（分析化学专业论文）用于细胞内与生命相关金属离子检测的新型荧光探针的研究与应用.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：寝丽均 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权刳童可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：柱甬炳 签字日期：2 0 0 侈年支月谚日 、 导师擀、孙冬 签字日期：2 0 0 锣年上月z g 日 奄扩 ，、弋 山东师范大学硕十论文 摘要 生命活动是由许多生物活性物质参加的各种化学反应的结果，金属离子就是 其中重要的一种。生物体内的必需微量金属元素直接参与机体内几乎所有的生理 过程，他们在维持蛋白质，核酸，肽类和激素等生物大分子的基本结构和实现其 正常功能方面起着重要的作用。而另外一些金属元素特别是重金属元素在浓度较 低时就会对生物体产生较大的毒性和破坏性。因此，生物体内金属离子的研究和 检测特别是对细胞内金属离子的检测具有重要的意义。 目前，用于检测生物体内金属离子的方法有多种，如原子吸收发射光谱法， 高效液相色谱法，电感耦合等离子体质谱法，电化学法，化学发光法等，这些方 法具有较高的灵敏度和选择性并常用于定量分析，然而他们不适用于在生物体内 在线检测金属离子，不能描述被测物在细胞内的分布和动态变化。与上述方法相 比，荧光检测法由于具有高选择性、高灵敏度、不破坏样品和易于实现在线检测 等优点而具有很广泛的应用前景。寻找新的具有高选择性的金属离子荧光分子探 针已成为现代分析化学中的一大前沿课题。 近几年来，随着激光共聚焦成像技术的发展，在细胞内实时、在线检测金属 离子成为研究的热点，特别是近红外荧光探针在生物分析中显示出更大的优越 性。这是因为在位于6 5 0 9 0 0 纳米的近红外区域内，生物体及组织的光吸收或荧 光强度很小，生物组织的荧光背景干扰大大降低，并且近红外光能深入到组织内 部，因此近红外荧光探针更适用于细胞的荧光成像。另外，在各种金属离子荧光 探针中，利用光诱导电子转移( p e t ) 原理设计的荧光探针，由于结合金属离子 前后，荧光强度差别较大，灵敏度高，应用最广泛。 因此设计合成金属离子近红外荧光探针，在化学体系中试验其性质，结合激 光共聚焦荧光成像技术，实时在线检测细胞内某种金属离子的浓度变化及其分 布，探讨各种金属离子在生命活动中所发挥的作用以及对某种离子缺陷时出现的 病理进行研究，将为生物学以及医学的发展提供必要的依据。 本论文基于光诱导电子转移原理，设计研制新型近红外荧光探针应用于细胞 内金属离子的检测，开展了两方面的工作： ( ) 设计合成了一种新型的用于检测细胞内汞离子的近红外荧光探针 3 ，9 一二硫6 氮杂十_ 烷一丙基花菁，通过核磁共振氢谱，碳谱，质谱等手段对探 山东师范人学硕十论文 针结构进行了表征。研究了反应机理。用普通荧光法对汞离子进行定量分析测定， 结果表明探针对汞离子具有较高的选择性和灵敏度。h 印g 2 人肝癌细胞和斑马鱼 内汞离子的激光共聚焦荧光成像实验表明，探针具有良好的生物适用性。 ( 二) 设计合成了一种新型的乙基花菁类近红外荧光探针。描述了它的设计， 合成。初步分析实验表明该探针具有较宽的激发波长范围及窄的发射波长范围， 并且对镍离子具有较高的选择性。 2 关键词：金属离子，花菁类近红外荧光探针，汞离子，镍离子，细胞成像 山东师范人学硕十论文 a b s t r a c t t h e a c t i v i t yo fl i f ei sa ne f f e c to fd i f i f e r e n tc h e m i c a lr e a c t i o n sb yl o t so fb i 0 1 0 西c a l a c t i v es u b s t a l l c e s ，a i l dm e t a li o n si sa ni m p o n a n tk i n do ft h e m e s s e l l t i a lt r 狮em e t a l e l e m e n t sp a n i c i p a t ei na h i l o s ta 1 1t h ep h y s i o l o 百c a lp r o c e s s e s ，f o re x 锄p l e ，t l l e yp l a y c r i t i c a lr o l e s 洫m a i n t a i n i n gt l l es 仃u c t u r ea n d r e a l i z i r 培t t l en o 衄a 1 胁c t i o no fp r o t e 虮 n u c l e i ca c i d ，p e p t i d e s ，i i l c r e t i o na n do 血e rb i gb i o l o g ym o l e c u l e b e s i d e s ，s o m eo t l l e r m e t a le l 锄e