r n a t at h u n b b f i e t ) 根状茎中含有半夏蛋白、鞣质和生物碱等药 用成分，是我国一种特有的药用植物。半夏因病毒而引起的品种退化常导致种源不 足、产量与品质严重下降，这已成为半夏生产上的主要障碍之一，通过茎尖分生组 织脱除病毒培养的半夏苗和试管块茎等生物技术手段是生产上提供人工种子和提高 产量品质的重要解决途径。半夏试管块茎是组织培养条件下诱导的变态茎，其遗传 稳定性、生理生化特性上与常规块茎无异，半夏生产研究对此特别重视，但其试管 小块茎的形成机理尚不清楚，生产效率不高，应用上尚存在着许多困难。本研究旨 在添加不同内源激素抑制剂，研究半夏试管小块茎形成过程中内源激素的变化状况 与小块茎形成相关基因的表达模式，探索块茎形成的调控机理，为半夏试管块茎生 产提供理论和技术基础。主要研究结果如下： 通过m s 基本培养基中不同浓度g a 抑制剂( 矮壮素，c c c ) 处理，对半夏试管 块茎膨大和内源激素含量有一定影响。在半夏试管块茎形成过程中，c c c f l 皂有效的 增加块茎重量，抑制g a 3 ，i a a ，z r 的合成，并呈现出随着药剂浓度的增大而降低 的趋势。c c c 还能有效地影响a b a 和j a 含量，使之分别呈“v 型和“j 型。 通过m s 基本培养基中不同浓度a b a 抑制剂( 哒草伏，n o r ) 处理，对半夏 试管块茎膨大和内源激素含量有明显影响。在半夏试管块茎形成过程中，n o r 能有 效的减少块茎重量，抑制a b a ，i a a ，j a 的合成，使j a 含量变化呈“n 型。 n o r 还能有效地影响g a 3 和z r 含量。 通过m s 基本培养基中不同浓度j a 抑制剂( 水杨基异羟肟酸，s h a m ) 处理， 对半夏试管块茎膨大和内源激素含量有明显影响。在半夏试管块茎形成过程中， s ha m 能有效的推迟半夏块茎形成时间，促进在块茎形成后期g a 3 ，i a a ，z r 的 合成，但都低于对照。s h a m 有效抑制j a 的合成，同时还能有效地影响a b a ，使 之呈下降趋势。 提出了一种从半夏块茎中有效地提取高质量总r n a 的方法。将常规的异硫氰 酸胍提取植物总r n a 的方法做了改进，建立起一种简单实用的从富含多酚类和多 糖等物质的植物材料中提取总r n a 的方法。该方法所提r n a 的4 2 6 0 4 2 3 0 均大于 2 o ，彳2 6 0 彳2 踟的值为1 7 - - 2 0 ，电泳条带清晰，r n a 完整性好。利用该方法提取 的半夏试管小块茎总r n a 具有很高的质量和纯度，且得率很高，完全满足后续的 d d r t - p c r 分子生物学研究。 建立并优化了半夏块茎诱导前后银染m r n a 差别显示条件。利用正交试验设 计，从模板、m 9 2 + 、d n t p s 、引物和d n a 聚合酶5 种因素4 个水平，筛选并建立 了半夏试管小块茎诱导的d d r t - p c r 反应最佳体系。得到稳定且扩出最多条带的适 华中农业大学硕士论文 合半夏试管小块茎诱导的d d r t - p c r 最佳反应体系，即2 0 止的反应体系中含有 d n t p s1 5 0l u n o l l ，t a q 酶o 6u ，锚定引物2l u n o l l ，随机引物li x m o l l ，m 矿+ 2 5 m m o l l ，2 此1 0 x b u f f e r 和2 5 嵋的e d n a 模板。各因素影响程度依次为t a q 酶 浓度 e d n a 模板浓度 d n t p s 浓度 m 矿+ 浓度 引物浓度。 利用m r n a 差异显示技术分离和克隆了半夏试管小块茎发育的相关基因片段。 应用m r n a 差异显示( d d r t - p c r ) 方法比较分析了半夏试管小块茎发育过程中的基 因表达差异。结果分离到了1 5 个半夏试管小块茎发育过程中特异表达的c d n a 片段， 在g e n b a n k 中进行同源性比较发现后6 个没有同源序列与之匹配；前3 个片段推导 的氨基酸序列分别与真核生物启动子，m a d s b o x 蛋白和乙烯信号转导因子有高度 同源性。半定量i m p c r 进一步证实它们存在，并在半夏生成不同天数高度特异表 达。其中，这三个片段所推定的氨基酸都与块茎的发育有关，这为探讨半夏块茎发 育分子机制提供了新资料。 关键词：半夏；试管块茎；内源激素；总r n a 提取；d d i m p c r ；正交优化； 块茎发育；半定量r t - p c r 半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究 a b s t r a c t p i n e l l i at e r n a t a ( t h u n b ) b r i e t e n r i c h e d 埘t 1 1t h em e d i c i n a li n g r e d i e n t so fp r o t e i n , t a n n i ma n da l k a l o i di sa ni m p o r t a n ts t e r o i dm e d i c i n er e s o u r c e sp l a n tt h a ti se n d e m i ct o c h i n a 1 1 1 ed e g e n e r a t i o ni nq u a l i t yo fp i n e l l i at e r n a t a c a u s e db yv i r u sd i s e a s e su s u a l l y r e s u l t si nas e r i o u sl o s so fb o t ht u b e ry i e l da n dq