（食品科学专业论文）保加利亚乳杆菌胞外多糖诱导人胃癌细胞凋亡的作用与机制.pdf

摘要摘要乳酸菌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e s ，e p s ) 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。正是因为乳酸菌胞外多糖具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡等有益的保健作用，才会掀起广大学者对其生理功能，尤其是抗肿瘤活性研究的浓厚兴趣。本研究以保加利亚乳杆菌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u sd e l b 7 u e c c k i is s p b u l g a r 耙u s lb e p s ) 为研究对象，分别采用m t t 比色法、g i e m s a 染色法、透射电镜技术、琼脂糖凝胶电泳技术、原位末端标记法( t u n e l ) 、流式细胞术、免疫细胞化学技术及实时定量p c r 技术等从l b e p s 对人胃癌s g c - 7 9 0 1 细胞生长的抑制作削、b e p s 对人胃癌s g c 7 9 0 1 细胞凋亡的诱导作用，及三6 e p s 对凋亡关键基因及蛋白表达的调控作用等三方面研究lb e p s 诱导人胃癌s g c 7 9 0 1 细胞凋亡的作用与机制，为进一步研究l b e p s 抑癌和诱导肿瘤细胞凋亡的机理提供试验依据。本研究得到的结果如下：( 1 ) l b e p s 对人胃癌s g c 7 9 0 1 细胞生长具有抑制作用。m t t 比色法研究发现，lb e p s 在1 0 m g m l 、4 0 r a g m l “的浓度下作用2 4 h ，细胞生长均受到不同程度的抑制，这一抑制作用随l 6 e p s 浓度的升高而增强。并且浓度与生长抑制率呈现明显的依赖效应，4 0 m g m l 。试验组抑制率达7 3 8 1 ；同时，lb e p s 在1 0 m g m l 4 0 m g m l 4 的浓度范围内，这一抑制作用随l b e p s 作用时间的延长而增强。时间与生长抑制率也呈现出依赖效应，1 0 m g m l “试验组抑制率从2 4 h 的5 2 2 8 提高到7 2 h的6 5 3 7 。( 2 ) 三b e p s 能诱导人胃癌s g c 7 9 0 1 细胞凋亡。g i e m s a 染色法结果显示，胃癌s g c - 7 9 0 1 细胞经4 0 m g m l lb e p s 作用2 4 h 后细胞逐渐变圆，体积缩小，胞浆浓缩，胞核着色较深且固缩碎裂，胞膜表面有芽状突起( 凋亡前期状态) ，显示出较为典型的凋亡症状和趋势。透射电镜结果发现，经4 0 m g m l lb e p s 作用2 4 h 的s g c 7 9 0 1 细胞，细胞核缩小，其形态扭曲并出现断裂，且结构不完整，呈碎裂状，染色质凝集成不规则团簇，核仁消失，细胞浆普遍出现空泡，对照组核膜与细胞膜仍保持完整，核内染色质分布均匀。琼脂糖凝胶电泳结果显示，只有2 0 r a g m l lb e p s 作用2 4 h 的s g c 7 9 0 1 细胞提取d n a 后，在凝胶上形成较为明显的梯状谱带，其他浓度未出现梯状谱带。t u n e l 结果发现，随着b e p s 浓度( 1 0 m g m u l ，2 0 m g - m 一，4 0 m g m l “) 的增加，s g c 7 9 0 1 细胞的胞核区域的阳性细胞比率逐渐增加，多糖组凋亡指数显著高于空白对照组的凋亡指数，多糖高剂量组( 4 0m g - m l “) 作用2 4 h 后，凋亡指数可达9 8 4 。流式细胞术结果显示，lbe p s 呈剂量依赖性地诱导s g c 一7 9 0 1 细胞凋亡，4 0m g m l “的上b e p s 促凋亡作用最为明显，细胞凋亡率可达到8 6 。同时lb e p s 也呈时间依赖性地诱导s g c - 7 9 0 l细胞凋亡，同时伴有细胞的坏死，其中1 0 m g m l 。作用7 2 h 的上b e p s 对s g c 一7 9 0 1 细胞的促捅亡作用最为明显，细胞凋亡率可达到4 2 。东北农业大学工学硕士学位论文( 3 ) lb e p s 剥凋亡关键基因及蛋白表达具有调控作用。免疫细胞化学和实时定量一p c r 结果显示，在体外条件下，lbe p s 可在m r n a 水平和蛋白水平f 调胃癌细胞b c l 2 基因的表达而上调b a x 基网的表达，诱发胃癌细胞发生凋亡。由上述结果得到以下结论：体外检测表明，b e p s 对人胃癌s g c 7 9 0 1 细胞具有诱导细胞凋亡的效应。并且b c l 2 和b a x 在l b e p s 诱导s g c 7 9 0 1 细胞产生细胞凋亡的过程中，其蛋o n 基因表达量分别出现下调和上调的趋势，提示b c l 2 和b a x 在lb e p s 引起胃癌s g c - 7 9 0 1细胞产生细胞凋亡效应的过程中，可通过凋亡信号转导途径产生致凋亡效应。