（植物学专业论文）细胞质膜质子泵在拟南芥花粉萌发过程中的作用.pdf

学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文细胞质膜质子泵在拟南芥花粉萌发过程 中的作用，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 学位论文原创性确认书 学孛丝：! 商所提交的学位论文细胞质膜质子泵在拟南芥花 粉萌发过程中的作用，是在本人的指导下，由其独立进行研究工作 所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，该论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 指导竺师c 黔，气息嵴 2 岬年6 月日 “。 河j 七师范人学硕十学伊论文 中文摘要 花粉萌发和花粉管生长的调控是植物发育生物学中的关键问题之一。花粉细 胞质膜上存在质子泵，由其活化导致的h + 外流可以影响细胞膜电位，引发一系列 信号转导过程。为了探索花粉细胞质膜质子泵在花粉萌发和花粉管生长过程中的 作用及其可能的作用机理，本文以拟南芥花粉为材料，采用常规植物生理学方法 和数字荧光比率测定技术，利用细胞质膜质子泵特异性激活剂壳梭孢菌素和抑制 剂钒酸钠对花粉细胞进行处理，对质子泵活性调节剂在花粉萌发、花粉管生长及 细胞内钙离子浓度等方面的影响进行了研究。 实验结果表明，质膜质子泵特异性激活剂壳梭孢菌素处理后，花粉的萌发率 升高，花粉管长度也有明显增加，而其抑制剂钒酸钠处理后，花粉萌发率降低， 花粉管长度较对照减小。壳梭孢菌素处理后花粉细胞内钙离子浓度总体呈现上升 趋势，钒酸钠处理后细胞内钙离子浓度总体呈现下降趋势。实验结果说明，花粉 细胞质膜质子泵在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥重要的j 下向调控作用，这一 作用有可能是通过促进细胞内钙离子浓度升高和钙信号的产生实现的。 异三聚体g 蛋白在跨膜信号转导过程中发挥重要的调控作用，为探究花粉萌 发和花粉管生长调控过程中是否通过异三聚体g 蛋白将胞外信号转换为胞内信 号，花粉细胞质膜质子泵和异三聚体g 蛋白的关系，本实验采用野生型拟南芥、 g 蛋白缺失突变体和超表达株系为材料，对不同基因型花粉在质子泵激活剂和抑 制剂处理后花粉萌发、花粉管生长和细胞内钙离子变化的差异进行了检测和比较。 实验结果表明，野生型、缺失突变体和超表达株系在质子泵激活剂、抑制剂处理 后花粉萌发、花粉管生长和钙离子浓度变化上没有明显差别。推测异三聚体g 蛋 白在花粉细胞信号转导过程中可能存在于质子泵的上游，也可能与质子泵没有直 接关系。 关键词：拟南芥花粉细胞质子泵钙离子异三聚体g 蛋白壳梭孢菌素钒酸钠 3 河北师范人。f 硕十学位论文 a b s t r a c t t h er e g u l a t i o no f p o l l e ng e r m i n a t i o na n dt u b eg r o w t hi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tq u e s t i o n s o fp l a n td e v e l o p m e n t a c t i v ep r o t o np u m p0 1 1t h ep o l l e ng r a i nm e m b r a n ed r i v e sh + e l t l u x h y p e r p o l a r i z et h em e m b r a n ea n dt r i g g e r ss i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n i nt h i sp a p e r , p h a r m a c o l o g i c a la n d f l u o r e s c e n c er a t i op h o t o m e t r yw a $ a p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fp r o t o np u m pa c t i v a t o r f u s i c o c c i na n di n h i b i t o rs o d i u mv a n a d a t eo na r a b i d o p s i sp o l l e ng e r m i n a t i o na n dc y t o s o l i cc a l c i u m c o n c e n t r a t i o ni np o l l e nc e l l s t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tp o l l e ng e r m i n a t i o np e r c e n t a g ea n dt u b el e n g t ho f p o l l e nw h i c ht r e a t e d 谢t l if n s i c o