（林木遗传育种专业论文）黄花柳微卫星富集文库构建及标记筛选.pdf

摘要 柳树是杨柳科( 妇l i c a c e a e ) 柳属( s a l i x ) 树种的统称。柳属树种十分丰 富，世界上共有50 0 多个乔灌木树种，为重要的林木类群，具有重要的生态和经 济价值。柳树种问杂交及无性繁殖容易，有些树种世代很短，一年生就能开花结 实，是林木中进行遗传学研究的理想材料。 微卫星( s s r ) 是指由卜6 个核苷酸为单位、呈串联重复的d n a 序列，广泛分 布于真核生物的整个基因组中。微卫星标记具有共显性、多态性高、重复性好等 特点，是较为理想的分子标记被广泛地用于群体遗传研究、遗传图谱构建，数 量性状基因q t l 定位、辅助选择等由于可用于柳树研究的微卫星标记很少，限 制了对柳树这些领域的研究，急需开发适于柳树研究的s s r 标记，以促进柳树分 子遗传学研究的发展 本研究从几个方面来探索柳属s s r 引物的开发，重点构建黄花柳微卫星富集 文库采开发，首次在柳属中提出了一种高效的微卫星筛选分离策略：以生物素标 记的c t ) 。，和( g t ) 。，为探针进行杂交，措助磁珠筛选出合微卫星的& u 3 ai 酶切 片段，共得到10 5 6 个质粒，然后用地高辛标记 c t ) 。和( g t ) t 混合探针点杂交对 3 8 4 个克隆进行二次筛选；从没经过二次筛选的克隆中随机挑取3 6 0 个和经过二 次筛选的2 4 个阳性克隆进行测序，发现含微卫星的克隆有18 3 个( 3 6 0 个文库 克隆中，i6 2 个克隆中舍微卫星序列( 4 5 若) ，2 4 个二次杂交阳性克隆中有2 1 个 合有微卫星序列( 8 9 ) ) 最后得到的4 4 个非同源性克隆中，共舍有53 个微卫星住点：对微卫星种类 进行分析，其中( t c a g ) n ，( g a c t ) n ，( c a g t ) n 比例最高，共占7 4 ，并发现( a i t ) n ，( a t t a ) n ，及三碱基重复微卫星( g g t ) n ，( a c c ) n ，( c t c ) n ，( g c t ) n ，( c c t ) n ， ( g g c ) n 。 利用软件r e p e a t m as k e r 在线时4 8 0 条柳属核酸序列进行微卫星统计，发现 7 8 条含有微卫星( 1 6 2 5 肋。二碱基重复( a t ) n 、( c t ) n 、( t g ) n 含量最多，选取蒿 柳( 血l l xv i m i n a l i s ) 叶子的l a m b d at r i p i e x 栽体e d n a 文库中微卫星序列设 计出8 对引物，为利用数据库数据开发s s r 标记提供了一条有效的途径。 选取从黄花柳富集文库中得到的1 9 个各种类型微卫星住点设计引物，用5 个种个体混合d n a 组成模板池方法捡测引物种间的多态性信息，结果表明：5 对 引物( s c s l ，s c s 2 ，s c s 3 ，s c s l6 ，s c s l7 ) 多态性较好，其中引物s c s l 检测 到的等位基因最多有6 个；最少的s c s 3 中检测到3 个。这5 对引物适于柳属 种问遗传学研究引物s c s l 和s c s 3 还进一步分别在簸箕柳16 个个体、杞柳1 o 个体中进行了扩增，结果均表明有较好的多态性。 甩杨属毛果杨纽t r i c h o c a r p ah o o k ) 2 3 对徽卫星标记在柳属种间进行了 扩增：6 对引物在簸箕柳和杞柳种问成功扩增，其中一对引物还在杞柳2 3 个个 体中检测到6 个等位基因；验证了s s r 引物在扬属和柳属问有较好的通用性 关键词：黄花柳；微卫星分离；s s r 多态性检测 a b s t r a c t s a l i xl ，b e l o n g e dt os a l i c a c e a e ，h a da na b u n d a n c eo fs p e c i e s ，a b o u t5 0 0 s p e c i e so f a r b o ra n df r u t e xt o t a l l y i tw a si m p o r t a n tf o r e s t r yc o l o n y ，e c o l o g i c a l l ya n d c o m m e r c i a l l yi m p o r t e d e s p e c i a l l y ，i t h a d h i g hh e t e r o z y g o s i t y a n d e a s y h y b r i d i z a t i o n ，s o m es p e c i e sg e n e r a t i o nw a ss h o r t ，y e a r l yb l o s s o m i n ga n ds e e d i n g f o ra l li t sc h a r a c t e r i s t i c ，i th a dah i g h p o t e n t i a lf o ru s ei nf o r e s tg e n e t i c a ls t u d