关键词：保加利亚乳杆菌；胞外多糖；s g c 一7 9 0 1 缅胞；细胞凋亡；原位末端标记法；实时定量p c r 方法t 】a b s t r a c tm e c h a n i s mf o ra p o p t o s i so fh u m a ng a s t r i cc a r c i n o m ac e l ld u et oe x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u sa b s t r a c tl a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) ，l i k eo t h e rb a c t e r i a , a r ea b l et op r o d u c es e v e r a lt y p e so fp o l y s a c c h a r i d e st h a ta r ec l a s s i f i e da c c o r d i n gw i t ht h e i r 】o c a t i o nr e l a t i v et ot h ec e l l t h o s et h a ta r ee x c r e t e do u t s i d et h ee e l lw a l la r er e f e r e dt oe x o c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e so re x o p o l y s a c c h a r i d e s( e p s s ) t h e yc a nf o r ma na d h e r e n tc o h e s i v el a y e ra n da r ec a l l e dc a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e s t h ee p s sa l s oc a r le i t h e rb e1 0 0 s e l ya t t a c h e do rb ec o m p l e t e l ye x c r e t e dj nt h ee n v i r o n m e n t t h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e sh a v ea t t r a c t e dp e o p l e si n t e r e s t so np h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c ha sj m m u n o l o g i c a la c t i v i t y a n t i - t u m o ra c t i v i t ya n da n t i a n a b r o s i sa c t i v i t ye x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e db yl a e t o b a c i l l u sd e l b r u e c c k i is s p b u l g a r i c u s b e p s ) w a si n v e s t i g a t e df r o mt h r e ea s p e c t si nt h i sp a p e r , w h i c hi n c l u d e dm t ta s s a y , g i e m a s as t a i n i n gm e t h o d t e m ，a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t u n e la s s a y ，f c m ，i m m u n o c y t o c h e m i s t r ya n dr e a l - t i m ep c rt e c h n i q u e s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s( 1 ) l6 e p sc o u l di n h i b i t t h ec e i lg r o w t ho f s g c 7 9 0 1c e l l s b ym t ta s s a y , i t si n h i b i t o r yr a t eh a dt h ec o r r e l a t i o nw i t ht i m ea n dd o s a g e a tf l a ec o n c e n t r a t i o no f 4 0 m g m l “f o r2 4 h f i l ei n h i b i t o r yr a t eo f s g c 7 9 0 1e e l lc o u l dr e a c ht o7 3 8 】m e a n w h i l e i f t h es g c 一7 9 0 1c e l l sw e r et r e a t e dw i t hl b e p sf r o m2 4 ht o7 2 ha tt h ec o n c e n t r a t i o no fl o m g 。