c c i ni sh i g i l e ra n dl o n g e rt h a nt h a to f c o n t r o l ，w h i l ep o l l e nt r e a t e dw i t hs o d i u mv a n a d a t e h a sl o w e rg e r m i n a t i o np e r c e n t a g ea n ds h o r t e rt u b el e n g t hc o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 a f t e rt r e a t e db y f u s i c o c c i n rm o s to f t h ep o l l e np r e s e n ta l li n c r e a s eo f c y l o s o l i cc a l c i u m ，w h i l es o d i u mv a n a d a t el e a d t oam a i nt r e n do fd e c r e a s eo fc y t o s o l i cc a l c i u m r e s u l t si n d i c a t ep r o t o np u m pm a ys t i m u l a t e p o l l e ng e r m i n a t i o na n dt u b eg r o w t hb yp r o m o t i n gc y t o s o l i cc a l c i u ma r o s ea n dc a l c i u ms i g n a l i n g h e t e m t r i m e r i cg p r o t e i n sp l a ya nc r u c i a lr o l ei nm a n yt r a n s m e m b r a n es i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n s t h egp r o t e i nn u l lm u t a n t 、gp r o t e i no v e r - e x p r e s s i o nl i n ea n dw sw a su s e di nt h ee x p e r i m e n tt o c o m p a r et h er e s u l to fd i f f e n e n tg e n o t y p et h a tr e s p o n s et of n s i c o c c i na n ds o d i u mv a n a d a t e n o a p p a r e n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e d i np o l l e ng e r m i n a t i o n 、t u b el e n g t ha n dc y t o s o l i cc a l c i u mb e t w e e n p o l l e n st r e a t e dw i t hf u s i c o c c i no rs o d i u mv a n a d a t eo fd i f f e n e n tg e n o t y p e s t h i s r e s u l ti m p l y h e t e r o t f i m e r i cgp r o t e i n sm a yb eau p s t r e a mr e g u l a t o ro f p r o t o np u m po ro fb od i r e c tr e l a t i o nt o p r o t o np u m p k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，p o l l e n , p r o t o np u m p ，c 3 q o s o l i cc a l c i u mc o n c e n t r a t i o n ， h e t e r o t r i m e r i cgp r o t e i n ，f n s i c o c c i n ，s o d i u mv a n a d a t e 4 河北师范人学硕十学位论文 文献综述 植物质膜质子泵研究进展 自1 9 7 2 年h o d g e s 等首先以纯化的质膜微囊为材料证实p 旷一a t p a s e 具有膜 结合的a t p a s e 水解活力之后，人们又相继发现在a t p 的水解过程中伴有h + 的跨 膜转运。植物中的h + - a t p a s e 在功能上类似于动物中的n a + k + a t p a s e ，负责建 立和维持电化学梯度。近二十年来，对植物质子泵在分子水平上的分析鉴定已取 得了很大进步。植物细胞内的质子泵分为三类：一类位于原生质膜上，称为 p - h + - a t p a s e ，另外两类是主要位于液泡膜上的v - h + - a t p a s e 与v - h + - p p a s e 。