y m i c r o s a t e l l i t e s ( s s r ) ，s h o r t s t r e t c h e so ft a n d e m l yr e p e a t e d1 - 6n u c l e o t i d c s e q u e n c e s ，w e r eu b i q u i t o u s l yp r e s e n t i n e u k a r y o t i cg e n o m e s m i c r o s a t e l l i t e s m a r k e r sw e r ec 0 一d o m i n a n t l y i n h e r i t e d ，h i g hd e g r e eo fp o l y m o r p h i s m ，c o n s e r v e d m a r k e r s t h e r e f o r e ，i th a dw i d e l yb e e na p p l i e df o rs t u d i n gp o p u l a t i o n ，g e n e t i c l i n k a g em a p p i n g ，q t ll o c a t i o n ，a s s i s t i a n ts e l e c t i o na sam a r k e rs y s t e ms e e m e dt h e b e s tc a n d i d a t e h o w e v e r ，t h ea c t u a lu s eo fm i c r o s a t e l l i t e sm a r k e r sf o ra n a l y s i so fs o l i xl h a d b e e nv e r ys c a r c e ，w h i c hl i m i t e di t sa p p l i c a t i o ni ns a l i xl t h eo b j e c t i v e so ft h i sw o r kw e r et os e e ka f e rs o m es t r a t e g i e sf o rd e v e l o p i n g n e wm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sf o rs a l i xl ，i t se m p h a s i z a t i o no nc o n s t r u c t i o ne n r i c h e d m i c r o s a t e l l i t e s1 i b r a r i e so fs c a p r e ad e v e l o p e dar a p i da n de f f i c i e n tj d e n t i f i c a t i o n m i c r o s a t e l l i t ep r o c e d u r ei ns a l i xl ：w i t hb i o t i n y l a t e d ( c t ) 1 5a n d ( g t ) 1 5o l i g o p r o b e s t o c r o s s - h y b i d i z e t os a u 3 a i - d i g e s t e d m i c r o s a t e l l i t e s f r a g m e n t s i n s c a p r e a ， a c c o r d i n g t o a f f i n i t y b e t w e e n b i o t i n y l a t e do l i g o p r o b e s a n d s t r e p t a v i d i n m a g n e s p h e r ep a r a m a g n e t i cp a r t i c l e s ，1 0 5 6c l o n e sw e r eg a i n e d t h e n ，3 8 4c l o n e s w e r e s e c o n d l ys c r e e n e db yd i g - ( c t ) sa n d ( g t ) 8 。a tl a s t ，3 6 0c l o n e sa n d2 4p o s i t i v e c l o n e sa f t e rs e c o n ds e l e c t e dw e r es e q u e n c e d i tw a ss u g g e s t e dt h a ts s r - c o n t a i n i n g c l o n e si s 1 8 3 ( 1 6 2f r o m3 6 0c l o n e s ( 4 5 ) ，2 1f r o m 2 4p o s i t i v ec l o n e sa f t e rs e c o n d s e l e c t e d ( 9 9 ) ) o ft h e4 4s s r - c o n t a i n i n gc l o