（运动人体科学专业论文）低氧运动后不同恢复环境下大鼠腓肠肌hsp70表达的时程变化.pdf

添加个人信 息 睿一 - 毛 亡 京 仲育 大 寸 妞f .j 笼 n . 5 护吸 杏 皿t “ 四 竺一北京体育大学硕士 (毕业 ) 学位论文 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠 排肠肌 hsp7o 表达 的时程变化 t i m e c o u rse o f r at g astro cn em iu s h s p 70 e x p ressio n u n d er d if f eren tial r eco v ery e n v ir o n m en t f o llo w in g a cu te n o rlllo b aric h vd o x ie t read m ill 培养单位 : 北京体育大学 一级学科 : 体 育 学 二级学科 : 运 动人体 科 学 研 究方 向: 运 动生理 学 研究 生: 方卫斌 指导教 师: 周越副教授 二0 0 七年六月十五 日 沦 文随机验初 卜 编 号: 盯6 1丽5 16 1( )5570 北京体 育大学 学位论文版权使用授权书 本人完全 了解学校有关保 留、使用学位论文的规定，同 意学校对本人递交的学位论文 低氧运动后不同恢复环境下 大 鼠胖肠肌 h sp7 0表达 的时程变化保 留并 向国家有关部 门 或机构送交论文 的复印件和 电子版 ，允许在校 内和与学校有 协议 的部 门公布论文并被查阅和借 阅。 本人授权北京体育大学可 以将本学位论文的全部或部分 内容 编入有关数据库进行检索 ，可 以采用影 印、缩 印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 保密 冈，在_年解密后适用本授权书 。 本 学位论文属于 不保密 回。 (请在 以上方框 内打 “了” ) 学 位 论 文 作 者 签 名 :枷 日期 : 二 0 0 七年六 月十 论文 随机验 证编 号 : bt 6 1 55 5 16 105570 北京体育大学学位论文原创性声 明 本人郑重声明: 本人所呈交 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠胖肠肌 h sp7 0表达 的时程变化是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注 明引用的内容外 ，本 论文不包含任何其他个人或集体 己经发表或撰写过 的作品成果 。 对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体 ，均 已在文中以明确方 式标 明并致谢 。本人完全意识到本声明的法律结果 由本人承担 。 _ 、 学 位 论 文 作 者 签 “ :秘方 又 . 日期 : 二 0 0 七年六 月十五 日 论 文 随机验 证 编 号 : bt6 15 5 516105570 低氧运动后不改恢复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达的时程变化 摘要 1 研究 目的 一次性低氧间歇运动后常氧 、 常压低氧(氧含量 1 2 .7% )恢复下大 鼠胖肠肌 hsp7o 及 自由基代谢指标的时程变化 。 2 研究方法 以雄性 s d大 鼠为研究对象， _进行低氧环境下的一次性间歇运动。运动完成后把 大 鼠处于低氧 、常氧两种不同的环境下进行恢复。运动后即刻、恢复 1 天、2 天、 7 天取材 (每组六只 ，n= 6 )进行分析 。 用实时荧光定量 r t 一p c r 检测 hsp70 基 因表达 ; 用 w e ster n blot 检测 hsp70 蛋 白的表达 。检测胖肠肌 自由基代谢指标 。 3 研究结果 3.1 一次性低氧 间歇运动后 即刻大 鼠胖肠肌 中 hsp70 基 因表达显著 高于对照 组 。常氧恢复过程 中，第 1 天基 因表达显著下 降。第 2 天 、第 7 天基 因表达缓 慢上升 。低氧恢复过程 中，第 1 天、第 2 天基因表达上升 ，且显著高于即刻组。 第 7 天基 因表达显著下 降。 3.2 一次性低氧间歇运动后 即刻 hsp70 蛋 白表达水平就开始升高。 常氧恢复第 1 天 hsp7o 蛋 白表达水平显著 高于对 照组 ; 第 2 天 hsp7o 蛋 白表达 出现下 降趋势 ， 到第 7 天又 出现升高的趋势 。 低氧恢 复第 1 天 、第 2 天 、第 7 天 hsp7o 蛋 白表达水平显著 高于对照组 。恢 复 第 2 天 、第 7 天 hsp70 蛋 白表达呈缓慢 的下 降趋 势 。 3.3 一次性低氧 间歇运动后 即刻 md a含 量下 降，t 一so d ，gs h 一p x ，以t ，t 一ao c 活力 都 随之 下 降 。 常氧恢 复第 1 天 ，机体 md a生成量 开始增加 ，同时 t 一so d ，gs h 一p x ，ca t活力 也增加 。第 2 天 ，机体 md a继续增加 ，但是抗氧化酶 t一so d ，gs h 一px，ca t开 始下 降 ，只有 t 一ao c开始上升 。第 7 天 ，机体 md a继续增加 ，t一so d ，t一ao c 也 随之增 加 ，gsh 一px，cat 下 降 。 