质 子泵把质子从膜的- - t m j j 泵到另一侧，使膜的一侧酸化，产生a l a h + 和v 即质子电 化学梯度，为其它各种离子及代谢产物的次级转运提供动力。 1 1 质子泵结构及催化机制 质膜l - i + - a t p a s e 的分子量为1 0 0 k d ，由一条多肽链组成，氨基酸链卷曲成n 螺旋，是一种跨膜1 0 次的蛋白质。该蛋白有1 0 个跨膜螺旋区，c 、n 两个末端 均在胞质内侧，跨膜区通过外表面非极性氨基酸残基插入磷脂膜中。现有的证据 表明质膜h + - a t p a s e 有单体和二聚体两种状态，每种状态都有活性( m i c h a e l 等， 1 9 9 9 ) 。c 术端是自我抑制区，能够控制酶的活力，n 末端作用尚不清楚，可能具 有维护酶结构的作用。该酶具有三个结构域( s e r r a n o 等，1 9 8 9 ) ：磷酸酶结构域、 转导结构域和激酶结构域。激酶结构域上有a t p 结合区，位于第四个跨膜螺旋和 第五个跨膜螺旋之间，包含所有p 型磷酸酶所共有的结构和一些高度保守的模块， 河北师范人学硕十学位论文 使酶磷酸化；转导结构域功能尚不清楚；磷酸酶结构域的作用是使酶去磷酸化。 a r a v i n d 等( 1 9 9 8 ) 推测该酶由一个膜结合的通透性酶与一个类似磷酸酶的可 溶性a t p 水解酶融合进化丽来。p h + - a t p a s e 结合a t p 位点的结构特点使这类酶 与其他h + 泵区别丌来，并暗示他们以一种完全不同的机制起作用( m i c h a e l 等， 1 9 9 9 ) 。该酶有e i 和e 2 两种构象，催化时两种构象| 日j 互相转变( 图1 1 ) 。e l 状态 时，离子运输位点在膜的胞质侧，可被m g z + a t p a s e 可逆磷酸化，但不被p i 磷酸 化；e 2 状态时，离子运输位点在膜外侧，可被p i 磷酸化，但不被m 9 2 + - a t p a s e 磷酸化( m i c h a e l 等，1 9 9 9 ) 。e 1 e 2 的这种转变是a t p 水解和离子运输偶联的基 础，目前对该酶水解a t p 与质子运输偶联的机制尚不清楚。b r i s k i n 等( 1 9 9 0 ) 提 出了关于此机制的假设：e l 构象的蛋白激酶结合阳离子后被激活，消耗a t p ，形 成e ip h 3 + o 复合物，然后酶被磷酸化，形成磷酸化中问产物，e 构象转变为e 2 构象，接着e 2 构象的酶失活，磷酸酶活化释放h + ，水解去掉p i ，h + 即被运到胞 外。 图1 1 质膜h + - a t p a s e 两种构象的循环( 自m i c h a e l ，1 9 9 9 ) 1 2 分子生物学研究 质膜h + - a t p a s e 是由多基因家族编码的，酶存在多种异型( i s o f o r m ) 。已经 发现拟南芥有1 1 个h + - a t p a s e 基因，番茄中有7 个( h a r p e r 等，1 9 9 4 ) 。关于 h + a t p a s e 存在多种异型的原因，现在有三种假说：( 1 ) 唯一酶活性模型：不同 的异型功能不同，每种都有不同的生化特性( p a l m g r e n 和c h r i s t e n s e n ，1 9 9 4 ) ：( 2 ) 6 河北师范人学硕十学位论文 组织特异性表达模型：酶的异型在不同细胞中表达，每个异型都由独立的启动子 控制，根据细胞特殊需要得到最适表达水平；( 3 ) 遗传冗余模型：功能冗余的异 型源于基因复制。除第三种模型需要对各种缺失突变体的表型进行全面分析之外， 其余两种模型都已被大量实验所证实。 现已从烟草、拟南芥、燕麦、番茄等材料中得到了质膜h + - a t p a s e 的e d n a 克隆。e w i n g 等( 1 9 9 0 ) 从番茄中分离的编码该酶的两种e d n a 克隆一三删，和 l h a 2 ，二者编码的蛋白有9 6 的同源性。b o u n t r y 等( 1 9 8 9 ) 分离得到的蓝雪叶 烟草e d n a 克隆编码的多肤经同源性分析发现与燕麦p h + a t p a s e 的氨基酸序列 有7 3 的同源性。焦新之等( 1 9 9 3 ) 得到的水稻e d n a 克隆编码的氨基酸序列与 已发表的高等植物p h + - a t p a s e 的氨基酸序列有7 8 同源性。 1 3 生化特性 质膜h + - a t p a s e 的活性依赖m 矿+ 并受k + 激活，最适p h 值为6 5 ，钒酸钠、 d c c d ( 二环己碳二亚胺) 、d e s ( 乙烯雌酚) 和曙红b 均可抑制该酶活性。然而 n a n 3 、寡霉素( 线粒体和叶绿体质膜a t p a s e 抑制剂) 、硝酸钠( 液泡膜a t p a s e 抑制剂) 和铝酸钠( 非特异性磷酸酶抑制剂) 却不能抑制该酶活性( b r i s k i n ，1 9 9 0 ； a r a v i n d 等，1 9 9 8 ；m i c h a e l 等，1 9 9 9 ) 。