u a l i t y , w h i c hh a sb e e nam a i nh i n d e ri n p r o d u c t i o no f p i n e l l i at e r n a t a f o rl o n gt i m e v i r u s e l i m i n a t i o nt h r o u g hm e r i s t e mc u l t u r e h a sb e e nw i d e l yu s e di n t h e s e e d l i n ga n dm i c r o t u b e r so fp i n e l l i a t e r n a t a a n dt h e d e v e l o p m e n to fb i o t e c h n o l o g y i si m p o r t a n tc h a n n e l st or e s o l v et h ep r o d u c t i o no fa r t i f i c i a l s e e d sa n dt h ei m p r o v m e n ty i e l da n dq u a l i t y 1 1 1 em i c r o t u b e ro fp i n e l l i at e r n a t a ，w h i c hi s i n d u c e df r o mt h eu p p e ro fl e a fs t a l k se n d s ，h a st h es a m eg e n e t i cs t a b i l i t y , m o r p h o l o g i c a l a n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sc o m p a r e d 、析lc o n v e n t i o n a lt u b e r s p e r s p e c t i v e so f u s i n gr n i c r o t u b e r so f p i n e l l i at e r n a t a i ns e e ds y s t e mh a s ，t h e r e f o r e ，d r a w ng r e a ti n t e r e s t s i nr e s e a r c h h o w e v e r , t h ep r o d u c t i v i t yo fm i c r o t u b e r si sr e l a t i v e l yl o ws i n c et h e r ei sl i t t l e i n f o r m a t i o na b o u tt h et u b e r i z a t i o nm e c h a n i s m w i t l la i m st ol o o ki n t ot h i sa s p e c t ，t h e e x p e r i m e n t sw e r el a i do u tu n d e rv a r i o u st u b e ri n d u c i n gc o n d i t i o n sa n di n v e s t i g a t i o n so f v a r i a t i o ni ne n d o g e n o u sh o r m o n e sa n de x p r e s s i o no ft u b e r - f o r m i n g - - r e l a t i v e - g e n e s ( t f r g ) w e r ec a r r i e d o u t n l em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： s t u d i e dt h ee f f e c t so ft h ei n h i b i t o ro fg i b b e r e l l i n s b i o s y n t h e s i so nt u b e re n l a r g e m e n t a n dc o n t e n to fe n d o g e n o u sh o r m o n e so fp i n e l l i at e r n a t a p i n e l l i at e r n a t am i c r o t u b e r s w e r ei n d u c e di nt h em e d i u mm sa d d e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc c c 1 f 1 圮r e s u l t s s h o w e dt h a tc c cc o u l ds i g n i f i c a n t l ya d dm i c r o t u b e rw e i g h ta n di n h i b i tt h es y n t h e s i so f g a 3 ，i a a ，z ra n dt h e yw e r er e d u c e da st h ec o n t e n to fc c ci n c r e a s e d m e a n w h i l e ，c c c c o u l de f f e c t i v e l yi n f l u e n c et h ec o n t e n to f a b aa n dj as h a p e da s 。