n t ss u c h 舔h e a v ym e t a l i o n sa r et o x i c 锄dh a r m f h lt oo r g a l l i s m se v e na t v e r y1 0 wc o n c 劬a t i o i l s s om ed e t e c t i o no fm e t a li o n se s p e c i a l l ym ed e t e c t i o ni n 、，i v 0a 1 1 di ns i t ui si n i p o r t a n tt 0t h er e s e a r c ho fb i o l o g y ，m e d i c i n ea i l de n v i 】o m e n t s c i e n c e c u r i 铷tm e t h o d sf o rd e t e c 血gm e t a li o 璐h a v ea k e a d yb e e nd e v e l o p e d ，s u c h 弱 a t o m i ca b s o 印t i o l 】删s s i o ns p e c 们s c o p y ，l l i 咖p e 怕吼a 1 1 c e1 i q u i dc h r o m a t o 目a p h y l c ) ，i 1 1 d u c t i v e l yc o u p l e dp l 踟l am a u s ss p e c 仃d m e 时( i c p m s ) ，e l e c 仃0 c h 锄i s 咄 c h e m i l 啪i n e s c e i l c e ( c l ) ，a n d 廿1 e yd i s p l a yl l i 曲s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v 时a i l da r e u s u a l l yu s e df o rq u a n t i t i v ea 1 1 a l y s i s h o w e v t h e s e 嬲s a y sa r en o ts u i t a b l ef o r m o l l i t 0 血gm e t a li o n s0 n1 i i l e ，趾dt 1 1 e yc a i ln o td e s c 曲et h ed i s t r i b 诋ga l l dd y n 锄i c c h 孤g e so f 廿1 ea i l i ls u b s t a i l c c si nc e l l s c o n l p a r e d 诵t h 仕l ea b o v et e c h l l i q u e s ，t h e n u o r c s c e mm e t t l o di sap o w e d mt o o li nc e l l b i 0 1 0 9 yb e c a u s eo fi t sg e n e r a l i y n o n d e s t n l c t i v ec h a r a c t 1 1 i 曲s e l l s i t i 啊t ya 1 1 ds p e c i 丘c i 批s e a r c b i n gf o rn o v e lm e t a l i o i l sn u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e sw i t hl l i g hs e l e c t i v i t yh 硒a t 仃a c t e d1 a r g ea t t e n t i o no f c u r r e ma n a l ”i c a lc h e m i s t r y a st h ed e v e l o p m 锄to fe o 0 c a lf l u o r e s c e n c ei m a 蕾n gt e c l l 王1 i q u e ，n l en e a r - i n 丘a r e d r e 垂0 n( n 吸n u o r e s c e n tp r o b e sa r em o r es u i t a b l ef o ri 1 1 缸粥e 1 1 u l a rn u o r e s c e n t h 画n g ，b e c a u s e 访衄sa r e at l l e r ei s1 0 wb a c k g r o 眦l dn u o r e s c e i l c ei n t e r 衔e i l c ei n b i 0 1 0 舀c a ls y s t e m s b e s i d e s ， p h o t o i n d u c e de l e c t r o n仃a n s f 钌 ( p e t )q u e n c l l i n g m e c h a n j s mh a v em o r es e n s i t i 、，i t ym