钒酸根离子是质膜a t p a s e 的专一性抑 制剂，通过与磷酸竞争性结合在e 2 上，强烈抑制a t p a s e 的水解活性。p a l m g r e n 和 c h r i s t e n s e n 研究证明不同异型的生化性质也不尽相同，比如在对a t p 的亲和力方 面，不同的异型阃有所差异( 1 9 9 4 ) 。 1 4 质子泵的调节 1 4 1 自我抑制的调节 7 河北师范人学硕十学位论文 p 类型a t p a s e 具有被自我抑制区或抑制亚基调节的特点( p a l m g r e n 和 a x e l s e n ，1 9 9 8 ) 。这些酶或者在空| 日j 上阻碍a t p 接近a t p 结合位点，或阻碍离子 接近离子通道区域，或者改变酶中心结构，降低酶与底物f b j 的亲和力，或限制酶 催化反应所必需的构象改变。无论哪种情况，自我抑制机制负责调节酶活性状态 与失活状态的动态平衡。 植物质膜质子泵的c 末端是自抑制区，该区的保守氨基酸序列( 8 6 0 - - 8 8 8 ) 合成一段肽键抑制蛋白酶对h + - a t p a s e 的活化( p a l m g e m ，1 9 9 1 ) ，自我抑制区的解 除可以提高酶活力( b u c h a n a n 等，2 0 0 2 ；p a l m g e m ，1 9 9 1 ；p a l m g r e n 等，1 9 9 0 ) 。 p a l m g r e n 等( 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ) 认为旷一a t p a s e 的c - 末端自我抑制结构域可能有以 下三种调节机制：( 1 ) 蛋白酶水解c 末端；( 2 ) 通过磷酸激酶磷酸化调节；( 3 ) c 末端与效应物结合使c 木端失去自抑制功能( b r i s k i n ，1 9 9 0 ) 。胰蛋白酶或胰 凝乳蛋白酶水解质膜质子泵后释放c 一末端7 k d 的片断，大幅度提高了酶活性 ( h e l l e r g e n 等，1 9 8 7 ；p a l m g r e n ，1 9 9 1 ) 。将在酵母中表达的a h a 2 酶c 一术端6 6 个残基去掉后使酶有活性，也进一步证实了c 末端的自我抑制作用。若质膜质子 泵c 末端被酶部分水解，泵的活性高于a t p 水解活性，推断质子泵的抑制区与 矿结合位点问存在互相作用( p a l m g r e n 等，1 9 9 0 ；1 9 9 1 ) 。p - h + a t p a s e 的c 一末 端单点突变也可以提高酶活性，说明也许酶有活性和失活之j 1 自j 的切换只涉及到一 个氨基酸的变化( b a u n s g a a r d 等，1 9 9 6 ；m o r s o m m e 等，1 9 9 6 ，1 9 9 8 ；a x e l s e n 等，1 9 9 9 ) 。已有一些研究表明p h + - a t p a s e 受磷酸化调节( s u s s m a n ，1 9 9 4 ) ，酶 分子中某一个位点的磷酸化或去磷酸化都足以改变质子泵的活性，具体哪个氨基 酸位点会改变酶的活性还缺乏分子生物学证据。有文献报道与h + - a t p a s e 同属p 型a t p a s e 的c a 2 + a t p a s ec 末端也有一段自抑制区( r a s i - - c a l d o g n 等，1 9 9 3 ， 1 9 9 5 ) ，推测二者可能具有相似的调节机制。 1 4 21 4 3 - 3 蛋白的调节 8 河j e 师范人学硕十学位论文 通过序列对比发现植物质子泵c 末端比真菌的质子泵要长出许多，认为陔区 含有一个调节蛋白的结合位点( l a i l 航l 叫c r 等，1 9 9 5 ) 。从壳梭孢菌素( f u s i c o c c i n ， f c ) 处理过的植物匀浆中分离纯化p - h + - a t p a s e 的同时也得到了1 4 3 3 蛋白，该 蛋白是真核生物信号转导的重要成分，可调节很多酶的活性( a i t k e n ，1 9 9 6 ： p a l m g r e n 和a x e l s e n ，1 9 9 8 ) ，该蛋白可能以某种方式调节质膜h + - a t p a s e 活性。 当壳梭孢菌素存在时，a h a 2 在体外可被1 4 3 3 蛋白激活，使a h a 2 处于e i 状 态，具有与截去c 端时相同的特征。 l 禾3 3 蛋白呈l 型，并形成二聚物，每个单体都有一个保守的凹槽来结合目 的序列( l i u 等，1 9 9 5 ：x i a o 等，1 9 9 5 ) 。二聚物能同时结合2 个目的序列。说明 该蛋白通过在同一个蛋白上同时结合2 个目的序列，类似夹子一样使酶处于活性 构象或失活构象来调节酶活性( a i t k e n ，1 9 9 6 ：y a f r e 等，1 9 9 7 ) 。多数情况下， l 禾3 ，3 蛋白结合序列都含有一个磷酸化的丝氨酸或苏氨酸。最近结果表明，a h a 2 的c 末端酪氨酸一9 4 6 ，可被1 4 3 3 蛋白识别，与此相邻的苏氨酸一9 4 7 是蛋白激酶 的修饰位点，因此，磷酸化去磷酸化可以引起包含1 4 3 3 蛋白在内的调节质膜 h + - a t p a s e 活性的机制。 