v ”a n d “j ， s t u d i e dt h ee f f e c t so ft h ei n h i b i t o ro fa b s c i s s a sa c i d - b i o s y n t h e s i so nt u b e r e n l a r g e m e n ta n dc o n t e n to fe n d o g e n o u sh o r m o n e so fp i n e n i at e r n a t a m i c r o t u b e r sw e r e i n d u c e di nt h em e d i u mm sa d d e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fn o r t h er e s u l t s s h o w e dt h a tn o rc o u l ds i g n i f i c a n t l yr e d u c em i c r o t u b e rw e i g h ta n di n h i b i tt h es y n t h e s i s o fa b a ，i a a ，j aa n dt h ec o n t e n to fj as h a p e da s n ”m e a n w h i l e ，n o rc o u l de f f e c t i v e l y i n f l u e n c et h ec o n t e n to fg a 3a n dz r s t u d i e dt h ee f f e c t so ft h ei n h i b i t o ro fj a s m i n e sa c i d - b i o s y n t h e s i so nt u b e r e n l a r g e m e n ta n dc o n t e n to fe n d o g e n o u sh o r m o n e so fp i n e l l i at e r n a t a m i c r o t u b e r so f p i n e l l i at e r n a t aw e r ei n d u c e di nt h em e d i u mm sa d d e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f i i i 华中农业大学硕士学位论文 s h a m t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts h a mc o u l ds i g n i f i c a n t l yp o s t p o n e dt h ef o r m a t i o no f m i c r o t u b e rt i m ea n dp r o m o t et h es y n t h e s i so fg a 3 ，队a ，z r , b u tt h ec o n t e n to ft h e mw e r e l o w e rt h a nc o l l a t i o n s h a mc o u l d e f f e c t i v e l yi n h i b i t e dt h es y n t h e s i so fj aa n dd e c r e a s e d t h ec o n t e n to f a b a ah i g h l ye f f i c i e n tm e t h o do fi s o l a t i n gt o t a lr n af r o mm i c r o t u b c r so fp i n e l l i a t e r n a t ai nv i t r ow a sd e v e l o p e di nt h i ss t u d y b ym o d i f y i n gt h em e t h o dr e c o m m e n d e db y g u a n i d i n i u mf o re x t r a c t i n gt o t a lr n af r o mp l a n tt i s s u e sr i c hi n p h e n o l i ca n d p o l y s a c c h a r i d i cc o m p o u n d s ，as i m p l ea n dc o n v e n i e n tm e t h o df o r e x t r a c t i o no f t o t a lr n a f r o m p l a n t m a t e r i a l s c o n t a i n i n g a b u n d a n t p o l y p h e n o l sa n dp o l y s a c c h a r i d e s w a s e s t a b l i s h e d t h ev a l u eo fr n ae x t r a c t e dw i t hi m p r o v e dm e t h o da 2 6 0 a 2 3 0w e r ea l l o v e r2 0a n dt h ev a l u e so fa 2 6 0 a 2 8 0w e r eb e t w e e n1 7a n d2 0 t h ee l e c t r o p h o r e s i s b a n d sc l e a r e do na g a r o s e g e la n di n t e g r i t yo fr n aw a sg o o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t