a no t l l e rm e c h a l l i s m s ，s op e tf l u o r e s c e m m 0 1 e c u l a rp r o b e sa r em o r ea t 仃a c t i v e w bn e e dt 0d e s i 印a n ds ) 7 1 1 t 1 1 e s i z em e t a li o n sn e 弘i n 自面e dr e 百o nn u o r e s c 翩t p r o b e s ，姐ds t u d yt h ep r o p e r t yo fm ep r o b e si nc h e m i c a ls y s t e m ，a 1 1 dm e nd e t e c tt h e c o n c e n t r a t i o nc h a l l g e sa n dt h ed i s t 咖u t i o no fm e t a l i o n si nc e l lo nl i n ea c c o r d i n gt o c o n f o c a ln u o r e s c e n c e 洫a g i n gt e c h n 0 1 0 9 y t l l i sw i l lb eh e l p m l t oe x p l o r em e6 m c t i o n o fm e t a lj o n si n1 i f ea c t i v i t ya n dp a t h 0 1 0 9 yo ft h es h o r t n e s so f m e t a li o n sa n da 肺r d e s s e n t i a lb a s i sf o rb i 0 1 0 9 ya n dm e d i c i n es t u d y 山东师范大学硕十论文 b a s e do nt h ep h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ( p e t ) q u e n c h i n gm e c h a i l i s mi n d e s i g n i n gn e w t y p e dn e a r - i n f a r e dr e 百o nn u o r e s c e n tp r o b e sf o rt r a p p i n gm e t a l i o n si n c e l l s ，w eh a v ec 删e do u tt 、) l ，oa s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，w ed e s i g n e da n ds y n t l l e s i z e dan e wm e r c u r y ( ) n e a r - i i l 丘a r e dr e g i o n n u o r c s c e n tp r o b e3 ，9 一d i m i a 一6 一m o n o a z a 吼d e c a i l e t r i c a r b o c y a n i n ea 1 1 dc h a r a c t 丽z e di t b y1 h - n 吣u c n m ra n dm a s ss p e c t r o m e 奶t h er e a c t i o nm e c h 锄i s mw a ss t u d i e d e x c e l l e n ts e l l s i t i v i t ) ra n ds e l e c t i v i t yf o rm e r c u 五ci o n sa r eo b s e n r e dw i t l lt h i sp r o b e c o i 疵l c a li i l i c r o s c o p i ci m a g i l l go fh 矿十w i t l l i nh 印g 2c e l l sa i l d5 一d a y - 0 1 dz e b r a f i s h r e v e a l st h a tm ep r o b ei sc e l l - p e 衄e a b l e s e c o n d ，w ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dan e wn e a r i a r e dr e 百o nf l u o r e s c 朗tp r o b e t h ef l u o r e s c e l l c es p e c 协l mo fm ep r o b es h o w e dw i d ee x c i t a t i o na 1 1 dn a n 0 w 即 1 i s s i o n p r i m a r ya n a l 妒ce x p e r i m e n ts h o w e dt h a ti ti ss e l e c t i v et 0n i c l 泛l i o n k e y w o r d s ：m e t a li o i l s ，佩c 盯b o c 蛐1 i 1 1 e b a s e dn 破n u o r e s c e n tp r o b e ，m e r c 面ci o n ， n i c k e li o n ，c e l li i i l a g i l l g 4 山尔师范人学硕十论文 第一章前言 金属离子在生命科学研究中占有重要地位。