低氧 恢 复第 1 天 ，机 体 md a生成量显著增加 ，同时 t 一sod ，gsh 一以 ，ca t ，t 一aoc 活 力都增加 。第 2 天 ，机 体 mda 下 降， r一sod，gs卜 i一px ，cat 下 降 ，但 是 t 一aoc 继续上升 。第 7 天 ，机 体 md a下 降到低 于常氧恢 复第 7 天 的水平 ，所 论文随机验证编号 : bt 6 1 5 5 516105570 iv 低氧运动后不同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达的时程变化 有 的抗氧化酶活力都下 降。 4 结论 4.1 一次性低氧间歇运动诱导 hsp70 基因表达与蛋 白表达水平升高。 4.2 低氧恢复下 hsp70 基 因与蛋 白高水平表达维持的时间比常氧恢复要长 。 4.3 低氧恢复下 hsp70 蛋 白表达的时程变化与抗氧化酶活力的时程变化相一致 。 关键词: hsp7o; 自由基 ; 用 卜 肠肌 ; 实时荧光定量 rt一pcr; western 论文 随机验 证 编 号 : bt 6 1 55 5 16 105570 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp 7 o表达的时程变化 a b s t r a c t 1 p u r p o s e 甲 t im e e o u r se o f r a t g a s tr o e n em iu s h s p 7 o e x p r e s s io n a n d in d ex e s o f fr e e radieals metabolism under normoxia，normobarie hypoxia (oxygen eoneentration 15 12.7%) reeovery environment following one single bout o f a eu t e n or m o b a r ie h yp ox ie t r ea dm i l l e x er e i se . 2 m a t er ia ls a n d m e th o d s a du lt m a le s p r a g u e 一 d aw le y r a t s w er e r a n dom ly d iv id ed in t o e ig h t groups (n=6) aeeording to the follow ing independent variables : normoxia eontrol (c) : immediately after one single bout of aeute normobarie hypoxie treadm ill exereise (he) : 1 day (ni)，2 days (nz)，7days (n7) reeovery from normoxia : and 1 day (hl)，2 days (hz)，7days (h7) reeovery from normobarie h y p o x ia .a ll r a t s w er e k i l le d b y p e n tob a r b it a l so d iu m thr ou g h intraper itonea l injeetion im f n ediately after exereise，the gastroenem i、 js m u se le w er e q u iek ly r em o v e d . 丫 g a s tr o e n em iu s h s p 7 o g en e a n d p r o t e in e xp r e s s io n w er e d e t e e t e d b y r ea l一 t im e f lu or e se e n t q u a n t ita t iv e r t 一 pc r a n d w e s t er n b lo t a n a ly s is r e sp e e t iv e ly .m u s e l e fr e e r a d iea l s m d a ， g s h 一 p x ， t 一 s o d ， c a t ， a n dt 一 a o c w e r e d e t e e t e d b y k it s . 3 r e su lt s 、 了 3 .1 exereise and hypoxia indueed a signifieant (p0.05) inerease in hsp7o g e n e e x p r e s s io n if n me d ia t e ly a f t er e x e r e i s e .u n d er n o r m o x ia r e e o v e r y e o n d it io n s ， a t 1 d a y ii s p 7 o g e n e e xp r e s s io n w a s d e er ea s e d s ig n if ie a n t (p(0 .05) eompared w i七 h he ; at zdays and 7 days， hsp7o gene expression w e r e e le v a t e d g r a d u a l 飞 y .u n d e r no r m o l a r ie h y p o x ia r e e o v e r y e o n d i t io n s ， a t 1 d a y a n d 2 d a y s h s p 7 o g e n e e x p r e s s io n w er e in er e a s e d g r a d u a 工 ly ; a t 论 文 随机验 证 编 号 : bt6 1 55516105570 v i 低氧运动后不同恢复环境下大 鼠胖肠肌hsp70表达的时程变化 7 days，hsp70 gene expression was deereased signifieant (p0.05) eompared w ith h 2 . 3 . 2 h s p 7o pr o te in e xp r e s s io n t en d e n ey w er e d if fer e n t fr o m g en e exp r e s s io n . i咖 e d ia te ly a f t er ex er e ise ， h sp 7o pr o t e in e xp r e s s io n w er e e le va t ed . u n der n orm o x ia r e e o v er y e o nd it io n s， a t 1 day h s p 7o pr o t e in exp r e s s io n was signifieant (p(0.05) inereased eompared with c ; at 2 days the hsp7o p r o t e in e xp r e s s io n w a s d e er e s e d ， a n d a t 7 d a y s th e h s p 7o p r o t e in e x p r e s s io n w a s e le va t e d a g a in .u n de r n o r m o b a r ie h y p o x ia r e eo v er y eo n d it io n s ， a t 1 da y h s p7o p r o t e in ex pr e s s ion w a s e lev a t e d : a t 2 d ay s a n d 7 d ay s， th e h s p 7 o p r o t e in ex p r e s s io n w er e f a l l一 o f f . 3 . 3 a l l ga str o e n em iu s m u se le d e er ea s e d im me d ia t e ly a f te r in d ex e s o f fr e e r a d iea l s m e ta b o l ism w er e e x e r c i s e 。 u n d er n or m o x ia r ee o v e r y eo n d it io n s， a t 1 da y ， 2 d ay s a n d 7 da y s m d a eoneentration were elevated gradually : at 1 day the t一 sod (p0.05)，cat (p(0 .05) aetivities were elevated at the same time : at 2 days，t一 sod and ca t a e t iv it ie s w er e d e er e a se d ， a n dt一 a oc a n t iox ida n t ea p a e it y w a s e l eva te d : a t 7 d a y s， t 一 s o d a n d c a t a e t iv it ie s w er e in e r ea se d a g a in ， a n d t一 aoc was elevated gradually.gsh一 px aetivity was significant (p(0.05) d e er e a se d a t 7 d a y s p o s te x er e is e . 丫u n d er n or m ob a r ie h yp o x ie r e eo v er y eo n d it ion s，a t 1 d a y ，m d a e o n e en tr a t io n (p0 .05)，t一 500(p0.05)，eat(p0.05)，t一 aoc(p0.05) aetivities were 5 ig n if iea n t in er ea se d : a tz d a y s a n d 7 d a y s ， m d a e o n e en t r a t ion ， t 一 so d a n d c a t a e t iv it ie s w er e d e er ea se d :t 一 a o c a n t io x id a n t e ap a e ity w a s in e r e a s e d a t 2 d a y s a n d d e e r ea s e d a t 7 da y s . g s h 一 p x a e t iv it y h a d n o e h a n g e p o s t e x e r e i s e . 