在壳梭孢菌素存在时，1 4 3 3 蛋白与酶结合并激活酶活性。没有壳梭孢菌素 时，蛋白激酶使酶磷酸化后结合1 4 3 - 3 蛋白，加入壳梭孢菌素后使结合量显著增 加。说明壳梭孢菌素诱导并稳定酶与1 4 3 3 蛋白结合，即使酶没有磷酸化。壳梭 孢菌素只是与质膜上的特殊受体结合( 包括p 旷- a t p a s e 和1 4 3 3 蛋白，而不单 独与酶或1 4 3 3 蛋白结合。酶中至少一个残基的磷酸化对酶结合1 4 - 3 3 蛋白是必 需的，这种需求可被壳梭孢菌素所补偿，也就是晚壳梭孢菌素使酶绕丌磷酸化方 式与1 4 3 3 蛋白结合。 研究证明酶c 末端最后三个氨基酸残基是依赖于壳梭孢菌素的1 4 3 3 蛋白 结合所必需的，删除后导致酶不与壳梭孢菌素结合，不与1 4 3 3 蛋白结合，不受 9 河北师范人学硕 学位论文 1 4 3 3 蛋白激活。研究还发现酶c 未端1 4 3 3 蛋白结合位点与1 4 3 3 蛋白没有相 应的结构上的关系，却含有一个可结合1 4 3 3 蛋白的特殊糖蛋白：i b 。而且酶上 还有苏丝氨酸可被磷酸化，现推测磷酸化发生在结合l 3 蛋白之前，虽然也有 文献支持去磷酸化激活酶活性，但是还缺乏足够证据。 1 4 3 蛋白激酶调节 质膜h + a t p a s e 上有蛋白激酶的作用位点，在体内、体外均可以被膜结合的 蛋白激酶磷酸化，还可以被碱性多肽、c a 2 + 、d g ( 二酰基甘油) 等介导的蛋白激 酶磷酸化。对该酶的研究发现酶中有磷酸化的丝氨酸和苏氨酸，因此推测磷酸化 该酶的蛋白激酶可能属于丝氨酸，苏氨酸激酶类型( s e r r a n o ，1 9 8 9 ) 。 凡是能影响蛋白激酶的因素如c a 2 + 、p h 值等都会影响到质膜h + - a t p a s e 的活 性。k n o s h i t a 等( 1 9 9 5 ) 已证明生理水平的钙明显抑制该酶水解和转运质子的 活力。跨膜c a 2 + 浓度调节p h + - a t p a s e 水解a t p 与转运质子的偶联( 邱全胜等， 1 9 9 7 ) 。z o c c h i g ( 1 9 8 5 ) 认为c a m 通过信号转导对p - 旷- a t p a s e 活性起间接调 控作用( w a t i l l o n 等，1 9 9 2 ，1 9 9 3 ) 。 1 4 4 激素调节 生长素( i a a ) 、细胞分裂素( c t k ) 和油菜内酯等都对质膜h + - a t p a s e 有激 活作用( s e r r a n o ，1 9 8 8 ，1 9 8 9 ；a t a l b e l l a 等，1 9 9 0 ) ，而a b a 起抑制作用。壳梭 孢菌素、管霉素( s y r i n g om y c i n ) 、丁香霉素等由植物病原菌产生的植物毒素对质 膜h + - a t p a s e 也有刺激作用。d eb o e r 在1 9 9 7 年报道了在活体内壳梭孢菌素可以 激活质膜质子泵。 由短信号引起的快速响应往往是由翻译后酶活性状态和非活性状态之问的转 换来调节的。壳梭孢菌素加入几分钟后即可观察到泵h + 活性的增加。壳梭孢菌素 可以迅速激活翻译后的h + - a t p a s e ，类似于生长素的效应，如壳梭孢菌素与生长 素都诱导细胞壁酸化，胚芽鞘伸长( h e v e n 等，1 9 9 9 ) 。 0 河北师范人学硕十学伊论文 生长素明显刺激p h + - a t p a s e 的合成和含有该酶的分泌小泡与质膜的融合 ( h a g e r 等，1 9 9 1 ) 。用生长素处理玉米胚芽鞘，非维管束组织m h a 2 ( 玉米质膜 h + - a t p a s e 的一种异型) m r n a 有2 3 倍的增长，蛋白量也有所升高；而维管 组织却对生长素不敏感( f r i a s 等，1 9 9 6 ) 。以上结果说明质膜质子泵的转录和翻 译只在响应细胞中受生长素诱导增强。 1 4 5 基因表达调节 不同器官，组织依其发育分化情况、空问位置、功能、代谢活力和环境条件 的不同，其质子泵基因的表达也有明显不同的变化( 杨明峰等，2 0 0 2 ) ，甚至是同 一细胞内的表达也有差异，振荡电极和免疫组化检测证据表明花粉细胞质膜上有 质子泵丰富表达，然而在花粉尖端区域例外，不表达或仅微量表达( w e i s e n s e e l 和j a f f e ，1 9 7 6 ：f d j 6 等，1 9 9 2 ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ；o b e r m e y e r 等，1 9 9 2 ) 。另外质子 泵基因表达的调控，还表现在转录、翻译和翻译后水平的调节上。 1 4 5 1 质子泵基因表达的组织特异性、发育阶段特异性 质膜h + - a t p a s e 包括其异型的基因表达具有组织特异性( m i c h e l e t ，1 9 9 5 ) ， 经常在可能发生转运活性较高的细胞中有较高的表达水平( m i c h a d 等，1 9 9 9 ) 。拟 南芥中的a h a 和烟草中的p e n a l 基因表达就体现了高度的组织特异性。