m l i t si n h i b i t o r yr a t em i g h tc h a n g ef r o m5 2 2 8 t o6 5 3 7 ( 2 ) lb e p sc o u l di n d u c ea p o p t o s i so f s g c 7 9 0 1c e l l s t h er e s u l t so fg e m s as t a i n i n gm e t h o dr e v e a l e dt h a ts g c 7 9 0 】e e l l1 1 a dm o r p h o l o g i c a 】c h a n g e sw i t hf o l l o w i n gc h a r a c t e r i s t i c s ：s u p e r - a g g r e g a t i o no fc h r o m a t i n ，c h r o m a t i nc l u m p i n gi na p o p t o t i cn u c l e i c e l lb o d yt u r n i n gr o u n d ，i t ss h a p e sd e c r e a s i n gg r e a t l y , s u r f a c eb l e b b i n g b yu s i n gt e m t h ec e l l sn u c l e u sb e c o m i n gs h r i n k i n g a n dt h es h a p eb e i n gt w i s t e do rr u p t u r e db ylbe p s( 4 0 m g m l lf o r2 4 h ) ，t h e r ew e r em o r ev a c u o l e si nt h ec y t o p l a s m ，w h i l et h ec o n t r o lg r o u ph a dt h ei n t e g t yo f t h ew h o l eb o d ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i si n d i c a t e d ，o n l yd n ae x t r a c t i o na f t e rb e i n gt r e a t e dw i t hl6 e p sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f 2 0 m g m l f o r2 4 hm i 曲t1 c a dt od n a1 a d d e r so nt h eg e l 、a n dd n al a d d e r sw e r en o to b s e r v e df o ro t h e r s t u n e la s s a ys h o w e dt h a tw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n s ( 10 m g m l ，2 0 m g m l ，4 0 m g m l “) i n c r e a s i n g s g c 一7 9 0 】m a s c c l i n ec e l l si i i东北农业大学工学硕士学位论文r a t e si nt h en u c l e a rz o n e si n c r e a s e dg r a d u a l l y a p o p t o s i si n d e x ( a i ) i n be p sg r o u p sw a sh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p s a 1m i g h tr e a c ht o9 8 4 a f t e rb e i n gt r e a t e dw i t hlb e p sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f 4 0m g m l “f o r2 4 ht h er e s u l t so f f c mi n d i c a t e dt h a ts g c 一7 9 0 1c e l l sa p o p t o s i st r e a t e dw i t h上be p sw e r ed o s e - d e p e n d e n tt h ea p o p t o s i sr a t em i g h tr e a c ht o8 6 a tt h ec o n c e n t r a t i o no f4 0m g m l a tt h es m n et i m e s g c 一7 9 0 1c e l l sa p o p t o s i st r e a t e dw i t hl be p sw e r et i m e d e p e n d e n ta l o n gw i t hc e l l u l a rn e c r o s i s t h ea p o p t o s i sr a t em i g h tr e a c ht o4 2 a tt h ec o n c e n t r a t i o no f10m 2 - m l 。