4 c o n e lu s io n s 4 . 1 o n e s in g le b o u t o f a e u t e t r e a d l :1 1 1 e x er e i se oln d e r n o r m o b a r ie h y p o x ic e o u ld in d u e e h s p 7 o g e n e a n d p r o t e in ex p r e s s io n . 4 . 2 h s p 70 g en e a nd pr o te in e x p r e s s io n a t h ig h l e v e l r e e o v e r y u n d er 论 文 随机验 证 编 号 : bt615 5 516105570 v ll ) 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠排肠肌玲p7 0 表达的时程变化 n o rm ob a r ie h yp ox ie lon g er tha n r e eo v er y un d er n orm o x ia e o n d it io n s p o s t e x e r e i s e . 4 . 3 t im e e o u r se o f h s p 7 o p r o t e in ex p r e s s io rl a n d v a r ia n e e o f in d ex e s o f fr e e r a d iea l s m e ta b o l ismw er e 5 im ilar ly . k e y w or d s :h s p 7o :fr e e r a d iea l s :g a str o e n em iu s :r e a l一 t im e f lu or e s e e n t qu a n t ita t iv e rt 一 p c r :w e st er n b lo t 丫 、 甘 论 文 随机验 证编 号 : bt61555 1 6105570 v lll 护 低氧运动后不同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达的时程变化 目录 o d 匕 叮 rc 八 只q j q o j . . 汁仄j 勺 才1 月 l 一j i 人刁 1 1 缩略语 中英文对照表1 1 前言2 2 文献综述3 2.1 分子伴侣 的定义与分类 . 2.2 蛋 白质 的折叠 . 2.3 hsp7o 蛋 白氨基酸序列及起生物活性作用时的结构 2.4 hsp7o 辅助 蛋 白质折叠 的生物学过程 . 2.5 hsp7o 辅助新生蛋 白质 的折叠 . 2.6 h s p 7 o 的生物学功能 . . 2 . 6.1 h sp70 的分子伴侣功能9 2. 6. 2 h sp70 与细胞凋亡10 2 . 6 . 3 h sp70 保护细胞免受氧化应激损伤1 0 2 . 6 . 4 h sp70 保护细胞免受 x 射线损伤1 2 2. 6. 5 h sp7o 的免疫学作用12 2. 6. 6 h sp7o 与细胞信号转导12 2 . 6 . 7 h sp70 在胚胎发育中的作用1 3 2 . 7 h s p 7 o 基 因的转录 . 2 . 8 h s p 7 o 蛋 白表达 的调节 . 2.9 运 动对 hsp7o 的影 响 . 2.10 低 氧刺激对 hsp70 的影 响 . 3 研 究 内容1 8 3.1 实验材料 与方法 . 3 . 1.1 实验对象1 8 3.1. 2 大 鼠运 动方 式与 分织1 8 3.1. 3 大 鼠胖肠肌样本 的采集与处理 1 9 3.2 测试 指标 与具体测试方法 . 3. 2.1 指标测试方法及 原理 1 9 3 . 2. 2 测 试用 主要 试 剂及 试剂 盒1 9 3 . 2 . 4 主要实验仪器2 1 3 . 2 . 5 抗 体及 预 染 蛋 白分子量标 准2 2 3. 2 . 6 蛋 白浓度及机体 白由基指标 的测试 2 3 论 文 随机验 证 编 号 : b r 6 1555 1 6105570 声 低氧运动后不同恢复环境下大 鼠胖肠肌hsp70表达的时程变化 3.3 大 鼠胖肠肌 rna 的提取 (qiagen kit) 3 . 3.1 试剂盒提取 r n a 2 4 3 . 3 . 2 测定 r n a 的浓度及 o d 值 (纯度 )2 4 3 . 3. 3 用 9% 变性琼脂糖凝胶 电泳确定 r n a 的完整性2 5 3. 3 . 4 先采用普通 pc r 检验扩增效果2 5 3 . 3 . 5 引物设计2 5 3. 3. 6 m r n a 反转录成 ed n a(模板)26 3 . 3 . 7 溶解引物2 6 3 . 3 . 8 实时荧光定量 rl， 一pc r 26 3. 