设计合成对某些金属离子有高选 择性和灵敏度，具有合适光谱性质的荧光探针，在化学环境下试验其性质，并结 合荧光成像技术，实时在线检测细胞内的金属离子，将为生物学以及医学的研究 提供必要的依据。 第一节概述 在生物体内，金属离子广泛参与生命过程，在许多生理过程中起着广泛和重 要的作用【l 】。金属离子与生命科学、环境科学、医学等领域有着密不可分的联系。 识别和检测细胞内的金属离子在分析化学中占有重要地位。 多种金属( 如f e 、c u 、c o 、m o 、z n 、c a 、m g 、k 、n a 等) 离子对于生命体 是必不可少的，他们在维持蛋白质、核酸、肽类和激素等生物大分子的基本结构 和实现其正常功能方面起着重要的作用【2 】。金属最大的特征就是失去电子成为带 正电荷的离子，因此存在于生物体液中的是各种形式的金属离子，它们能与生物 分子产生各种键合作用，从而在各种生命过程中发挥着形形色色的生物学功能。 据统计，大约一半以上的蛋白质都含有金属离子，体内金属离子过多或过少都将 导致人体正常生理功能的紊乱p 。5 】。 另外，自然界存在的9 0 种元素中，有5 3 种是重金属。重金属如汞、铬、镉、 铅等残留在环境及食物链逐渐富集，通过农畜产品进入消费者体内长期超量积累， 对人类安全构成威胁f 6 】。由于它们大多数属于过渡元素，因此它们的电子排列方 式不仅决定了它们可以形成复合物，而且在固氮、水净化、碳碳键的重排、基因 转录、细胞的发育调控等复杂的生化反应中起着重要的作用。然而，在更多情况 下它们却担当着负面效应的角色，重金属离子在浓度很高的情况下会在细胞内累 积形成非特异性的复合物而引起细胞中毒【刁，某些金属离子例如c d 2 + 、a 矿等有 很高的毒性，它们能够替代细胞内有功能的金属离子，结合于重要的呼吸蛋白上， 导致蛋白质和d n a 变性。汞及其化合物属于剧毒物质8 。10 1 ，汞在自然界中以多种 形式存在，汞的形态不同，产生的毒性也不同。无机汞盐会引起急性中毒，表现 为急性胃肠炎，脑，胃等器官的损害。另外，水溶性环境中的细菌能把无机汞离 子转化成甲基汞，甲基汞的脂溶性高，易和蛋白质中的巯基结合，其毒性是无机 山东师范大学硕十论文 汞的1 0 0 倍，它能在海洋生物体内蓄积，经过食物链进入人体，导致中枢神经系 统和内分泌系统的疾病。 总之，金属元素在整个生命体系中起着重要的作用。金属离子与核酸、蛋白 质等生物大分子的作用以及对神经系统不正常的影响可以直接或间接地损伤 d n a 从而引起细胞的变异，进而导致各种疾病。探讨各种金属离子在生命活动 中所发挥的作用以及对某种离子导致出现的病理进行研究，建立有效而实用的原 位( i ns 沁) 、在体( i nv i v o ) 、实时( r e a l t i m e ) 检测系统，将为生物学以及医 学的研究提供必要的依据。 目前已经建立的测定金属离子的方法，主要有原子吸收( a a s ) 】发射光 谱法( a e s ) 【1 2 】，分光光度法【1 3 - 1 6 1 ，高效液相色谱法( h p l c ) 【1 7 1 ，电感耦合等 离子体质谱法( i c p m s ) 【18 1 ，化学发光法【1 9 】，电化学法( 极谱法和伏安法) 【2 0 纠， 荧光分析法【2 2 圆】等。原子吸收分光光度法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力 强、应用范围广等优点，目前已经成为各个部门、教学科研单位普遍使用的一种 分析测试方法。其缺点是测定难熔元素的灵敏度不高；而且，测定每种元素都需 要一个特定元素的空心阴极灯，这对同时测定试样中多种元素颇为不便，此外， 该方法不能反映所测元素的价态。分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建 立的分析方法，此法定性定量较好、灵敏度高、操作简单、仪器价格便宜，但是， 由于过渡金属离子结构和离子半径差别不大，在光度分析中常彼此干扰，导致测 定方法的选择性不理想。i c p m s 法和h p l c 法所需仪器昂贵，样品预处理复杂， 操作也比较繁琐。化学发光法选择性较差，不适于低浓度的生物样品的测定。电 化学方法测定金属离子主要有极谱法和伏安法，具有灵敏、快速和简单的优点， 应用广泛。荧光检测法不仅方法简便，而且在灵敏度、选择性、响应时间、现场 测定( 如荧光成像技术) 及生物应用等方面均有其突出优点。近年来，荧光分析法 在金属元素的分析中的应用越来越广泛，从天然水饮用水到废水污水，从土壤大 气到动植物，从人体的头发骨骼血液到内脏等各个器官涉及到的样品和应用范围 几乎是无所不有。