1f o r7 2 h ( 3 ) 工6 e p sc o u l dr e g u l a t et h ek e yp r o t e i n sa n dg e n e si na p o p t o s i si ns g c 一7 9 0 1c e l l st h er e s u l t so fl m m u n o c y t o c h e m i s t r ya n dr e a l t i m ep c rt e c h n i q u e si n d i c a t e dt h a t 上6e p sm i g h ti n d u c es g c 一7 9 0 1c e l l sa p o p t o s i sb yb c l - 2d o w n - r e g u l a t e da n db a xu p r e g u l a t e da tm r n aa n dp r o t e i nl e v e l si nv i t r o t h ec o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h er e s u l t sa b o v es u g g e s t e dt h a ta p o p t o s i so fs g c 7 9 0 1c e l l sc o u l db ei n d u c e db y 6 e p si nv i n 0 a n dt h ed e c r e a s eo f b c l 2a n dt h ei n c r e a s eo f b a xa tt h em r n aa n dp r o t e i nl e v e lm i g h tb eo n eo ft h ea p o p t o t i cm e c h a n i s m sb yw h i c h 6 e p si n d u c e di ns g c 一7 9 0 1c e l l l i n e s k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c c k i is s p b u l g a r i c u s ；e x o p o l y s a c c h a r i d e ；s g c 7 9 0 1c e l il i n e s ；a p o p t o s i s ；t u n e l ；r e a l - t i m ep c rc a n d i d a t e ：l i uy us p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c es u p e r v i s o r ：p r o m e n gx i a n g c h e n独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得一( 洼i 塑遗直墓丝置要挂型主明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：刻绮日期：瓶7 年6 月，夕日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：刻喑导师签名：面j 彳盘目期：砧年6 月日日期：呻年月，p 日1 前言1 1 立题背景乳酸菌( 1 a c t i ca c i db a c t e r i a ，l a b ) 是人类应用最早的细菌之一，而且许多乳酸菌是人体肠道的固有有益菌( p r u a s - m a d i e d o 等，2 0 0 2 ) ，所以人们对其研究、应用与开发等做了大量工作，并且也取得了许多成果。早在公元前3 0 0 0 年，人类就已经懂得利用乳酸菌生产诸如干酪、面包、鱼、肉等发酵食品。随着乳酸菌( l a b ) 在农业、食品工业及生物医药等领域的大量应用，人们发现乳酸菌不但能提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间；而且它还是人肠道中极为重要的生理菌群，它担负着人体多种重要的生理功能，能调节肠道菌群、维持体内微生态平衡、抑制肠道内腐败菌生长繁殖、消除体内有毒物质的产生、改善便秘、降低胆固醇水平、改善肝功能、缓解乳糖不耐症、改善维生素代谢、增强免疫、抗肿瘤、抗突变等，具有维持人体微生态平衡的作用。乳酸菌除了其在肠道内定植、代谢产生乳酸等作用以及有效酶活性外，一些次生代谢产物，如胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e , e p s ) 也发挥了十分重要的作用，与机体健康息息相关。乳酸菌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e s ，e p s ) 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。自本世纪初，俄国著名的微生物学家，诺贝尔生理学及医学奖获得者e m e t e h n i k o f f 发表了“长寿说”以来，有关乳酸菌与人体健康方面的研究未曾停止过。胞外多糖所具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡等，也可应用于医药领域。也正是因为乳酸菌的这些有益的保健作用，才会掀起广大学者对其生理功能，尤其是抗肿瘤活性研究的浓厚兴趣。