3 . 8.1 实时荧光定量 r t一pc r 反应体系 27 3. 3. 第二是把在消除 自由基过程 中变性 的蛋 白重新恢复其生 物 学活性 ; 第三 ，h sp7 0本身就是一种 内源性抗氧化酶 。这三个途径 中都需要 h sp70 作为分子伴侣来参与 。 运动对骨骼肌 h sp70 与 自由基代谢的研究 已经很多。常压一次性低氧间歇 跑 台运动后骨骼肌 h sp7 0与 自由基代谢 的研究至今很少 ，而且未见文献报道有 关常压低氧运动后不 同恢复时段骨骼肌 h sp7 0与 自由基代谢变化 的研 究 。本 文 以此 为 出发 点 ，观 察 了大 鼠在 常压低 氧环 境下进行 一 次性 间歇 跑 台运 动后运 动 后常氧 、常压低氧 (氧含量 1 2 . 7 % ) 恢复下大 鼠胖肠肌 h sp7o 及 自由基代谢指 标 的时程变化 。 扩 声 低氧运动后不 门灰复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达 的时程变化 2 文献综述 自从热休克蛋 白 (heat shoek protei n， h sp ) 对有机体起着一定的保护作用 发现 以来 ，有关热休克蛋 白的研究一直是运动医学和临床 医学界研 究的热点。 热休克蛋 白，又称为应激蛋 白 (s t r e s s pro t e i n ，sp )。当细胞在遇到温度升高、缺 氧 、冷 、创伤 、病原体、细胞因子等应激 时可激活 h sp 基因，编码合成一类生 物进化上最保守的蛋 白质 ，即热休克蛋 白。热休克蛋 白的主要功能是细胞保护 功 能和分子伴侣作用 。此蛋 白与一些基本 的细胞功能密切相关 ，如 蛋 白转运 、 折叠和组装等 ，因此也被称 为分子伴侣 (m o l e e u l a r c h a p e r on e )，帮助蛋 白合成 、 折叠 、组装等 。很多研究证实 ，骨骼肌在运动与缺氧 的情况下热休克蛋 白的表 达会有所增加 。热休克蛋 白赋予细胞保护作用 ，从而使细胞免遭高热、缺氧、 缺血再灌注 、 自由基等损伤 。 运动所致 的机体代谢改变 ，产生缺氧、酸 中毒、缺血 一再灌注 、活性氧 、 钙离子浓度升高，蛋 白质降解等应激条件 ，也可诱导 h sp7 0的表达 。但是运动 方式、运动环境等的不 同对 h sp70 的表达有着不同的影响。 2.1 分子伴侣的定义与分类 分子伴侣是一大类 蛋 白质 ，它们共 同的特征是协 助其他大分子结构非共价 键 的装配 与分解 ，但 是 当这 些 大 分子行 使 它们 一般 的生物 学功 能 的 时候 分 子伴 侣 并不是这 些大分子 的永久性结构 的一部分 。有些分子伴侣也是应激 蛋 白或热 休 克 蛋 白。相 反 ，有 些应激 蛋 白也 是分 子 伴 侣 。需要 指 出的最 重要 的一 点是 : 分子伴侣是通过它们 的功 能来 定义 ，而 不是分子 结构【 】 。 h sp7o 家族 是一个很大 的蛋 白家族 ，很 多组织 中有 很 多不 同的成 员 ; 在 大 部分真核 生物 的细胞腔 隙 中存在 大量 的、不 同的 h sp70. 现在研 究 的 比较 多的 h sp70 家族 的成员主要是 :h sc 7o (或者称为 h sp7 3)， 胞浆 中 h sp 的主要成分 ; h sp7o (或称 为 h sp72 ) ，胞 浆 中受应激诱 导 的类 型 ; b i p ，与免疫球 蛋 白相 结合 b ria n h end erso n ，a . g rah am p o ek ley. m o leeular eh ap ero n es and eell sig n aling . c am b rid ge u n iv ersity p ress， 2 0 0 5 . 低氧运动后不同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp 7 o表达的时程变化 的蛋 白质 ，或者称为 g 甲7 8 ; 线粒 h sp7 0 ，在酵母菌 中称为 d n a k . 下表是分子 伴侣与应激 蛋 白的具体分类与主要 的生物 学功能 。 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达 的时程变化 家族名称 非立体结构分子伴侣 n uc l eop la mins/ n ud eoph osm ins c h ap er o n in s h sp2 7/ 2 8 h sp 4 0 h sp 4 7 h sp 7 0 h sp 9 0 h sp 10 0 c alnexin / ealretieulin s eeb p ro tein l i m pro tein s ye p ro tein p r o tein d isu 1p h id e iso m erase e x b b p ro tein s u b iqu in ated r i b o so m al p ro tein s n a c eo m p lex s ig n al reeog nitio n p artiele t r ig g er f a eto r p ref o ld in 肠m g爪 m 1o com plex 2 3 5 rib o so m al r n a p rsa