在营养器 官中，a h a 在植物根、茎和叶的韧皮部表达，p e n a l 则在根的表皮及茎、叶的保 卫细胞中表达；在生殖器官中，a h a 在韧皮部、花粉、种子的珠柄、珠孔、合点 处表达，p e n a l 在绒毡层、花粉粒、花粉管、花柱引导组织细胞及胎座韧皮部表达。 通常一个植物细胞约有1 0 6 个质膜质子泵酶分子( 即1 0 4 个o m 之) ，而根和内皮层 细胞中含量更高，与根的离子选择吸收和盐胁迫下根的拒n a + 功能相适应( b r o n w 等，1 9 9 6 ) 。质子泵基因表达受发育阶段的调控( m c h e l e t ，1 9 9 5 ) ，如p e n a l 主要 在幼苗子叶、茎的保卫细胞和发育着的果实韧皮部中表达。 1 4 5 2 翻译后调节及其它类型基因表达调节 河北师范人学硕十学位沦文 翻译后水平调节主要是磷酸化的形式( s e r r a n o ，1 9 8 9 ；m c h e l e t ，1 9 9 5 ； p a l m g r e n ，1 9 9 1 ) 。h + - a t p a s e 上有蛋白激酶的作用位点，在体内体、体外均可以 被膜结合蛋白激酶磷酸化，也可以被碱性多肽、c a + 、d g ( 二酰基甘油) 等介导 的蛋白激酶磷酸化。研究发现该p - h + - a t p a s e 中有磷酸化的丝氨酸和苏氨酸，因 此推测磷酸化h + a t p a s e 的蛋白激酶可能属于丝氨酸苏氨酸激酶类型( s e r r a n o ， 1 9 8 9 ) 。 某些j 下常条件下检测不到的基因，受到胁迫后基因表达会明显增加。细胞内 膜系统的活力和膜上酶的浓度也会影响基因表达( h e v e n 等，1 9 9 9 ) 。 1 4 6 环境因子等其它因素的调节 环境因子包括光、膨压、机械损伤、冷、热、干旱、盐、缺氧、射线等，其 中冷、干旱、盐、缺氧的调节在对逆境的响应中有详细叙述。 光诱导气孔丌放是以促进保卫细胞质子泵为基础的( p a l m g r e n ，1 9 9 1 ) 。 a s s m a n n 等( 1 9 8 5 ) 发现在蓝光刺激蚕豆叶片气孔丌放中，蓝光刺激气孔丌放的 时间历程与蓝光激活保卫细胞质膜质子泵的时i b j 历程一致，质子泵的抑制剂钒酸 钠对此有抑制作用，表明蓝光调节气孔开放确实是通过调节质膜质子泵实现的。 r e i n h o l d 等( 1 9 8 4 ) 认为渗透压是调节质子泵活性的关键因子，植物受逆境 胁迫时，膨压降低刺激质子泵活性，激活与渗透调节相关的生理反应。对 h + - a = r p a s e 的研究揭示了在细胞膨胀期间质膜和液泡膜质子泵的协同调节。 除了光和渗透压可以调控质子泵活性外，膜流动性，厚度及磷脂组成等均可 以调控质膜h + a t p a s e 的活性( b r i s k i n ，1 9 9 0 ：p a l m g r e n ，1 9 9 1 ；c o o k e 等，1 9 9 0 ) 。 l a 3 + 低水平可增强质膜质子泵活性，高浓度抑制质子泵活性。l a 3 十对p - h + - a t p a s e 活性影响的可能机制之一为l a 3 + 作为效应物与c 末端结合，解除自抑制；或是首 先与质膜上磷脂部分结合( 蔡继宝等，2 0 0 1 ) ，其结合物再作为信使促使质子泵解 除c 术端自抑制，使酶活化。 1 2 河北师范人学硕十学位论文 1 5 生理功能 1 5 1 建立跨膜质子电化学势 将质子从质膜的内侧泵到外侧，产生和维持质膜( 1 2 0 一1 6 0 m v ) 的跨膜 电化学梯度，又称为质子驱动力( p r o t o nm o t i v ef o r c e ，p m f ) ，为其它各种离子及 代谢产物的次级运输提供动力。根的木质部、叶的韧皮部中无机营养物和有机营 养物的装载都由该酶控制。细胞生长所需要的营养物质和离子的次级转运( 如离 子通道、载体等) 均依赖p m f 。在质子驱动力存在时，c a 2 + h + 反向转运系统在理 论上可驱动c a 2 + 逆浓度梯度运输，实际上钙从胞质外流也确实可以由质子驱动力 提供能量的泵来调节( d a l es a n d e r s 等，1 9 9 9 ) 。通常认为高亲和k + 运输由膜上载 体完成，直接依赖初级主动转运体( h + - a t p a s e 等) 建立的质子梯度，但 p - h + - a t p a s e 可能只通过调节质膜电化学势调控c 跨膜转运，目前还没有关于 p h + a t p a s e 催化k + 直接运输的证据( b r i s k i n ，1 9 8 6 ，1 9 9 0 ，1 9 9 6 ) 。 1 5 2 稳定细胞p i t 值 质子泵维持细胞内，特别是胞质p h 值的稳定，为细胞内各项生理生化反应 的正常进行提供保证。y o u n g 等( 1 9 9 8 ) 证明h + - a t p a s e 的异型a h a 3 在调节胞 质p h 值方面起作用，使细胞具有抗酸性。 