张筠等( 2 0 0 4 ) 通过研究发现乳酸菌胞外多糖在体内具有的抗肿瘤作用机制可能与提高宿主免疫力有关；在体外可以抑制人肿瘤细胞的生长，初步分析其抑制肿瘤细胞生长作用可能与其促肿瘤细胞凋亡有关。细胞凋亡是维持个体正常生理过程的自主性细胞死亡形式，贯穿生命活动的始终。它对多细胞生物体的成长、发育和生理稳定具有重要作用。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展与转移有密切的关系。乳酸菌胞外多糖能诱导肿瘤细胞发生凋亡但其诱导细胞凋亡的机制目前研究较少，尤其是乳酸菌胞外多糖直接诱导肿瘤细胞凋亡的研究目前少有报道。因此，建立本课题开展对乳酸菌胞外多糖促肿瘤细胞凋亡机制的进一步研究。1 2 乳酸菌胞外多糖抗肿瘤活性的研究进展乳酸菌( l a b ) 胞外多糖( e p s ) 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。s h i o m i 等( 1 9 8 5 ) 于1 9 8 5东北农业大学工学硕士学位论文年发现了发酵乳中乳酸菌产生的e p s 在活体内具有抗肿瘤活性，引起广大学者对乳酸菌胞外多糖抗肿瘤活性研究的兴趣。特别近二十年来，有关乳酸菌对多种肿瘤发生与发展抑制作用的研究，更是层出不穷，并取得了许多研究成果( h xw a n g 等，1 9 9 6 ；ah i r a z u m i ，1 9 9 9 ；顾瑞霞，1 9 9 9 ) 。由于乳酸菌是食品级工业生产用菌，与其他菌相比安全性高，所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究也逐渐增多。乳酸菌胞外多糖具有多种生物活性，如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡等，因此也可应用于医药领域。1 2 1 乳酸菌胞外多糖的生理功能乳酸菌作为一类被公认为安全的微生物，长期用于多种发酵食品的加工，已被人类食用了上千年。乳酸菌对人体健康的调节作用，如调节胃肠道菌群组成( tm a t s u z a k i ，1 9 9 0 ) 、预防和治疗各种腹泻( m n a g a o k a 等，1 9 9 4 ) 、免疫调节( t o b a 等，1 9 9 9 ；m z u b i l l a g a 等，2 0 0 1 ) 、抗高血压( 吴正军等。2 0 0 4 ) ，抗氧化性( m y l i n 等，2 0 0 0 ；m t e r a h a r a 等，2 0 0 1 ，2 0 0 2 ：tk u u i s a a r 等，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ) 、降低血清胆固醇( 郑坚，2 0 0 2 ；罗冬英，2 0 0 2 ) 等已得到广泛得研究和论述，但对其抗肿瘤活性的研究还处于起步阶段，相关文献资料也比较有限。到目前为止，很多乳酸菌都被试验过是否具有抗肿瘤活性，研究结果表明，并不是所有乳酸菌都具有抗肿瘤特性，而真正具有抗肿瘤特性的乳酸菌还是十分有限的( 表1 1 ) ( j bb r i a n 等，1 9 9 2 ；顾瑞霞等，1 9 9 5 ) 。表l ，l 具有抗肿瘤特性的乳酸菌种类t a b 1 - 1l a e t o b a c i l l u s 、“t la n t i - t u m o ra e t i v i t y菌名嗜酸乳杆菌l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s唾液乳杆菌l a c t o b a c i l l u ss a l i v a r i u s短乳杆菌l a c t o b a c i l l u sb r e v i s草绿色乳杆菌l a c t o b a c i l l u sv i r i d e s c e n s德氏乳杆菌保加利亚亚种l bd e l b r u e c c k i is u b s p b u l g a r i c u s纤维二糖乳杆菌l a c t o b a c i u u sc e l l o b i o s u s干酪乳杆菌干酪亚种三矗e a s e is u b s p c a s e i发酵乳杆菌l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t i唾液链球菌嗜热亚种s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s乳酸乳球菌乳脂亚种血l a c t i ss u b s p c r e m o r i s瑞士乳杆菌l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s肠膜明串珠菌肠膜亚种l e u c m e s e n t e r o i d e ss u b s p m e s e n t e r o i d e s瑞士乳杆菌约古特亚种l b h e l v e t i c u ss u b s p j u g u r t i婴儿双歧杆菌b i f i d o b a c t e r i u mi n f a n t i s詹森乳杆菌b a c t e r i u ml a c t i c u mj a n s e n青春双歧杆菌b i f m