n e si d e n t i f i e di nn o n h o m o l o g yp l a q u e s ，5 3s s r l o c iw e r eg a i n e d t h r o u g ha n a l y s i so f r e p e a t st y p e s ，t h ep r o p o r t i o no f ( t c a g ) n ， ( g a c t ) na n d ( c a g t ) nr e p e a t si s o l a t e do c c u r r e dr e l a t i v e l yh i g h ，a p p r o x i m a t e l y 7 4 t o t a l l y t h e r ee x i s t e do t h e rm o t i f si n c l u d i n gm o n o n u c l e o t i d er e p e a t s ( a t ) n d i n u c l e o t i d er e p e a t s ( a t t a ) na n dt r i n u c l e o t i d er e p e a t s ( o o t ) n ，( a c c ) n ，( c t c ) n ， ( g c t ) n ，( c c t ) n ，( g g c ) n i na d d i t i o n ，a n a l y s i s i n gt h es e q u e n e sb yr e p e a t m a s k e rs e a r c h i n gt h ed a t a b a s e o fs a l i xi ng e n e b a n k 。7 8m i c r o s a t e l l i t e s c o n t a i n i n gs e q u e n c e sw e r ei d e n t i f i e df r o m 4 8 0 ( 16 2 5 ) t h ed i m o t i f ( a t ) n ，( c t ) n ，( t g ) nt y p e sw e r et h em o s ta b u n d a n t m i c r o s a t e l l i t e s 8s s rs e q u e n c e s ，o b t a i n e df r o ms a l i xv i m i n a l i sl a m b d at r i p l e x e d n a ，w e r eu s e df o rd e s i g n i n ga sp r i m e rp a i r s w h i c hp r e s e n t e dd a t af o ri n d e p t h a n a l y s i s ，a sw e l la sp r o v i d i n gr e a d ya c c e s st om i n ed a t ar e s o u r c e sa v a i l e d 19 s s r s ，o u to f5 3 ，w e r ed e s i g n e da s p r i m e r s a n dt h e nt e s t e df o r c r o s s a m p l i f i c a t i o no np o o l e dp a n e l sc o m p r i s i n gi n d i v i d u a l s f r o m5s p e c i e so fs a l 诹l a s ar e s u l t ，5p a i r sp r e l i m i n a r yi d e n t i f i c a t e dw e r es u c c e s s f u l l yc r o s s a m p l i f i e d t e di nt h e m o s tc a s e s m o r e o v e r ， 2o ft h e5m i c r o s a t e l l i t e s ( s c s1a n ds c s 3 ) r e v e a l e d d o l y m o r p h i s m w i t h i n16i n d i v i d u a l so fs s u c h o w e n s i s ，1 0i n d i v i d u a l so f s i n t e g r a ，r e s p e c t i v e l y 6m i c i ，o s a t e l l i t e sp r i m e r so fpt r i c h o c a r p ah o o k ，o u to f2 3 ，g a v ea m p l i f i c a t i o n o ns s u c h c w e n s i sa n ds i n t e g r at e s t e d o n em i c r o s a t e l l i t er e v e a l e dp o l y m o r p h i s