r n ao b t a i n e df r o mr a p e s e e d 埘mt h i sm e t h o dh a dh i ：曲p u r i t ya n dq u a l i t ya n dc o u l db e u s e di nm o l e c u l a rb i o l o g i c a lr e s e a r c h ，a sd d r t - p c ra n da n a l y s i sd i r e c t l y e s t a b l i s h m e n ta n do p t i m i z a t i o no fs l i v e rs t a i n i n gd i f f e r e n t i a ld i s p l a yo fp i n e l l i a t e r n a t em i c r o t u b e r si nv i t r o t h ee f f e c t so ff i v ek i n d so ff a c t o r sw e r es t u d i e db y o r t h o g o n a ld e s i g nm e t h o di n c l u d i n ge m p l a t ec d n a ，m g h ，d n t p s ，p r i m e r sa n dt a qd n a p o l y m e r a s e ，a n di no r d e rt oe s t a b l i s ht h eo p t i m u md d r t - p c rs y s t e mo fp t e r n a t a m i c r o t u b c r si nv i t r o a s a t i s f a c t o r yd d r t - p c rt e c h n i q u es y s t e m f o rp t e r n a t a m i c r o t u b e r si nv i t r o 、 ，i t i ld e s i r a b l er e p e a t a b i l i t ya n dp o l y m o r p h i cb a n d sw a se s t a b l i s h e d i nat o t a lv o l u m eo f2 0 1 t ld d r t - p c rs y s t e m ，i tc o n t a i n e d10 x b u f f e r ，15 0p m o l l d n t p s ，2p m o l la n c h o rp r i m e r , 1p m o l la r b i t r a r yp r i m e r , 2 5m m o l lm 矿+ ，0 6ut a q d n a p o l y m e r a s ea n d2 5l l gt e m p l a t ee d n a t h ee f f e c to ft h ef i v ef a c t o r sw a si n s e q u e n c eo ft a qd n ap o l y m e r a s e t e m p l a t ee d n a d n t p s m 十 p r i m e r s i d e n t i f i c a t i o no fe x p r e s s e dg e n ef r a g m e n t sr e l a t e dt ot h em i c r o t u b e r sd e v e l o p - m e n t o fp i n e l l i at e r n a ti nv i t r o b yd d r t - p c r i nt h i ss t u d y ，w ei d e n t i f i e da n dc h a r a c t e r i z e d e i g h tc d n af r a g m e n t sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h ei n d u c t i o no fm i c r o t u b e r so f p i n e l l i at e r n a t ai nv i t r o u s i n gm r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yd d r t - p c r d e d u c e da m i n o - a c i ds e q u e n c e so ff i v eo ft h ee i g h tc d n af r a g m e n t ss h o w e dn os i g n i f i c a n th o m o l o g y 、析t l le s t sa n dg e n e si nt h eg e n b a n kd a t a b a s e s h o w e v e r , t h er e m a i n i n gt h r e es h o w e d s i g n i f i c a n th o m o l o g i e sw i t hs e q u e n c e se n c o d i n gc o m p o n e n t so fe u k a r y o t i ct r a n s l a t i o n i n i t i a t i o nf a c t o r3s u b u n i th ，m a d s - b o x p r o t e i na n de t h y l e n es i