o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t i s两歧双歧杆菌b i f i d o b a c t e r i u mb i f 洳n植物乳杆菌l a c t o b a e i l l u sp l a n t a r u m长双歧杆菌b i f i d o b a c t e r i u ml o n g u mm u k a i 等( 1 9 9 0 ) 报道，由高加索乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a u c a s i c u s ) 和粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ) 产生的酸乳酒胞外多糖( k e f i r a n ) ，能提高荷瘤鼠的迟发型超敏反应一h o s o n o 等( 1 9 9 7 ) 报道，由青春双歧杆菌m 1 0 1 - 4 产生的e p s 具有免疫调节作用。k i t a z a w a2前言等( 2 0 0 0 ) 从保加利亚乳杆菌o l l l 0 7 3 r - 1 中分离出来的胞外脂多糖具有增加巨噬细胞的作用。顾瑞霞( 2 0 0 0 ) 对唾液链球菌嗜热亚种的研究发现，e p s 对小鼠的细胞免疫和体液免疫均有促进作用。1 2 2 乳酸菌胞外多糖抗肿瘤活性的研究o d a 等( 1 9 8 3 ) 早在8 0 年代就确定了由瑞士乳杆菌约古特亚种nh e l v e t i c u ss s p , j u g u m )产生的e p s 具有抗肿瘤活性。通过腹腔注射e p s 提取液来测定其延长移植性腹水瘤s 1 8 0 小鼠生命的作用。给- 予 2 0 m g k f le p s9 天，小鼠生命延长率为1 4 4 ，剂量增加至4 0 m g k 百1 或8 0 r a g k 2 1 时，则生命延长率为2 3 3 。作者认为，e p s 的抗肿瘤作用机制可能是通过增强宿主免疫力实现的。k i t a z a w a 等( 1 9 9 1 ) 发现腹腔注射乳酸乳杆菌乳脂亚种k v s 2 0 冻干粉可以抑制小鼠s 1 肉瘤，但是此菌株在体外抑制s l 舯肉瘤细胞试验中未显示出其直接的细胞毒作用。研究结果显示，此菌株抑制肿瘤细胞增殖作用是基于提高宿主的免疫活性来实现的。作者认为由乳酸乳杆菌乳脂亚种k v s 2 0 产生的粘液多糖对抗肿瘤活性起着主要作用。此后k i t a z a w a 等( 1 9 9 2 ) 又经研究发现，由乳酸乳杆菌乳脂亚种k v s 2 0 产生的粘液多糖对b - 淋巴细胞有较强的增殖作用。而且，n a k a j i m a 等( 1 9 9 5 ) 研究发现，给鼠腹腔注射乳酸乳杆菌乳脂亚种s b t 0 4 9 5 产生的e p s 可以增加其特定抗体的含量，说明此种e p s 可能作为一种药物佐剂。据报道，酸奶发酵剂德氏乳杆菌保加利亚亚种o l l l 0 7 3 r - 1 具有调节宿主抗肿瘤活性的作用分离到的e p s 可分为两部分：中性多糖和酸性多糖，研究发现，酸性多糖1 0 7 3 部分对鼠b 淋巴细胞具有有效的增殖活性。在此之前，e b i n a 等曾观察到此菌产生的胞外多糖对双移植性肉瘤体系显示出抗肿瘤活性，而且指出，对宿主的调节机制与激活其免疫细胞( 如淋巴细胞和巨噬细胞) 有关( 张筠等，2 0 0 4 ) 。乳酸菌胞外多糖对肿瘤的抑制作用举例如表1 - 2 ( 陈晓红，2 0 0 3 ) 所示。表1 - 2 乳酸菌胞外多糖对肉瘤1 8 0 ( 腹水) 的抑制作用t 曲1 - 21 1 1 er e s t r a i n so f lbe p so nt h es a r c o m a1 8 0东北农业大学工学硕士学位论文1 2 3 乳酸菌胞外多糖抗肿瘤活性可能的作用机制目前，对乳酸菌及其代谢产物( 如胞外多糖) 的抗肿瘤作用机制研究得不是很透彻，一般认为是通过以下几个途径发挥其抗肿瘤活性的。1 2 3 1 抑制转化致癌物质粪便酶的产生及活性动物试验已经证实，结肠中的细菌酶，特别是一些能催化致癌前体物质向致癌物质转化的粪便酶起源于粪便病原微生物菌丛，产生的这些酶主要包括：b 葡糖苷酶、b 葡糖苷酸酶、硝基还原酶、偶氮还原酶和甾醇7 - i x - 脱氢木聚糖酶等。一些乳酸菌，如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等能耐受胃部不利条件而到达肠道的细菌，在抑制这些酶的生成及活性上起重要作用( dc o m m a n e 等，2 0 0 5 ) ，其作用形式包括：( 1 ) 代谢产生的乳酸、醋酸等有机酸，抑制病原微生物的生长和发育；( 2 ) 代谢产生的一些细菌素，抑制有害微生物的生长；( 3 ) 促进胃肠蠕动，减少致癌物质与上皮细胞的接触以及抑制粘膜上皮细胞的再生；( 4 ) 形成不利于粪便酶作用的环境。1 2 3 2 对机体免疫系统的促进抗肿瘤免疫反应中，巨噬细胞的杀瘤作用常具有重要意义。许多研究结果表明，乳酸菌及其发酵产品，均能激活机体的免疫系统，特别是巨噬细胞、n k 细胞和b 淋巴细胞而对t细胞则无直接作用。v e s e l y 等人( 1 9 8 5 ) 从鼠的饲喂试验发现，活菌和热处理的酸奶到1 5 天均能提高鼠的i g g 2 | 和i g m ，并使网状内皮细胞吞噬作用活性增强。