p ro tein elu sterin p h o sp h atid y leth an o lam id e r n a b in d in g p ro tein s p 4 5 表 1 分子伴侣的主要特性 l 可能的生物学功能 核小体和核糖体的装配与解体 参与折叠新合成的与变性的多肤 通过吸附未折叠的多肤链来阻止 由于应激诱导的蛋白质聚集 蛋白质折叠、转运，低聚体的解聚 内质网中前胶原的折叠 蛋白质折叠、转运，低聚体的解聚 细胞周期，荷尔蒙激活 ，信号转导 使不溶性聚集蛋白质溶解 内质网中糖蛋白的折叠 细菌中蛋白质的转运 细菌脂肪酶的折叠 通过细菌分泌 的毒性 y o p 蛋 白 防止蛋白质在 内质网中的错误折叠 细菌中 t o nb 蛋白的折叠 酵母菌中核糖体的组装 新生蛋 白质 的折叠 阻止蛋白质的翻译 细菌中新生蛋 白质的折叠 胞浆中新生多肚链的折叠 防止进入线粒体膜 间隙疏 水蛋 白质 的聚集 新生多月 太 链的折叠 通过枯草杆菌分泌的蛋 白质 细胞外 分子伴侣 乳糖透 明质酸酶的折叠 r n a 的折 叠 嗜盐细菌 中蛋 白质的变性 立体结构分 了伴侣 p ap d p ro te in s propept ides(elass l) 细菌鞭毛的组装 部分蛋 自酶的折叠 b rian h en d erso n a . g rah am p o ek ley. m o leeu lar e hap e ro n es an d eell sig n alin g . c am b rid g e u n iv er s ity p ress， 2 0 0 5 . 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达 的时程变化 表 2 功能分子伴侣帮助蛋 白质折叠 l 分子伴侣家族 h s p 10 o h s p g o h s p 70 c h 叩 ero n i n s h s p 4 o p ref o ld in t rig g er f a eto r c aln ex in ， ealretic ulin n aseen t一 eh ain asso eiated com pl ex(n a c ) p a pd 执行功能 聚集物的解聚 调节 裕体激素受体和信号转导蛋白的组装 防止未折叠蛋 白链的聚集 分离部分己经折叠的多肤链 激活 h sp70 的 a i 甲 酶活性 防止未折叠蛋白链的聚集 与刚从核糖体组装完成的新生多肤链相结合 与部分折叠的糖蛋 白相结合 ; 分别位于 内质网膜与内腔中 与刚从核糖体组装完成的新生多肤链相结合 防止细菌鞭毛亚基的聚集 2 . 2 蛋 白质的折叠 细胞 中的蛋 白质折叠是一个仍未搞清楚的过程 ，在很多情况下体 内蛋 白质 折叠过程需要一系列 的分子伴侣来帮助新生蛋 白质 的进行折叠 。近来 的研究证 实了有完整原子结构的细菌大 (5 0 5 ) 和小 (3 0 5 )核糖体亚基 ，为蛋 白质折叠 这一复杂的大分子机制提供 了新的和重要的证据 。 新生多肤在核糖体通道 中的构象如何我们知道的很少 。核糖体通道 的平均 直径约为 1 5 人， 可能允许生成 。一 螺旋， 但是对于组装 p 一 折叠片或蛋 白质 的三级 结构来 说核糖体通道直径就太 窄 了。因此 ，含有新生多肤链 的核糖体通道 的构 象是松散 的。 所有 的组织和 细 胞 间 隙 中都存在 有 分子伴 侣 。它们 包 括 热休 克 蛋 白家族 : h sp i00， h sp90， h sp7o， h sp6o， h sp56， h sp4o，泛 素和 小 h sps (数字表示 的是 家族成员的分子量)。这些家族在绝大部分原核与真核生物是高度保守的。所有 的分子 伴 侣 都与折 叠 中 间体暂 时结合 。分子 伴 侣 防止 蛋 白质 分 子 间与 分子 内的 不 正确 折 叠 。更重要 的一 点是分子伴侣 不是折叠成 熟蛋 白质 结构 中的一部 分 。 分子伴侣 的 “ 支持物 ”与 “ 折叠者 ”的功能取决于它们 能够 防止 蛋 白的聚 集 或 者 支 持 蛋 白质 的重新折 叠 。“ 折 叠者 ”形式功 能时是 a tp 依赖性 的 ，例如 a 们 thony l f . c haperone一 m ediat ed protein f o l ding.physiologi eal r evi ew s， 1999， 79(2):425一 4 4 9. 低氧运动后不 同恢复环境 卜 大 鼠排肠肌hs p7 0 表达 的时程变化 h sp70 和 h sp60 分子伴侣 ， 也有非 a l， p 依赖性 的， 如小热休 克蛋 白和 h sp40. 相 反 ，积极参与蛋 白质折叠的分子伴侣是严格 a rp 依赖 的。这就强有力的说明了 很 多新合成 的蛋 白质 需要分子伴侣 的辅助才 能折 叠到天然 的状态 。这 些分子伴 侣依据它们 在细胞 中的定位可 以分 为两类 。第一 类包括胞质 中可溶性 的分子伴 侣 ，涉及到共翻译与翻译后的新生蛋 白质 。这种分子伴侣包括真核细胞与原核 细胞 中的 h sp60 与 h sp7o 家族 。第二类分子伴侣是连接新生多肤与核糖体的蛋 白质 ，它们辅助 蛋 白质在共转录早期阶段 的折 叠 。 2. 