1 5 3 控制细胞伸长生长 酸生长理论( a c i dg r o w t ht h e o r y ) ，认为质膜h + - a t p a s e 将h + 由胞内泵到细 胞壁，导致细胞壁内表面酸化，p h 值下降，激活细胞壁内松弛氢键的蛋白质，细 胞塑性增加，产生膨胀生长( b u c h a n a n 等，2 0 0 2 ；李连朝等，1 9 9 6 ) ，因此质膜 质子泵对植物的生长有着直接的贡献。 1 5 4 生物能的保存 a t p 被a t p a s e 水解后，只能以热量的形式释放自由能。如果是被质子泵水 河北师范人中硕t ：学位论文 解，能量就会以质子驱动力的方式保存，减少对a t p 的消耗，提高细胞能荷。 1 5 5 其他功能 质膜主要通过各种通道、单向转运体进行同向转运，液泡膜主要依靠反向转 运体，参与泵运矿质离子进入胞质或液泡，调节细胞膨压，参与气孔丌闭和叶枕， 叶柄运动以及通过改变胞内p h 值打破休眠，控制萌发。 质膜质子泵可能参与根、根毛、花粉管、真菌菌丝和藻类假根的生长发育及 器官的极性生长( s e r r a n o ，1 9 8 9 ：m c h e l e t 和b o u t r y ，1 9 9 5 ) 。w h i t n e y 等( 2 0 0 4 ) 遗传学实验表明拟南芥a h a 3 基因的存在对花粉的形成起决定性作用。f e i j 6 等 ( 1 9 9 9 ) 实验证明生长着的花粉管尖端与钙梯度一样也存在一个质子梯度一酸顶 点，酸顶点的存在与花粉管的生长密切相关，而花粉中的质子梯度是由h + - a t p a s e 决定的，所以质子泵也参与了花粉管生长的调控( s z e ，1 9 8 5 ：a i - - a w q a f i ，1 9 8 6 ： b f i s k i n 和h a n s o n ，1 9 9 2 ) 。除此之外，h + 还能像c a 2 + 一样参与转换化学或环境信 号( h e v e n 等，1 9 9 9 ) ，在植物抗逆方面也起到了很重要的作用。有关抗逆的作用， 下面将会详细叙述。 1 6 对逆境的响应 1 6 1 盐胁迫 质子泵通过减少或避免细胞质内盐浓度过高而在植物耐盐性中起作用( 王宝 山等，1 9 9 6 ) 。盐胁迫下，一方面质膜h + - a t p a s e 为n a + n + 反向转运体提供能量， 将n a + 排到细胞外，防止n a + 离子在体内过多积累( l u n g e 和r a t a j c z a k ，1 9 9 7 ) ； 另一方面液泡膜质子泵也向n a + h + 反向转运体提供质子驱动力，将n a + 泵入液泡 ( g a b a r i n o ，1 9 8 8 ；b a r k l a ，1 9 9 5 ；b a l l e s t e r o s 等，1 9 9 7 ) ，既减轻了n a + 对细胞的 伤害，降低了液泡渗透势，也为细胞j 下常代谢提供了一定的k + n a + 环境。 n a c i 可以调节质子泵的基因表达。b a r k l a 等实验证明n a c l 调节了 1 4 河北师范人学硕十学仿论文 p - h + - a t p a s e 和v - a t p a s e 的基因表达( b a r k l a 等，1 9 9 6 ；l u t t g e 和r a t a j c z a k ，1 9 9 7 ) 。 质膜h + a t p a s e 异型a h a 4 在根尖和内皮表达对植物响应盐胁迫是必需的。纯合 a h a 4 ，对n a c i 敏感性显著增加，而且在不同h + - a t p a s e 异型基因敲除中只有 a h a 4 敲除表现出盐敏感，结果显示特定组织的耐盐性依赖于某些特定的质膜质 子泵异型。 g a b b a y - a z a r i a 等发现盐处理使s p i r u l i n as u b s a l s a 的质膜h 玎p a s e 活性提 高，质子泵蛋白含量也明显增加( g a b b a y - a z a r i a 等，1 9 9 4 ) ，与此相反，y a m a s h i t a 和m a t s u m o t o ( 1 9 9 7 ) 发现盐处理后大麦细胞质膜h + - a t p a s e 的活性降低，质子 泵蛋白含量明显减少，n i u 等( 1 9 9 3 ) 发现n a c i 可以诱导烟草、大洋洲滨藜质膜 h + - a t p a s e 的基因表达。这些结果表明盐处理可能会调节基因表达或蛋白质的合 成，通过改变细胞质膜上h + - a t p a s e 分子的数量调节其活性。最近研究证明，盐 胁迫可能通过与c 末端相关的机制激活质膜h + - a t p a s e ( w u 和s e l i s k a r ，1 9 9 8 ) 。 c h u n g 和m a t s u m o t o ( 1 9 8 9 ) 的实验发现盐处理对黄瓜酶蛋白量无影响却使酶活 性降低，由此认为质膜h + - a t p a s e 活性还应受其他因素调控，如n a c l 影响c a 2 + 浓度和磷脂变化( m a t s u m o t o ，1 9 9 8 ) 或使膜透性增加、改变脂肪酸组分( 薛刚 和高峻风，1 9 9 1 ) ，或引起该酶构象变化( k u i p e r 等，1 9 8 0 ) ，致使酶活性降低。 