从青春双歧杆菌a t c c l 5 7 0 3 培养物的上清液中分离得到的胞外物质，能诱导鼠肝细胞的突变活性，从胞外物质中分离得到的e p s ，显示出较高的淋巴增殖应答促进作用( ls a c h s 等，1 9 9 3 ) 。瑞士乳杆菌约古特亚种产生的胞外多糖，对植入到鼠中的腹水肉瘤1 8 0 具有抗肿瘤活性。由高加索乳杆菌和粪便菌株产生的开菲尔糖( k e f i r a a ) 经证明能通过提高肿瘤鼠的迟发型过敏性应答来抑制肿瘤的生长( e g o m e z 等，1 9 8 8 ) 。因此可以看出，多糖免疫性的提高，是通过t 细胞诱导的，而不是b 细胞。来自于乳酸菌发酵乳或外源乳酸菌制剂比肠道固有乳酸菌具有更强的免疫促进作用，而且混合菌株比单一菌株的促进作用强。树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，d c ) 是粘膜免疫系统的重要的组成部分之一，有加工、呈递外来抗原、初始化静息t 细胞的功能。c h f i s t e n s e n 等( 2 0 0 2 ) 报道，将用放射法处理致死的益生菌与i x ；共同孵育后，益生菌能够上调表面的m h ci i 类分子和b 7 2 ( c d 8 6 ) ，而后者代表d c 的成熟，这就提示肠道d c 的免疫调节功能可能部分是受益生菌调节的。i 2 3 3 诱导n o 的产生n o 在哺乳动物机体的物质代谢、信息传递以及防御疾病方面起重要作用。目前很多证据表明，n o 的诱导合成是活化的巨嗜细胞杀伤肿瘤细胞的主要机制之一。n o 可以通过下述两个可能机制杀伤肿瘤细胞( 王立生，1 9 9 8 ) ：( 1 ) n o 能与肿瘤代谢关键酶活性部位的f e - s 基结合形成f e - 亚硝基复合物，从而使酶失活，继而引起细胞毒性；( 2 ) n o 能与氧4结合，最终形成能强有力杀伤细胞的羟自由基和n 0 2 。完整肽聚糖( w h o l ep e p t i d o g l y c a n ,w ig ) 和磷壁酸是n o 合成酶的诱导剂。1 2 3 4 抗突变活性致癌作用是通过致癌物诱导动物细胞突变开始的。一些乳酸菌可抑制动物细胞的突变。h o s o n o ( 1 9 8 6 ) 报道了德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳杆菌乳酸亚种制作的发酵乳能抑制突变剂体外诱导大肠杆菌发生突变。后来的研究证明，短双歧杆菌、青春双歧杆菌、分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酪乳杆菌与两种突变剂( 3 氨基1 a 二甲基5 吡啶吲哚，t r p - p - l ；3 一氨基1 甲基一5 h 一5 吡啶一吲哚，t r p - p 2 ) 有效结合。有研究证实，乳酸菌的细胞壁是抗突变作用的主要结构。还有研究证明，口服乳酸菌能降低健康人尿液的致突变作用，并认为这可能与肠道菌群改善有关。这些研究结果表明一些乳酸菌可通过抗突变作用达到抗肿瘤的目的。1 2 3 5 诱导细胞凋亡，细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列级联式的主动性细胞死亡的过程。b c l - 2 蛋白家族在凋亡调控中占有重要的地位，其中的成员b c l - 2 、b c l - x l 、b c l - w 、m c l 一1以及a l 具有抗凋亡的作用，而b a x 、b a k 和b a d 却具有促凋亡功能。b a d 能和b c l x l结合形成异源二聚体，逆转b c l x l 的抑制凋亡活性，对细胞程序性死亡过程起启动作用( r gw i c k r e m a s i n g h e 等，1 9 9 9 ) 。此外，细胞凋亡也是一个复杂的、由依赖天门冬氨酸的半胱氨酸酶( c a s p a s e ) 家庭成员介导的蛋白酶级联反应过程其中c a s p a s e - 3 被认为是各种凋亡刺激因子激活c a s p a s e 家庭中的关键蛋白酶，活化后能使多种细胞骨架蛋白发生裂解，导致细胞从所黏附的基质上脱落以及细胞形态异常而出现凋亡另一方面，活化的c a s p a s e - 3 也可直接激活内源性核酸酶，最终使细胞发生凋亡( n a t h o m b e r r y 等，1 9 9 8 ；l s u n 等，2 0 0 3 ) 。王立生等( 2 0 0 1 ) 将荷瘤小鼠经过双歧杆菌作用后，发现大肠癌移植瘤组表达b a d 和c a s p a s e - 3基因的表达率以及阳性细胞密度显著增高，提示双歧杆菌增强凋亡促进基因b a d 和c a s p a s e的表达是其诱导肿瘤细胞凋亡的一个途径在另一研究中，实验者( 王立生等，1 9 9 8 ) 以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型用原位末端标记法、免疫组化法和电镜检测了双歧杆菌注射组和对照组移植瘤的凋亡细胞以及b c l - 2 ，b a x 基因的表达水平。结果发现，在电镜下，双歧杆菌注射组中可见多处处于凋亡不同时期的癌细胞，呈灶状或弥散分布，而对照组凋亡细胞数量极少；双歧杆菌注射组和肿瘤对照组大肠癌移植瘤组织b c l - 2 蛋白表达率分别为7 0 和9 0 ，b a x 基因的表达率分别为1 0 0 0 , 6 和4 0 ，说明青春双歧杆菌可调节移植瘤b c i 一2 及b a x 基因的表达，下调b c l - 2 基因，增加b a x b c l 2的比例，最终诱导肿瘤细胞的凋亡。