m w h e n b e i n gf u r t h e rt e s t e dw i t h i n2 3i n d i v i d u a l so fs i n t e g r a t h ef a c te x p e r i m e n t a l l y c o n f i r m e dg o o dt r a n s p o r t a b i l i t ya c r o s sp o p u l u sl a n ds a l i xl k e yw o r d s ：s c a p r e a ；m i c r o s a t e l l i t e si s o l a t i o n ；m i c r o s a t e l l i t e sp c r a m p l i f i c a t i o n 致谢 本论文是在导师徐立安教授和黄敏仁教授的悉心指导下完成的，在此谨 向两位导师表示最诚挚的感谢! 在三年的学习和生活过程中，两位导师给予 了我很多的帮助，他们渊博的知识、敏锐的思维、儒雅的学风、宽厚的为人 以及严谨的治学态度都令我终生受益匪浅。 感谢我的父亲和家人，是他们默默地牺牲，无私的支持使我能有机会完 成三年的学习，希望在以后的人生道路上能弥补万一。 同时感谢教研组其它老师的指导和帮助，给我提供了一个良好的学术氛 围，使我能够顺利完成学位论文 怀念与本实验室几个同学共度的美好岁月! 感谢我的室友黄迎军同学，三年生活的点点滴滴将成为一段美好的回忆! 邓玉营 二o o 五年六月十八日 第一章文献综述 1 前言 柳树是杨柳科( s a l i c a c e a e ) 柳属 e a l i x ) 和钻天柳属( c h o s e n i a ) 树种的 统称。柳属树种为防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要树种，具有较高 的生态效益和经济效益，被誉为“社会与环境的资源”。全世界约有5 2 0 多种，是 世界上物种展多的属之一，除了澳洲和南极洲之外，各大洲都有其天然分布。中 国拥有其中的2 5 7 种、1 2 2 变种，种质资源丰富。由于部分柳属树种一年生时就 能开花结实，种间杂交相对容易，并且易于无性繁殖，加上柳属基因组相对较小， 是进行林木遗传学研究的理想材料。 国内外的研究人员在柳树生物学特性、种间变异及遗传改良方面做了大量工 作；但同其它树种一样，柳树遗传学研究很薄弱。尽管可用不同的遗传标记进行 不同性状在世代问的遗传变异规律等方面的研究，但由于分子标记标记具有数量 多、且大多为选择中性等特点，得到越来越广泛的应用。 2 1 遗传标记概念的界定 2 分子标记概述 遗传标记主要分为4 种类型，即形态标记、细胞学标记、生化标记和d n a 分子标记。前三种标记都是以基因表达的结果( 表现型) 为基础，是对基因的间接 反映：而d n a 分子标记则是d n a 水平遗传变异的直接反映，不受组织特异性、 发育阶段、生长环境的影响。其中共显性的标记，能够鉴别基因的杂合和纯合。 相对于前三种分子标记有明显的优越性。d b h t t p ：g d b w w w g d b o r g t 网站上对 各种遗传标记进行了总结1 2 2 分子标记的种类 分子标记已广泛应用于林木遗传育种、群体结构与遗传多样性研究、指纹图 谱绘制、性别鉴定、遗传图谱构建和数量性状基因q t l 定位等诸多方面。其中 应用最广泛的主要是以下几种： 2 2 1 限制性片段长度多态性标记( r f l p ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，缩写r f l p l 是发展最早的分子标记技术。原理是通过探针杂交，检测d n a 在限制性内切酶 酶切后形成的特定d n a 片段长度上的差异。因此凡是可以引起酶切位点变异的 突变如点突变( 新产生和去除酶切位点) 和一段d n a 的重新组织( 如插入和缺 失造成酶切位点问的长度发生变化) 等均可导致r f l p 的产生。 r f l p 虽然结果稳定可靠，重复性好；但操作复杂，费时费力，不同科之间 可以通用的探针多态频率低，由于这些缺点，使得r f l p 标记运用并不多。 2 2 2 随机扩增多态性标记( r a p d ) 该技术用一个( 有时用两个) 随机引物( 一般8 一l o 个碱基) 非定点地扩增 d n a 片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括：( 1 ) 不需d n a 探针。 设计引物也不需要知道序列信息；( 2 ) 用一个引物就可扩增出许多片段( 一般一 个引物可扩增6 1 2 条片段) ；( 3 ) 一般是显性遗传( 极少数是共显性遗传的) ， 这样对扩增产物的记录就可记为“有无”，意味着不能鉴别杂合子和纯合子；( 4 ) 重复性不太高，因为在p c r 反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变。 2 2 3 加锚微卫星寡核苷酸标记 z i e t k i e w i c z 等( 1 9 9 4 ) 对s s r 技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作 引物，对重复序列区间而不是其本身进行扩增。