1 6 2 干旱胁迫 一般认为，轻微水分胁迫会使质膜h + - a t p a s e 活性下降，随着胁迫加重，质 膜h + - a t p a s e 活性会上升，呈“v ”型变化。轻度胁迫时，不抗旱品种质膜h + - a t p a s e 活性下降的更明显，而抗旱品种酶活性较高( 薛刚等，1 9 9 1 ；吕会印等，1 9 9 6 ： 邵艳军等，2 0 0 0 ) ，反映了植物在逆境中，减少a t p 消耗，维持定能荷储蓄的 机制。水分胁迫对质膜h + - a t p a s e 活性变化的影响与材料、处理强度、时日j 等因 素有关，目前还尚未得出统一结论。 1 6 3 低温胁迫 1 5 河北师范人学硕十学仲论文 低温可以导致细胞质酸化，造成对细胞的伤害，质子泵在冷害胁迫中的作用 尤其重要。植物受冻害最初的损伤部位可能是质膜( l y o n s 等，1 9 7 9 ：p a l t a 和 l i ，1 9 7 8 ) ，使其丧失半透性。低温很容易使质膜h + a t p a s e 活性降低或丧失，轻 度冰冻使茄叶质膜h + - a t p a s e 活性上升约2 倍，严重冰冻胁迫导致酶活性下降 ( i s w a r 和p a l t a ，1 9 8 9 ) ，但也有实验观察到严重冰冻使松针质膜h + - a t p a s e 活性 上升( h e l l e r g e n 等，1 9 8 7 ) ，推测质子泵的在低温下保持活性的能力可能与植物 本身的抗寒能力之间存在某种关系。 1 6 4 酸雨胁迫 中国酸雨属于硫酸型酸阿，硫酸根通过质膜的转运受p m f 驱动，硫酸根和 3 个质子被硫酸根转运蛋白共转运进入胞内，质子内流必然影响胞质p h 稳定。质 子泵活性提高利于缓解胞质酸化，保持酸阿胁迫下内环境的诈常和稳定( y a n g 等， 2 0 0 2 ) 。 1 6 5 热胁迫 质子泵的蛋白质本质决定了温度对其活性有很大影响，所以质子泵抗热能力 有限。低5 0 时，质子泵活性随温度升高而升高，同时膜对质子的通透性也增大； 温度高于5 0 时，膜渗漏严重，质子泵活性迅速衰减。 1 7 信号转导 随着对植物质子泵了解的逐渐加深，及对质子泵功能的更进一步认识，促使 人们去探究质子泵与环境因子的相互作用、内部调控等信号转导的机制。 酸生长理论认为，膜上存在生长素受体，与生长素与受体的结合激活质膜上 的h + - a t p a s e ( s e n n 等，1 9 8 8 ：r u c k 等，1 9 9 3 ) ，诱导膜超极化( h a g e r 等，1 9 9 1 ) 。 生长素结合蛋白( a b p ) 抗体的加入则可以抑制生长素诱导的超极化，a b a 信号 转导研究表明，外源a b a ( 2 p m o l l ) 能促进质子泵活性，因而促进质子蔗糖同 1 6 河北师范人学硕十学侮论文 向运输，使菜豆子叶吸收光合同化物( 黄建中等，1 9 9 6 ) ，也有报道c 兑明a b a 是 一种c a 2 + 激活剂，推测存在一条a b a 调节赫适应的信号通路：盐胁迫使内源a b a 升高，激活质膜g 蛋白，丌放c a 2 + 通道，使胞质c a 2 + 水平升高，激活c a 2 + 依赖蛋 白激酶( c d p k s s ) ，使受c d p k s s 调控的底物发生磷酸化，磷酸化通过蛋白化学 修饰调节蛋白活性，从而改变膜上通道或泵活性，调节胞内离子平衡，使植物适 应外界胁迫( 章文华等，2 0 0 0 ) 。 外界环境刺激可以通过细胞质膜上的信号分子激活质子泵，促进质子外流， 使膜超极化( 如壳梭孢菌素) ，而且膜上还有类似c a 2 + 通道的超极化激活的通道， 这些通道被超极化激活，引起胞内离子浓度变化( s o n d c r g a a r d 等，2 0 0 4 ) 。 2 花粉萌发和花粉管生长的调控 2 1 细胞外信号分子 花粉萌发和花粉管生长是个复杂的生理发育过程，受雌雄两性配予基因型 和胞外信号的控制。胞外信号在花粉萌发和花粉管生长的过程中起着重要的调控 作用。雄性生殖细胞需要感知外界信号，引起细胞内的一系列反应来调控是否萌 发及花粉管的生长方向等问题。胞外信号的感受可能是花粉萌发及花粉管生长调 节的第一步。 2 1 1 胞外钙信号 早在1 9 世纪6 0 年代就有研究表明c a 2 + 在决定细胞壁结构刚性上起重要作 用( w y n 和l u n t ，1 9 6 7 ；b u r s t r o m ，1 9 6 8 ) 。低【c a 2 + 】。会使细胞壁柔软、易破裂， 高水平的 c a 2 + 】e 使细胞壁缺乏可塑性， c a 2 + 】。升高引起对嫩芽和胚芽鞘生长的抑 制，下降时促进细胞和组织的伸长( b e n n e t ，1 9 5 6 ；t a g a w a 和b o n n e t ，1 9 5 7 ) 。 河j e 师范人学硕一t 学何论文 c a 2 + 、细胞壁和细胞生长的相互作用也存在于花粉管中，体外培养基中必须要有 c a ：+ 才能支持花粉管生长，实验还显示培养基中的c a 2 + 会专一的结合在花粉管壁 上( b r e w b a k e r 和k w a c k ，1 9 6 3 ) 。放射自显影表明在花粉管的尖端c a ：+ 积累增加， 花粉管顶端主要由果胶组成，因此，可