荧光分析法具有很高的灵敏度，比紫外可见光分光光度法高2 4 个数量级，还具有选择性、重现性好、取样量少、简洁快速的优点。荧光检测的 方法主要有荧光生成、荧光猝灭、催化荧光，随着微机激光及电子学等一些新科 学技术的引入还产生了诸如同步荧光、导数荧光、三位荧光等的新技术，使荧光 分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展。荧光分析法的灵敏度准 6 山东师范人学硕七论文 确度和选择性不断提高。而且，最近荧光光谱及成像技术得到了快速的发展，主 要是在生物分析领域中应用广泛。 由于多数待测物质本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较低，人们用荧光试 剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质， 使检出限大大降低，这就是荧光探针。近几年来，关于金属离子荧光探针的研究 发展迅速，多种荧光探针已被设计合成用于测定金属离子。如m u l ( u l e s hb a m a h 等【3 0 】设计合成了以b o d 口y 为母体的荧光探针检测k + ；g i v o a n n af a 硼】g 西a 等 【3 1 1 设计合成了以8 羟基喹啉为母体的荧光探针检测m 孑+ 并应用于生物体系； c h u a i lh e 等【3 2 1 设计合成了以m e r r 系列蛋白质为识别配体的荧光探针检测h 孑+ ； 删ym o k l l i r 等【3 3 1 设计合成了基于荧光共振能量转移原理的荧光探针检测 c u 2 + 。荧光探针法是对金属离子进行定量分析的重要方法。 7 山东师范人学硕士论文 第二节金属离子荧光探针的设计 通常评价金属离子荧光探针的性能主要从灵敏度、选择性、实时性和原位检 测性能等4 个方面来考虑。灵敏度方面主要又包括许多因素：如探针与被检测金 属离子的结合强度；识别信息的荧光信号转换效率；另外，荧光团的发射波长、 量子产率、斯托克斯位移、背景荧光干扰和仪器性能等也会影响探针的灵敏度。 选择性方面主要取决于探针与被检测金属离子的结合选择性，有时被结合的金属 离子可直接影响荧光团的荧光发射性能，这种情况下识别选择性还与被结合的金 属离子性质有关；当然专一选择性是最好的。荧光探针的实时性主要包括识别响 应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快于或与被检测金属离子的变化 速度相匹配，则可称之为实时响应探针。原位检测性能主要取决于荧光探针分子 与被检测金属离子的相容性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体系并发出 识别信号；一般情况下，水溶性的探针比非水溶性探针好。 1 荧光探针法测定金属离子的基本原理 荧光探针识别和检测金属离子的基本原理是基于主体分子对离子的识别，荧 光基团则起信号转换作用。通过将主体分子的识别信息转换为光信号，并以荧光 基团的光物理性质来表达，如荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化 等，最终实现离子的检测。 1 1 光诱导电子转移原理 在各种金属离子荧光探针中，利用光诱导电子转移 3 4 3 7 】( p e t ，p h o t o i i l d u c e d e l e c t r o n 廿a i l s f e r ) 原理设计的荧光探针最为常见，典型的p e t 荧光探针体系是由 具有电子给与能力的金属离子识别基团( 受体，r e c 印t o r ) ，通过间隔基团( s p a c e r ) 和荧光团( f 1 u o r o p h o r e ) 三部分构成的功能分子。其中荧光团部分是光能吸收和 荧光发射的场所，受体部分则用于结合客体，这两部分被间隔基团隔开，但又靠 间隔基团相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号 变化的超分子体系。此类探针中，识别基团的识别信息与荧光信号之间的转化是 靠光诱导电子转移完成的。具体过程如图l 所示，具有电子给与能力的受体能够 将处于最高能级的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使荧光 团被光激发的电子无法直接跃迁回原基态轨道发射荧光，导致荧光团的荧光猝灭 山东师范大学硕十论文 ( 图1 a ) 。当受体与金属离子结合后，降低了识别基团的给电子能力，p e t 过程 被减弱或不再发生，使荧光团的荧光发射增强( 图l b ) 。由于结合离子前后，荧 光强度差别很大，呈明显的“关”，“开”状态，这类探针又被称为荧光分子开关。 r 图1p e t 体系的光诱导过程。( a ) 无金属离子( b ) 键合金属离子 在已报道的金属离子荧光探针中，基于光诱导电子转移( p e t ) 原理设计的 探针最为常见，且灵敏度较高。