在s s r 的5 或3 端加上2 - 4 个 随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致重复序列间片段的扩 增。这类标记被称为i s s r ( i n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) ，但往往是显性遗传的。 2 2 4s c a r 标记 是在r a p d 技术的基础上发展起来的。其基本步骤是：先作r a p d 分析 然后把目标r a p d 片段( 如与某目的基因连锁的r a p d 片段) 进行克隆和测序， 根据原r a p d 片段两末端的序列设计特定引物( 一般比r a p d 引物长，通常有 2 4 个碱基) ，再进行p c r 特异扩增，这样就可把与原r a p d 片段相对应的单一 位点鉴定出来。这样的位点就称为s c a r 。因为它有更高的可重复性，共显性遗 传，所以比r a p d 在基因定位和作图中的应用更广泛。 2 2 5 扩增片段长度多态性标记( a f l p ) 其特点是把r f l p 和p c r 结合了起来。其基本步骤是：用限制性内切酶对 d n a 进行酶切，然后选择特定的片段进行p c r 扩增( 在片段两端加特定序列的 “接头”，用3 端有几个随机核苷酸的接头引物进行特异p c r 扩增( 只有那些与3 端严格配对的片段才能得到扩增) ，产生扩增片断长度不同的多态性带型。用放 射性标记、荧光标记或银染染色均可检测。 因为每个a f l p 引物产生的多态性片段丰富，是一种绘制指纹图谱的很好技 术。但由于a f l p 技术受专利保护，目前的应用不是很广。 2 2 6 单核苷酸多态性标记( s n p ) 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分 子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。s n p 傲为第三代多态性标 记，目前已有2 0 0 0 多个标记定位于人类染色体上，在林木上应用也越来越广， 本实验室在开展美洲黑杨与欧美杨图谱构建时，对特定区域的核苷酸序列进行比 较，检测出单个核苷酸的差异，把3 个s n p 标记定位于图谱上。 2 2 7 微卫星标记( s s r ) 微卫星( s s r ) ，是指由1 - 6 个核苷酸为单位( 也有2 8 个碱基一说) ( l i t ta n d l u t y , 1 9 $ 9 ) 。呈串联重复分布于整个基因组的d n a 序列。微卫星两翼序列相对保 守可以用于设计引物，特异性扩增出锻卫星位点，这就是微卫星标记。其特点包 2 括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点：共显性遗传，故可鉴别杂合子 和纯合子：得到的结果重复性高。 2 2 7 1 微卫星多态性形成机理 对微卫星多态性形成机理有多种假设，比较一致的观点是t a e h i d a 等( 1 9 9 2 ) 提出的复制和修复过程中的碱基滑动、错配或减数分裂过程中姊妹染色单体的不 均等交换产生多态性。而微卫星核心序列重复次数的差异是形成微卫星多态性的 基础，通常重复次数越多，其变异越大，则微卫星位点的等位基因数越多( m a s t 口，1 9 9 6 ) 。研究也表明，重复次数大于1 2 1 5 更适于作多态性标记( w e b e r ，1 9 9 0 ) 。 2 2 7 2 微卫星分类 按照重复单位的碱基数可将微卫星分为1 6 核苷酸重复类型，其中二核苷酸 重复有4 种类型：( a t ) n ( t a ) n ，( a g ) n ( t c ) n ，( a c ) r d ( g t ) n ，( g c ) r d ( c g ) n ；三核苷 酸重复有 10 种类型： a a t ) n ( t a t ) n ，( a a g ) n ，( t c t ) n ，( a a c ) n ( t g t ) n ， ( a t g ) n ( t c a ) n ，( a g t ) n ( t a c ) n ，( a g g ) n ，( t c c ) n ，( a g c ) n ( t g c ) n ， ( a c g ) n ( t c g ) n ，( a c c ) n ( t g g ) n ，( g g c ) n ( c g c ) n ：四核苷酸重复类型有3 2 种 ( j u r k ea n dp u t h i y a g o d a ，1 9 9 5 ) 。所有类型的微卫星中以单核苷酸重复和二核苷酸 重复的微卫星在基因组中出现的频率最高。 另外，w e b e r ( 1 9 9 0 ) 按照微卫星核心序列结构的不同将微卫星标记分为三种 类型：( 1 ) 完全型( p e r f e c t ) ：指核心序列以不间断的重复方式构成的微卫星；( 2 ) 不完全型( i m p e r f e c t ) ：指在微卫星的核心序列之间有几个非重复碱基，但其两端 的连续重复的核心序列重复次数大于3 ：( 3 ) 复合型( c o m p o u n d ) ：指两种或两种 以上的串联核心序列由几个连续的非重复碱基分隔开，但各种连续性的核心序列 重复次数不少于5 。 