目前，有关多糖类物质诱导各种肿瘤细胞凋亡的报道也不少，但大都局限于植物多糖和真菌多糖，也有很多中药类多糖成功诱导肿瘤细胞凋亡的例子。张星星等( 2 0 0 1 ) 将h l 6 0细胞与不同浓度的梁金菇多糖共同孵育一定时间后荧光显微镜及电镜下观察，都可见部分细胞有胞膜起泡、核碎裂、核固缩、凋亡小体形成、染色质边集碎裂而细胞膜完整等典型形态学表现：d n a 电泳结果可见到明显的梯形带；流式细胞仪可见到低于2 倍体的峰，可见梁5东北农业大学工学硕士学位论文金菇多糖可诱导h l - 6 0 细胞发生典型凋亡。刘长喜等( 2 0 0 1 ) 采用体外细胞培养方法，观察复合真菌多糖诱导人肝癌细胞b e l 7 4 0 2 凋亡的作用，利用双重免疫标记方法分析肿瘤抑制基因p 5 3 在b e l 一7 4 0 2 凋亡中的表达，结果表明：不同浓度的复合真菌多糖均能明显诱导b e l 7 4 0 2细胞凋亡，并随浓度增加而渐次出现不同时相的细胞凋亡特征性染色质凝聚：能明显降低g 1 和s 期，且有显著的剂量效应关系，凋亡细胞百分率亦随多糖浓度的增加而逐渐升高：在高浓度组出现典型的d n a 阶梯状电泳条带。宋高臣等( 2 0 0 5 ) 通过试验提示：桦菌芝多耱能够抑制h e p a 小鼠肿瘤生长，增加免疫器官重量，促进体内i l 2 的产生，提高小鼠单核吞噬细胞功能，即通过提高机体免疫功能来实现抗肿瘤作用。吴振等( 2 0 0 5 ) 用紫草素诱导a 3 7 5 s 2 细胞凋亡的试验提示：紫草素可能是通过p 5 3 激活促凋亡蛋白b a x ，而b a x 导致细胞色素c 的释放和c a s p a s e 酶的激活进而致使a 3 7 5 s 2 细胞凋亡。袁淑兰等( 2 0 0 0 ) 用叶酸与肝癌细胞共同培养，发现不同浓度的叶酸对肝癌细胞增殖具有不同程度的抑制作用，并可能通过上调凋亡相关基因p 5 3 和f 如的表达、下调b c i 2 和t g f 1 3 1 的表达，阻止细胞于g o ，g l期，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。而对乳酸菌胞外多糖诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究仍处起步阶段。1 2 3 6 端粒酶端粒酶( t e l o m e r a s e ) 是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶，它能够利用自身携带的r n a 作为模版逆转录合成端粒，从而维持端粒的长度，使细胞获得无限增殖的能力。大多数肿瘤细胞都表现出较高的端粒酶活性。正常体细胞由于缺乏端粒酶活性，其端粒随着细胞分裂逐渐缩短，细胞逐渐老化、死亡。王跃等( 2 0 0 0 ) 采用p c r e l i s a 法，检测了经双歧杆菌表面分子脂磷壁酸( 1 i p o t e i c h o i c a e i d l t a ) 处理前后的h l - 6 0 白血病细胞株端粒酶活性的改变。发现经l t a 处理后。h l - 6 0 白血病细胞的生长受到抑制，端粒酶活性明显降低，说明双歧杆菌l t a 对 i i 6 0 白血病细胞具有生长抑制作用，其抗肿瘤活性机理可能和抑制肿瘤细胞的端粒酶有关。乳酸菌在轻工、食品、医药及饲料等许多行业都有广泛的应用，是一类具有重要经济价值的微生物。现在已经知道，乳酸菌发挥主要生理功能特性的作用机理，除了定植、主要代谢产物( 乳酸等) 的作用以及有效酶活力外一些次生代谢产物，如胞外多糖也发挥着重要的作用。而乳酸菌胞外多糖这类物质在发酵乳制品生理功能特性中所处的位置，一直是国内外众多学者的研究热点之一。目前，对乳酸菌胞外多糖的抗肿瘤作用机制研究得不是很透彻，一般认为是通过以下几个途径发挥其抗肿瘤活性的：( 1 ) 抑制转化致癌物质粪便酶的产生及活性；( 2 ) 对机体免疫系统的促进；( 3 ) 诱导n o 的产生；( 4 ) 抗突变活性；( 5 ) 诱导细胞凋亡；( 6 ) 端粒酶等。在这六种机制中，对机体免疫系统的促进和诱导细胞凋亡这两种作用机制比较重要。其中提高机体免疫力途径研究得比较多，即通过其细胞壁中的胞壁酰二肽( m d p ) 、脂磷壁酸来激活免疫系统中的巨噬细胞、n k 细胞及b 细胞等免疫效应细胞，使之分泌具有杀瘤活性的细胞毒性效应分子，如白细胞介素i ( i l 1 ) 、白细胞介素v i ( i l - 6 ) 、肿瘤坏死因子( t n f - a ) 、n o 以及多种抗体来抑制肿瘤的发生；但对通过调控肿瘤细胞凋亡相关基因的表达，最终诱导肿瘤细胞凋亡途径的研究还不是很深入，相关文献也很有限。这对全面开发乳酸菌胞外多糖的应用有一定的限制作用。我国乳酸菌资源丰富、来源广泛，而且乳酸菌作为6一种食品级的非特异性生物反应调节剂，具有安全、毒副作用小等特点，所以对乳酸菌胞外多糖促肿瘤细胞凋亡分子机制的研究具有重要的理论意义和实践意义。1 3 本研究的主要内容1 以人胃癌细胞为靶细胞，研究乳酸菌胞外多糖对胃癌s g c 7 9 0 1 细胞的生长抑制作用；2 以人胃癌细胞为靶细胞，通过形态学、d n a 片断化、凋亡指数以及细胞凋亡率等四个方面检测乳酸菌胞外