g n mt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ， r e s p e c t i v e l y t h e i rd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np a t t e r n sw e r ec o n f i r m e db ys e m i q u a n t i t a t i v e r t - p c ra n a l y s i s a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h ei n d u c t i o no fm i c r o t u b e r so fp i n e l l i a t e r n a t ai nv i t r o w e r ed i f f e r e n t t h et h r e ec d n af r a g m e n t sd e d u c e dl i k ep r o t e i nw e r e i v 半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究 m o s tl i k e l yi n v o l v e di nt h em i c r o t u b e r sd e v e l o p m e n to fp i n e l l i at e r n a t a ，a n dt h es t u d y g a v eu sn o v e li n s i g h t si n t ot h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t h em i c r o t u b e r sd e v e l o p m e n to f p i n e l l i at e r n a t a k 呵w o r d s ：p i n e l l i at e r n a t af f h u n b ) b e r i t ；m i c r o t u b e r ；e n d o g e n o u sh o r m o n e s ；t o t a l r n a e x t r a c t i o n ；d d r t - p c r ；p o s i t i v e - c r o s st e s tm i c r o t u b e r sd e v e l o p m e n t ；s e m i - q u a n t i t - a t i v er t p c r v 华中农业大学硕士学位论文 缩略词表 简写符号 英文全称中文全称 a b a a m p b l a s t c c c c d n a d d r t p c r d d w a t e r d e p c d n a g a s m i p t g j a l b m r n a m s n c b i r to p c r n o r o r f p c r r n a s h a m t a q 确s ： x - 酬 a b s c i s i ca c i d a m p i c i l l i n b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l c h l o r m e q u a tc h l o d d e c o m p l e m e n t a r yd n a m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d e o x y - r i b o n u c l e i ca c i d g i b b e r e l l i ca c i d i n d 0 1 - 3 a c e t i ca c i d i s o p r o p y l t h i o b d - g a l a c t o s i d e j a s m o n i ca c i d l u r i a - b e l t a l l i m e s s a g er n a m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m 脱落酸 氨苄青霉素 局部比对基本检索工具 矮壮素 互补d n a m r n a 差异显示技术 双蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 赤霉素 吲哚3 乙酸 异丙基硫代一p - d - 半乳糖苷 茉莉酸 l b ( 培养基) 信使r n a m s 培养基 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n 美国国立生物技术信息中心 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录p c r o p e nr e a d i n gf r a g m e n t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d s a l i c y l h y d r o x a m i ca c i d t h e r m o s a q u a r i u sd n ap o l y m e r a s e t r i s ( h y t d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - e h l o r o - - 3 i n d o l y l p d - g a l a e t o s i d e z r z e a t i nr