2 3 分子标记比较 表卜1 一些常用的分子遗传标记的特点 t a b i e l 1c h a r a c r e r is t i o no fs o m ep o p u l a rm o ie g u ia rm 8 r k e r s 3 林木研究中理想的分子标记应满足以下几个条件：( 1 ) 具有高的多态性；( 2 ) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型，因为林木多为 基因位点组成杂合的远交物种( o u t b r e ds p e c i e s ) ，显性标记不能区别杂合等位基 因，在分析时存在较大误差；( 3 ) 能明确辨别等位基因；( 4 ) 遍布整个基因组；( 5 ) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组：( 6 ) 选择中性( 即 无基因多效性) ：( 7 ) 检测手段简单、快速( 如实验程序易自动化) ：( 8 ) 开发成本 和使用成本尽量低廉；( 9 ) 重复性好，相对保守( 便于数据交换) 。 通过对几种分子标记的分析，发现微卫星标记 4 0 n t 时：t m = 8 1 5 + 1 6 6l g k + 卜6 7 5 i + 0 4 l ( g c ) ( 此公式适用于计算p c r 扩增产物韵t m ) 。在要求不严格的情况下常用经 验公式：t m = 2 ( a + t ) + 4 ( g + c ) ( ( a + t ) 、( o + c ) 指碱基的个数) 来换算； 合成引物时，报告单上也会有t m 值；软件( 典型的如p r i m e r m a s t e r ) 也可 以对引物t m 进行计算。 退火温度的确定有下面计算公式来确定：t a = 0 3 t m ( 引物) + 0 7 t m ( p c r 产物) 一1 4 9 ；退火温度应低于t m ，退火温度越高，特异性越高。 ( 3 ) 通过延长t m 低的引物，保证两个引物的t m 相差不超过4 ；( g + c ) 含量近似( 4 5 一5 5 ) 。 ( 4 ) 3 端引物无发夹结构，如果模板不很清楚，3 端最后一个碱基t ，g 或 c ，不选a 引物；如果模板很清楚，选a 提高特异性；两引物3 端应保证无互 补配对。 晟终，依靠p c r 引物设计程序辅助我们设计出符合要求的引物，下面是7 个用来设计引物的网址： n ) t h e p r i m e rg e n e r a t o r ( h t t p ：l w w w m e d j h u e d u m e d e e n t e r p r i m e r p r i m e r c g i ) ( 2 ) p r i m e r s ( h t t p ：w w w w i l l i a m s t o n e e o m p r i m e r s j a v a s c r i p t ) ( 3 ) t h eg p r i m ep a c k a g e ( h t t p ：l i f e a n u a u l m o l e c u l a r s o f t w a r e g p r i m e h t m 、 ( 4 ) w w w g e n ef i s h e r ( h t t p ：i l b o b i s e r v t e c h f a k u n i b i e t e f e l d d e g e n e f i s h e r ) ( 5 ) w e bp r i m e r s ( h t t p ：a l c e s m e d u m n e d u w e b p r i m e r s h t m l ) ( 6 ) p r o j e c td o p e 2 ( h t t p ：d o p e i n e r a c t i v a d e ) ( 7 ) w e bp r i m e r ( h t t p ：g e n o m e w w w 2 s t a n f o r d e d u s g d w e b p r i m e r ) 。 6 4 检测引物通用性及多态性检测 最终得到微卫星标记大致遵循这样的流程：成功的测序克隆，适宜引物设计 的独特微卫星，多态性的微卫星标记。所以设计得到的引物必须经过p c r 在基 因组d n a 中进行扩增，剔除那些两个反应产物片段大小不一致、非期望片段大 小的引物，才能成为可用的s s r 标记引物。s q u i r r e l l 等( 2 0 0 3 ) 在m o l e c u l a r e c o l o g y 发表文章对1 9 9 7 年到2 0 0 3 年开发微卫星标记的情况进行了统计( 如表 5 ) ，在所有开发微卫星标记的研究中，平均有只有2 4 1 的引物最终成为多态性 的s s r 标记，而1 7 7 的引物无多态性带，1 9 5 引物根本无法扩增。