3 h sp70 蛋 白氨基酸序歹 l 及起生物活性作用时的结构 大 鼠热休 克蛋 白 70 的氨基酸序列:n c b i id :a a h 24782 a t p 期9 2+ 图 1 h sp70 起 生物 活性作用 时的结构示意 图l l j 注左 图 与 a tp 和 m g z +相结合 的复合体 中 d n a k(h sp70 ) at p 酶结构域 的二级结构 右 图 d nak 与底物结合的二级结构 a i ， p 酶 结构域 ，在 结构 上 与肌动 蛋 白和 己糖激 酶类似 ， 山四个小 亚基组 成 两个裂 片形成一 个深 的裂 门结 合 m ga tp与 m ga d p .多肤 结 合域 的结构包 含- 个 三明治结构 的亚基 ，紧接着有 一 个环状 物 形成螺 旋结构 。多j j k 结 合 d n a k 通 过 一 个 三明治结构环 与处 于松 散构象 的 d n a k 相结 合 。 螺 旋结 构被 认为起 稳 定复 合 物 结 构 的 作 用 ，不 直 接 与多 肤 相 结 合 。底 物 蛋 自只有5个 残 基 能 够 明 显的 与 1 o eu e rlin g e . b u k au b . e h ap ero n e一 assi、 ted f o ld ing o f n ew ly sy n th e、 ized p ro tein 、in th e ey ro so 一e ritiea- r ev iew s in b io eh em istry an d m o leeu la r b io lo g y， 2 0 0 4 ， 3 9 :2 6 1一 2 7 7 . 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠排肠肌hsp7o表达的时程变化 h sp70 相结合 。 2. 4 h sp70 车 甫 助蛋 白质折叠的生物学过程 很多研究表 明 h sp7 0至少存在有三种截然不同的构象 ，第一种是不与核普 酸结合 ，第二种是结合 a d p ，第三种是结合 at p . h sp7o 的活性通过结合与水解 a l， p 来调节 。h sp70 在核糖体结合新生的多 肤链，防止它们过早的折叠，错误折叠，或者发生聚集 ，促进新合成的蛋 白质 从细胞质转位 到线粒体和 内质 网中。 h sp7o 的活性通过 h sp40 来调节 。 h sp40 在有 a rp 存在 的条件下与 h sp70 相互作用来禁止蛋 白质聚集 。研究认为要使底物蛋 白质能有效的结合到 h sp7 0 需要结合 h sp4 0并激活其 a rp 酶活性 。 h sp70 与新生多肤 的相互连接在生理条 件下是明显存在动力学特性的，但是丢失 a tp 或化学键断裂可 以稳定这种连接 作用 。 h sp70 是分子伴侣家族 中的一员，涉及到蛋 白折叠 以及一些其他的细胞功 能 ，而且具有微弱 的 at p 酶活性 。h sp7o 分子伴侣 由两个主要 的功能结构域组 成 。 n h z一 端 ， 高度保 守的 a tp 酶结构域 ， 与 a d p 和 a tp 紧密结合 (要有 的 m gz+ 和 k +存在 ，见图 1)，并水解 a tp ; c o o h 一 端结构域是结合多肤链所必须的。 对于蛋 白质 的折叠来说 ，这两个结构域必须协 同合作l 。 2. 5 h sp70 车 甫 助新生蛋 白质 的折叠 在酵母 菌 中 ，h sp7 0的同系物 d n a k 连 同 d n a j 和 g r p e 与 9 % 到 1 8 % 的新 生蛋 白质 短暂 的结合在 一起 ，包括 多肤链 。d n a k 作 为一种单 体 同单个 短 的疏水 多肤链 相 结合 ，多肤链 大约 是 5 个氨基酸 。d n a k 包括 n 一端 的 a tp 酶 结构域和 c 一端的底物结合域。通过 a rp 的水解与 a d p / a i ， p 的转化过程来调节底物 的结 合 与释 放 ，这个过程 还受 到 d n叮 与 g r pe 的调节 。在 与 a tp 结合 的状 态 下 ，底 物 与 d n a k 相 结合 与解 离 的速 率都很快 ，但 是 d n a k 与底物 结合 的亲和 力很低 。 在 与 a d p 结合 的状态下 ，d n a k与底物 结合 的亲和 力很高 ，但是 与底物 结合 与 解 离 的速 率很慢 。d n a j 与 g r p e 通过疏 水作用 与底物相 结合 ，通 过 d n a k 的 a tp ，a nthony l f c haperone一 m ediated protein 扬ldi ng.physiologieal r evi ew s， 1999， 79(2):425一 449. 低氧运动后不 同恢复环境下大 鼠胖肠肌hsp7o表达的时程变化 酶活性来激活 d na j与 g 甲e . 实验证据表明 d n叮 识别底物，并把底物传递给 d nak ，同时水解 a 1 ，p ，并与底物部分紧密的结合在一起 。 在生理条件下， 底物解离的能力由a d p怂tp 比值变化来决定， 同时由 g r p e 来激活 。与底物结合与解离的周期非常短，而且在蛋 白质再次折叠之前可能经 过多次这样的过程，并且不在作为底物来识别。 2. 