i b o s i d e v l 哒草伏 开放阅读框架 聚合酶链式反应 核糖核酸 水杨基异羟肟酸 嗜热d n a 聚合酶 三羟甲基氨基甲烷 5 溴- 4 氯3 吲哚- b d 半乳糖 苷 玉米素核苷 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 历 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：芬、阀廷 帆加8 年多月j 2 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定 ，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制 g = - 段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 籼张兹j a 秀撇名：一 签名日期：2 ，面年衫月f 2 日 签名日期：泸。矿；6 月f 彰 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究 1 前言 1 1 文献综述 半夏p i n e l l i at e r n a m ( t h u n b ) b r i e t 为天南星科多年生宿根草本植物。高1 5 3 0 锄，地下块茎呈近球形或半球形，直径1 0 - 2 5c m ，下部着生多而粗的须根，叶着 生于球茎顶端，幼苗期常为单叶，叶片卵状心脏形，基生叶l - 4 枚，中间一片较大： 成株的叶常具三小叶复叶，叶柄长5 2 5e m ，叶柄下部有一白色或棕色珠芽，直径 3 , - - - 8e m ，珠芽有繁殖能力。顶生以肉穗花序，花序梗常较叶柄长或等长；佛焰苞长 6 - - 7e m ，外绿色，内呈紫色；花单性，雌雄同株，浆果；花期5 , - - - 6 ( 9 ) 月；果 期6 - - 7 ( 1 0 ) 月。 半夏喜湿润环境，不耐干旱，土壤过湿过旱均会抑制其植株生长，但块茎不死， 当土壤湿度适宜时，又能继续生长，但土壤湿度也不能超出一定的限度，否则反而 生长不良，容易造成烂根、烂茎、甚至倒苗死亡，块茎产量下降。半夏畏强光，忌 烈日直射，耐荫蔽，但系尚为耐阴而不是喜阴植物，在适度遮光条件下，能生长繁 茂。可是，若光照过强，半夏会倒苗；若过度荫蔽，半夏植株则枯黄瘦小，数量也 小，甚至难以生存。半夏以在半阴环境为宜，珠芽增加数和母块茎增重均比向阳和 荫蔽区为好，适宜生长在稀疏灌木丛、落叶阔叶林、竹林或橘林下、以及玉米、小 麦等田间地头里。 半夏对土壤的要求不甚严格，但喜肥，土壤p h 值以6 7 为宜。在肥沃、疏松、 湿润、土层深厚，含水量为2 0 - - - 4 0 的沙质壤土或偏酸性的壤土中生长良好；除 盐碱土、砾土、过沙、过黏以及过于积水的土壤不宜生长外，其他土壤基本均可生 长。 我国半夏资源虽然分布较广，但由于其传播繁殖方式单一，往往珠芽落在母株 附近，生长区域局限，容易被“满门抄斩”。经过多年的演变，现在半夏的主产区 位于安徽、四川、湖北、河南、贵州等省。半夏作为一种使用频率较高的常用中草 药，由于其止咳平喘的疗效确切，加上肺部疾病的大量返弹，半夏的用量更是剧增。 但由于中草药是一类特殊的经济作物，种植面积较小，育种工作不受重视，目前半 夏的育种几乎是空白，现栽培品种都是多年沿袭下来的农家品种，长期采用营养无 性繁殖( 珠芽和块茎) ，缺乏有效的良种繁育体系，造成病害感染严重( 如黄化病毒 病和线虫等) ，品种退化，严重影响半夏的产量和品质。 针对半夏生产中存在的问题，近几年来，国内外学者开展了半夏的组织培养， 在茎尖脱毒培养、微型块茎的离体诱导以及试管苗移栽等快速繁殖方面进行了一系 华中农业大学硕士学位论文 列的研究，目的是为了利用组织培养脱毒技术来恢复半夏的种性，提高其产量。半 夏试管小块茎( m i c r o t u b e r ) 是在组织培养条件下，通过控制培养基成分和培养条件， 诱导叶柄顶端膨大形成的块茎。其在遗传稳定性、植物学、生理生化特性上与常规 块茎相同，从而为其应用提供了最基本的前提。因此半夏试管小块茎的生长发育机 理，引起了研究者极大兴趣和关注，在半夏小块茎形成过程中内源激素变化方面取 得了很大进展( 常莉，2 0 0 7 ) 。但外源激素的处理对半夏试管块茎形成过程中内源激 素的影响，以及半夏块茎发育过程中分子机理方面目前尚是空白，正因为如此，本 研究就这一问题展开了一系列研究。 技术路线： 本研究拟在他人研究的基础上，以半夏叶柄为外植体，重点研究不同浓度激 素抑制剂对半夏试管小块茎膨大和内源激素的影响；应用m r n a 差异显示的方 法，研究半夏试管块茎发育过程中相关基因表达状况。通过生理和分子手段研究 半夏试管小块茎的发育的机制。 麓铲。潦缈汕彬糍譬俐僦叩孵懒懒张。g 憾憾缈黔势气铋缀 蕤半夏无菌材料的准备，鬟 徽r 一7j i 。一嬲 爹4 ；。乍秽”。糟”7 “。撕2 彬鬻2 缪”紫粥硝“搬”秽“”。? ”滑”审”辩”“荆鄹礓 蠢m s 基本培养基中反置囊纛m s 中添加不同浓度c c c 、。n o r 矛i s h a m 鬟 褫：1 7 锄蚀泖“。# 嚣锶4 | ”馈掣哆嬲”粥叩；嘶4 嘴缆辚一 一镪 ；d d l m p c r 以及银染? _ 驴正交法确定d d 誓r r - p c r 各孽 7 lk 瓤l 参数最适条件 = 一p 一么 鏊差异片段的选取和a t 克隆i l ：测序和半定量r t - p c r 耋 戥 i 婵慨 霭：。黝 ，一，制一机，i，一的一育一发一茎 块小一管p 氏一试一夏 m ，_ 一半 2 究一研。面一方一两一子一分l 和 i 理 p - 一生 一从 4 移y ；如 半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究 1 1 1 半夏组织培养研究 1 1 1 1 外植体对半夏愈伤组织的影响 在对植物进行组织培养时，外植体本身的特性往往对培养物的器官分化和形态 建成有着决定性的作用。