所以得到 1 7 6 5电泳选择 扩增微卫星片段由于使用引物的不同，可以扩增s s r 的间隔序列( 如t s s r 标记) ，也可扩增s s r 序列( w u ，1 9 9 4 ；z i e t k i e w i c z ，1 9 9 4 ，g u p t a ，1 9 9 4 ) ，现在 广泛应用的主要是对s s r 序列的扩增，即s s r 技术， 在胶的选择上，一般来说，在遗传作图或基因定位研究中，可以选用1 琼 脂糖胶来检测，因为s s r 标记为共显性标记，只要在两亲本间筛选出稳定的多 态性带，就可以通过连锁遗传分析，将其确定在染色体上。 但在品种指纹图谱分析或遗传多样性研究中，最好采用1 2 聚丙烯酰胺电泳 进行检测，因为在这类研究中需要尽可能区分出各种差异片段，这样在品种遗传 变异分析中才能得到准确结果。 7 本研究的目的和意义 人们对木本植物的认识相对于许多一年生植物和重要作物而言还比较贫乏， 有许多不同于一年生草本植物的生物学特性，为有效地经营现有的森林资源，需 要对木本植物的遗传机制进行更进一步的了解。杨柳科树种由于研究基础较好， 加上柳属物种丰富，种间杂交和无性系繁殖容易；核基因组相对较小，便于遗传 操作；本研究主要涉及的3 个种：杞柳组( c a e s i a e ) 中灌木一杞柳( s i n t e g r a ) ，筐 柳组( h e l i x ) 中灌木一簸箕柳( s s u c h o w e n s i s ) ，黄花柳组( v e t r i x ) q b 灌木一黄花柳 ( s c a p r e a ) 世代短一年即开花，可以弥补一般林木世代周期长的缺陷。因此， 具有较高的林木遗传学研究价值。 国内对其生物学特征、资源分布、森林培育、种群生态和生理各个方面有一 定的研究( 崔广芳等，2 0 0 1 ；周士兵，2 0 0 1 ；伊建良，1 9 9 9 ) 。但对分子遗传学研 究相对较薄弱。 目前已有大量研究显示s s r 标记在自然群体中揭示的变异频率是最高的 ( a l t u k h o va n ds a l m e n k o v a ，2 0 0 2 ；b y m ee ta l ，l9 9 6 ；s c h l o t t e r e r 。2 0 01 ) ，因而这类 标记在基因组中具有最高的位点杂合度：并且具有多态性高，共显性遗传，重复 性好等特点，因而是柳树遗传多样性、指纹图谱、比较图谱等研究的有效标记。 但迄今为止，在黄花柳，簸箕柳，杞柳中应用极少，柳树中现有可供筛选的 s s r 标记亦很少，引物的数量制约着s s r 标记在构建黄花柳，簸箕柳，杞柳遗 传连锁图谱研究中的应用。因此开发新的柳属s s r 标记显得迫切而重要。 本研究从几个方面探索开发柳属s s r 引物的途径：重点用世代周期只有一 年、表型性状差异较大的黄花柳构建富集微卫星文库，提出一条有效的柳树的微 卫星筛选分离策略，适用于柳属大规模微卫星标记开发。 随着杨柳科杨属毛果杨( p 护i c h o c a r p ah o o k ) 无性系n i s q u a l l y 1 全基因组 序列测定的完成( h t t p ：g e n o m e j g i p s f o r g p o p t r l p o p t r l h o m e h t m l ) ，为亲缘关系 密切的柳属开发通用性引物搭建了平台。本研究用杨属毛果杨( p 打i c h o c a r p a h o o k ) 2 3 对微卫星引物在簸箕柳和杞柳种问进行扩增，探讨把杨属s s r 引物用 于柳属，开发出杨柳科s s r 分子标记共用引物的可行性，为以后的工作打下基 础。 随羞对柳树研究的深入，铡序量会随着不断增加，从中挖掘微卫星序列并开 发成微卫星标记会成为一种有效的手段。本研究探索利用柳属核酸序列开发s s r 标记的途径，为下面的研究提供技术平台，同时也为利用数据库数据开发s s r 标记提供一条有效的途径。 1 9 第二章构建微卫星富集文库筛选微卫星序列 本实验室对柳属进行连锁图谱研究时，可供利用的s s r 分子标记较少( 具 体统计见第三章) ，所以开发柳属s s r 标记很有意义，而建库是开展微卫星研究 的最根本的途径( s a m b r o o k ，1 9 9 5 ) 。 首先提取5 个种的柳树d n a ，发现黄花柳d n a 纯度、得率都很高；同时由 于微卫星标记的通用性，黄花柳中的微卫星位点在其它种间同样适用；加上我们 所建立的几个f l 代、回交群体，都以黄花柳为父本。所以本研究选用黄花柳为 材料构建微卫星富集文库：用生物素标记的寡核苷酸探针 s s r 序列) 杂交，借 助磁珠分离出含微卫星的d n a 片段，p c r 来富集，然后用地高辛标记探针点杂 交进行二次筛选，测序得到微卫星。由于文库中富集微卫星，不存在大量筛选克 隆的问题；二次筛选，提高阳性克隆的比例，降低了测序成本。表2 1 列出了本 研究构建微卫星富集文库的技术路线。 表2 1 研究方法及技术路线 ( t a bie 2 - 1m e t h o d sa n dp r o o e d u r e ) 提取黄花柳d n a 用于建库 s a u 3 ai 酶切取3 0 0 - 10 0 0b p 与s a u 3 a i 接头连接 微卫星文 库构建 检测纯度 琼鹰腔检测 补平缺口 生物素标记探针( c t ) i s 和( g t ) l s 混台探针亲和捕获卜一t r i 。