6 h sp7o 的生物学功能 目前 ，h sp7 0被认为是哺乳动物细胞 h sp s中最重要，也是研究最为深入的 h sps 家族 ，这与它所具有 的生物学特性密切相关: (1 )生物界的普遍性 ，从原 核生物到真核生物都有 h sp70 的表达 ， 同一生物体 内的不 同组织 内亦均有表达 。 (2) 局度的保守性 ，不同生物来源 的 h sp70 氨基酸序列有 50% 一 9 0 % 的同源性 ， 而且 h sp7 0氨基酸序列 的 n 端 2 / 3 部分较 c 端 1/ 3 部分还要保守得多。(3 )正 常情况下 h sp70 在细胞 内呈基础表达，表达水平较低 ; 而在高温及各种有害应 激状态下，h sp7o 的合成速度显著增加，一般数分钟 内即可达到最高水平，而 原来的蛋 白质合成则减少， 以提高生物体的抗应激 能力 。 (4 )正常情况下 ， h sp70 位 于细胞浆 内，当细胞遭受应激作用时，h sp 7 0 迅速移入细胞核 内包 围核仁 ， 细胞浆 内只有少量存在 。 而应激消除后细胞处于恢复阶段时， 细胞核 内的 h sp70 又返回胞浆， 在细胞浆 内呈低水平表达， 再次应激又重新返回细胞核 。 (5 )h sp70 家族成员在细胞 内的分布不 同， 但均具有 与核昔酸特别是与 a d p 或 a tp 结合 的 特 性 。(6 )交叉耐受性 : 经过热休 克处理后 ，机 体或细胞对再 次热休 克或其他 应激产 生耐受性 ，而其他应激 作用 与机体或细胞后也可使其获得对热休 克温 度 的耐受 。(7 )时 间性 : 热休 克 蛋 白对 细胞 的保 护 作用 具有 最佳 时 间范 围 ，包 括 热休克后有一个绝对 的恢复期 ，超 出一定期限就失去其保护作用 】 。 2. 6.1 h sp7 0的分子伴 侣功 能 在应激 条件 下 ，h sp7o 浓度 的增加表现 在 防止 蛋 白质 的聚集 与帮助错 误 折 叠 的蛋 白质从新进行 正确 的折 叠 。在 正常 的生理 生长 发育 条件 下 ，h sp70 促进 新 生 的蛋 白质进行 正确 的折 叠 ， 使寡聚 蛋 白质 结构 (oligom eric protein struetures) ，林玲.大鼠心) j ) l h sp70 、 自由基代谢核 n a 一k 一八 j pase 活性对有年 忆 耐 力运动 的)仪答j 日 一 和适应性变化. 广 州:华南 师范 少 、 学 倾 卜 学位 论 文， 200 3 . 低氧运动后不同恢复环境下大 鼠排肠从hsp7o表达的时程变化 解聚 ，还能够促进结构不稳定蛋 白质的水解 。众多的实验表 明 h sp7 0能够促进 蛋 白质进行折叠，一分子的 h sp7 0能够结合一分 子的底物 ，同时 h sp7 0能够多 次循环与底物结合与解离 。作为蛋 白质折叠多维网络 的一部分 ，蛋 白质折叠到 天然状态、聚集、从新与 h sp7 0结合 ，与其他分子伴侣或蛋 白酶结合时，底物 从 h sp70 分子伴侣上解离下来要经历解离动力学过程l 】 。 2. 6. 2 h sp70 与细胞 凋亡 热应激诱 导细胞的死亡包括两种 : 集落生成 的减少与细胞凋亡 。h sp 7 o 能 够 防御热应激 引起 的人急性成淋 巴细胞 t 细胞的细胞凋亡 。然而 ，热休克蛋 白 对细胞凋亡 的保护是否起直接作用仍不清楚 。4 4 热处理大 鼠成纤维细胞后 明 显 出现核染色质凝聚、胞质收缩、细胞粘着丢失、染料排除与 d n a梯形。b d 一2 基因的表达与细胞的热耐受性能够保护细胞免受 由热诱导的细胞凋亡 ，同时 细胞在遭受热应激后 能够促进细胞增殖 。 从我们前期 的研 究结果来看 ，热休 克诱 导的细胞凋亡有 两种不 同的独立途 径 : 第一种途径是 b d 一2 基因表达增加抑制细胞凋亡; 第二种途径是通过热休 克蛋 白来抑制细胞凋亡 。h sp7 0的过分表达能够减少热应激诱导的细胞凋亡 。 有研究指 出: h sp7 0可 以通过改变 p5 3蛋白的构象而结合 ，但是 p5 3 一h sp7 0 复合体 的生物学意义仍未搞清楚 。诱导大 鼠细胞凋亡需要 p5 3蛋 白的参与 ， h s p 7 0可以使 p 5 3 蛋白的失活来抑制细胞凋亡l l 。 细胞 内 h sp70 水平增高可 以通过阻断信号通路抑制应激诱导的应激酶 ，如 jn k 、p 3 8 的激活 ，从而减少细胞 的凋亡 。有研究指 出: 在体模型 中发现预热休 克对运 动性骨骼肌损伤具有保护作用 ，并且发现这种保护作用可 能与 h sp7 0的 表达 增加和 p3 8的活性升 高有关 z 。 2. 6. 3 h sp7o 保护细胞 免受氧化应激损伤 当细胞表达两种突变 的 h sp7o 编码基 因中的任意一种基 因: 一种是在 阅读 框外缺 失 4 个碱基对 ; 一种是在 阅读框 内缺 失密码子 43 6 一6 1 8，这两种 突变对 l 加 teh m an n s .s tress p ro tein s一 h a n d b o o k o f ex p erim en tal p h arm a eo lo g y， s v rin g er一 v erlag b e rlin h eid elb erg ， 4 3 一 5 2 ， 19 9 9 . 2 叶春.顶热休 克对 人鼠急性运动后骨骼 j j ) l 损伤的保护 作用及机理的研究.日概 华东师范 人学博 l学 位论 文 ， 2004 .