研究者( 韩献忠等，1 9 8 9 ) 将叶片、块茎、叶柄和根分别接 种不同培养基上，培养一个月后观察愈伤组织形成情况，培养三个半月后统计再生 苗数。结果表明，不管是愈伤组织的形成，还是成苗，以叶片作材料为好。又有研 究表明，半夏叶片、叶柄和块茎在6 0d 后形成大量的小植株，并且每个外植体形成 再生植株的绝对数目是叶片切块 叶柄切块 块茎切块( 朱忠荣等，1 9 9 1 ) 。当以启动 天数、愈伤组织生成率考察外植体的诱导能力时发现叶柄诱导效果最好，叶片次之， 块茎、珠芽较差。目前为止，可利用半夏珠芽、小块茎、叶片、叶柄、种子等为外 植体在相应的培养基上进行组织培养，并且均能得到再生植株( 李光胜等，1 9 9 2 ：曾 令波等，1 9 9 5 ；夏海武等，1 9 9 4 ；张丽梅等，2 0 0 3 ) 。而在取半夏叶片、叶柄、块茎 进行接种时，块茎诱导愈伤组织效率最高( 夏海武等，1 9 9 4 ) 。 1 1 1 2 培养基成分对半夏组织培养的影响 采用m s ，改良w l l i t e 、h 、n 6 四种培养基进行半夏愈伤的诱导，m s 培养基 诱导率最高，3 0 d 达7 4 1 9 ，其次为改良w h i t e 和h 培养基，最低的是n 6 ( 苏新， 1 9 8 9 ) 。研究表明( 万美亮等，1 9 9 5 ：罗光明，2 0 0 0 ) 生长素与细胞分裂素的浓度配比 合适与否是影响组织培养的一个重要因素，生长素和细胞分裂素的适当配合对诱导 愈伤组织有增效作用，生长素诱导愈伤组织的能力较强，以2 ，4 d 为最，n a a 次之。 在m s 液体培养基中添加0 2 5 m g l 的2 ，4 d 和0 2 5 m g lk 7 对半夏鲜重增殖率的提 高最为适宜，其中2 ，4 d 的至关重要( 唐琼莲，1 9 9 8 ) 。愈伤组织可以在不含激素的 m s 固体培养基上可一步分化成小植株，在液体培养基中震荡培养可形成大量小块 茎( 张苏锋等，1 9 9 8 ) 。另外，研究发现在半夏成熟叶片的初代培养中，0 2 5 0 5 的活性炭对材料褐变有抑制作用，活性炭的加入促进试管苗根的伸长，0 0 5 0 2 5 的活性炭能降低半夏玻璃化苗率，1 的活性炭则对苗的生长有抑制( 赵月玲等， 1 9 9 9 ) 。 1 1 1 3 半夏试管块茎诱导 在半夏愈伤组织培养上，愈伤组织长期继代培养，会出现遗传上的不稳定性和 变异性，如染色体加倍现象。愈伤组织的遗传变异，造成再生植株相应地在遗传组 成上的不一致性，从而导致组培苗品质退化( 毛子成等，2 0 0 3 ) 。此现象在掌叶半夏 中也有报道( 李亮亮等，1 9 9 8 ) 。1 9 9 1 年朱忠荣等( 1 9 9 1 ) 首次报道，叶柄和块茎切块在 培养过程中不出现明显的愈伤组织，而是直接从外植体表面产生多个球状体，然后 由球状体上方长绿芽，下方长出根。李光胜( 李光胜等，1 9 9 2 ) 等以块茎、珠芽经2 3 周可长出许多圆形粒状物，该过程无明显的脱分化组织，以及何奕昆等( 1 9 9 4 ) 用叶 3 华中农业大学硕士学位论文 柄在分化培养基上可直接产生小块茎或小鳞茎，进而分化出完整植株。薛建平等 ( 2 0 0 4 ) 以叶片、叶柄等材料为外植体，不经过愈伤组织阶段，直接诱导形成试管块 茎的试验，并研究了不同因素对由半夏外植体直接诱导形成小块茎的影响，其实验 表明，( 1 ) 植物生长物质对半夏叶片和叶柄直接诱导小块茎有重要影响。细胞分裂素 类( 6 b a ) 优于激动素( k t ) ，但浓度也不宜过高，高浓度的6 - b a 虽然使外植体形 成较多小块茎，但形成的小块茎容易在试管内发芽。生长素浓度不宜过高，高浓度 生长素不但会抑制块茎的形成，而且易使叶柄和叶片形成愈伤组织，在无l 认的培 养基中外植体也能形成小块茎，但数量少且诱导时间较长，n a a 易使外植体愈伤化， 不利于块茎的直接诱导。k t 和g a 3 也不适宜小块茎的直接诱导。( 2 ) 不同种类的糖 对叶片、叶柄直接诱导块茎也有影响，蔗糖对叶片诱导块茎效果较佳，葡萄糖对叶 柄诱导效果较佳。( 3 ) 光照对外植体诱导块茎和生长也起着促进作用，主要因叶片的 光合作用所产生的次生代谢产物对块茎的形成有促进作用。( 4 ) 叶柄的放置情况对块 茎诱导的影响将半夏叶柄倒置、正置和水平放置于培养基中发现，倒置培养的形态 学下端膨大长出1 2 个绿色球状小块茎， 学下端在接触培养基处长出数个小块茎， 而形态学上端不长块茎，正置培养的形态 另一端极少长块茎，水平放置的叶柄膨大 早，且有些两端都长块茎，一端大一端小。在薛建平等( 2 0 0 4 ) 的多因素正交实验中 表明：c h ( 水解酪蛋白) ，m e t ( 多效唑) ，6 b a ，n a ，a c ( 活性炭) ，p e g ( 聚7 , - - 醇) ， 蔗糖浓度，葡萄糖浓度对半夏的叶片，叶柄，块茎分化形成小块茎均有影响。钾盐 对半夏分化形成块茎也有促进作用f 薛建平等，2 0 0 6 ) 。 综上所述，目前对半夏组织细胞培养的研究已取得较多成果，但也存在很多问 题有待于更深入的研究。利用激素进行诱导产生再生植株的技术已很成熟，而这种 方法很少能定向培育变异植株并使其向着确定基因型的方向发育，所以在以后的研 究工作中，在基础的组织细胞培养方法上结合物理技术条件和现代分子生物学的方 法和技术，如射线诱变和基因工程等方法改变其遗传性状，以获得生长效率高、有 效成分含量高的新型再生半夏植株。 1 1 2 生长物质对试管块茎形成的调节作用的研究进展 半夏、马铃薯、山药、菊芋等，在生长到一定阶段后，地下部分会产生块茎， 是植物的贮藏器官、繁殖器官，也是人类主要的食用或药用部分。这些植物的特定 组织在适宜的光照、温度等