c i 溶解 p c r 富集后片段与载体p u c i l 8 或p g e m t e a s y 连接卜一 转化 重组质粒d n a 提取 点杂交筛选 白色菌斑 e c o r i 酶切释放质粒+ 插入片段，制各杂交膜| 一u v 固定 地高辛标记( c t ) a 和( g t ) i 混合探针杂交卜一洗膜显色 测序生物素标记探针捕瓠亮隆及= 次筛选阳性克隆) 卜一测序反应 序列分析及引物设计 p c r 反应条件的优化鹚傲卫星引物的多态性检涌 合成引物 1 - 1 植物材料 1 材料与方法 采集柳属4 个组中5 个种的柳树为材料：杞柳组( c a e s i a e ) 杞柳( s i n t e g r a ) ， 筐柳组( h e l i x ) 簸箕柳( s s u c h o w e n s i s ) ，柳组( s a l i x ) 垂柳( s b a b y l o n i c a ) ，黄枝白 柳( s a f 6 dv d t v i t e l l i n a ) ，黄花柳组( v e t r i x ) 黄花柳( s c a p r e a ) 的新鲜叶片，保存 于一7 0 冰箱中供提取d n a 用。 仪器及试剂 胶纯化试剂盒( w i z a r d s vg e la n dp c r c l e a n u ps y s t e m ) 、t a k a r a 公司接 头p c r 扩增试剂盒( l ap c r t mi nv i t r oc l o n i n gk i t ) 、提d n a 试剂盒( d n e a s y p l a n tm i n ik i t ) 、泛特津( v i t a g e n e ) 9 6 一e a s y 质粒试剂盒、p r o m e g a 公司链霉亲 和素化磁珠： 液相杂交缓冲液( 生物索标记探针) 配置： 2 0 s s c ( s o d i u m c h l o r i d e s o d i u mc i t r a t e ( b u f f e r ) ，氯化钠柠檬酸钠( 缓冲液) ) 点杂交( s o u t h e r n b l o t t i n g ) 缓冲液配置： ( 1 ) 预杂交和杂交液i ( 1 0 0 m l ) ： ( 2 5m l2 0 xs s c 、lm ll o n l a u r o y l s a r c o s i n e 、1 0m lb l o c k i n gb u f f e r ( 1 0 封 阻剂( b l o c k i n gr e a g e n t ) 、o 2m l1 0 s d s ) ： 预杂交和杂交液i i ( 7 s d s ，1m m e d t a p h8 o 】，o 2 6 3mn a 2 h p 0 4 p h 7 ；2 1 1 b s a ) ) ( 2 ) 显色反应缓冲液配置：( r o c h e 公司地高辛检测试剂盘( d i gd e t e c t i o ns t a r t e r k i t ) 马来酸缓冲液：1 0 0 m m o l l 马来酸，1 5 0 m m o l l n a c i ，p h 7 5 ，( 高压灭菌) ： 检测缓冲液：1 0 0 m m o l i t r i s c i ，1 0 0 m m o l 口n a c i ，p h 9 5 ；( 高压灭菌) ： 漂洗缓冲液：马来酸缓冲液中加0 3 ( v v ) t w e e n - 2 0 ： 封阻缓冲液：用马来酸缓冲液将1 0 封阻剂稀释成l 工作液： 抗体缓冲液：a n t i d i g1 00 0 0 r p m 离心5 m i n ，从表面按1 ：50 0 0 吸取于封阻 缓冲液中； 显色液：取4 0 1 a ln b t b c i p 于2 m l 检测缓冲液中。 1 2d n a 的提取 用d n e a s yp l a n t m i n i k i t 提取黄花柳d n a ( 按说明书) 用于建库。采用改进的 c t a b 裂解硅珠吸附法( z h a n gb o ，2 0 0 4 ) 提取柳属其它4 个种d n a ，方法如下： ( 1 ) 在1 0 毫升e p e n d o r f 管中加入4 毫升c t a b 提取液及8 0u l 巯基乙醇在 6 5 水浴锅中预热；( 2 ) 取植物材料1 2g ，适量液氮研磨成粉末后加入预热的 c t a b 提取液，充分摇匀后于6 5 水浴中3 0 r a i n ：( 3 ) 将样品置于冰上迅速冷却 至室温，加入等体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，充分混匀后1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，取 上清液1 m l 于1 5 m l 离心管中( 其余上清液于2 0 ( 2 保存备用) ；( 4 ) 加入1 0 0 u l 2 l 硅珠悬浮液( 1 2 9 硅珠粉末溶解于1 0 m l 无菌水) ，利用旋