如图2 所示，h 0 n g 等【3 6 】以双( 羟基苯乙烯) 哌 嗪为荧光团，双( 2 一甲基吡啶) 胺( d p a ) 为受体，合成了一类p b 2 + 传感器。该 化合物是一个典型的p e t 金属离子荧光分子探针，由于d p a 基团氮原子上孤对 电子的存在而产生p e t 效应，导致荧光猝灭。d p a 与p b 2 + 结合后，降低了识别基 团的给电子能力，p e t 过程被阻断，使荧光团的荧光发射增强。 荧光共振能量转移原理 图2p b 2 + p e t 荧光分子探针 山东师范人学硕十沦文 荧光共振能量转移( f r e t ，f 1 u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) 原理【3 8 4 0 j 是指能量从一种受激发的荧光基团( d o n o r ，供体) ，以非辐射的方式转移到另一 种荧光基团( a c c e p t o r ，受体) 的物理现象。实际可以利用的d a 对，必须同时满 足以下几个条件：( 1 ) 供体的发射光谱和受体的激发光谱要尽可能重叠；( 2 ) 供体 的s t o r k s 位移要足够大，或者说供体和受体的激发光谱要尽可能分开；( 3 ) 供体 和受体的发射光谱也要远离。实际上发生荧光共振能量转移的条件是很苛刻的， 供体和受体除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列，距离足够近。 f r e t 荧光探针目前主要应用于生物大分子的动态分析，应用于金属离子测 定的f i 疆t 荧光探针还不是很广泛【4 1 。3 1 。如图3 所示，t a k e n a k a 等【4 4 】以6 羧基 荧光素( 6 一f a m ) 和6 一羧基四甲基罗丹明( 6 一t a 凇a ) 分别作为供体和受体，以 对k + 特异结合的寡聚核苷酸为连接臂，得到了一种可用于活细胞内k + 测定的k + 传感器。当无k + 存在时，寡聚核苷酸以随机螺旋状存在，供受体相对远离，f i 冱t 难以发生。当k + 存在时，寡聚核苷酸折叠成高级结构，使6 剧m 和6 t a 凇a 靠近，f r e t 发生，从而实现对k + 的检测。 1 、j _ _ 峰 1 3 分子内电荷转移原理 下哪h 晰m ，。 h 、 - 图3f 1 砸t 金属离子荧光探针 光诱导的分子内电荷转移( i c t ，i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 4 5 4 8 1 由于其独 特的光物理性质，近年来受到了极大的重视。此类荧光探针是荧光团上分别连接 电子供体和电子受体，具有较强的推一拉电子体系，电子供体与电子受体共轭相 连，在光激发下会产生从电子供体向电子受体的电荷转移。当金属离子与识别基 团结合以后，会对分子的推一拉电子作用产生影响，引起其偶极距的变化，从而 ， 山尔师范大学硕十论文 导致荧光光谱的变化，发生光谱蓝移或红移。 另外，还有一种扭曲的分子内电荷转移m ( t 、v i s t e di n t r 锄o l e c u l a rc h a r g e t r a j l s f e r ，t i c t ) 。在具有推拉电子共轭体系的荧光分子中，如果电子供体是通过 单键与荧光团相连的，当荧光团被光子激发时，由于强烈的分子内光诱导电荷转 移，导致原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋转，而与芳环平面处于正交状态， 原来的共轭系统被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形成t i c t 激发 态。 一般情况下，虽然i c t 荧光探针的荧光强度不如p e t 荧光探针的荧光强 度变化明显。但是，由于可以实现不同吸收或发射波长下的比例检测，故不受仪 器灵敏度、底物浓度变化等因素的影响，这样不仅大大降低被测离子的检出限， 同时可以提高准确度。最近，彭孝军等 5 0 】报道了一个基于i c t 原理设计的检测 细胞内镉离子的新型荧光探针( 如图4 所示) ，该探针的h s h c l 缓冲溶液中加入 镉离子后荧光显著增强，同时荧光峰蓝移2 9m ，并且该探针能较好的区分锌离 子和镉离子。该探针的生物应用价值通过比率荧光显微成像得到了证明。 妒量 q 嗨 ，、，l 弋f1 乞矿 人久 h h 鳓糟4 r 蕊。露；謦。槛c ee 邑；，孙0 幽a 鬈e 毫o f c d ：+ 血d ec e l h 正e i t e 孓s p 2 岱缸搬麓豫铽e n c e 氆主c r c 。p e o 锄e c ：l 他l 老n 谚( a ) c 艚熬血 心a 钽d 娥也li j ；3 0 ( 奄 d cc e l 稔主l 姒i 轻a t e dm 啦l 嫩at h e 扛蠹眦甄簸 波u b a t e dw 涵! 黔ic 跹b 图4i c t 金属离子荧光探针 山东师范大学硕十论文 1 4 基于其它原理的荧光分子探针 大多数金属离子荧光探针是基于上述几种原理设计的，还有少量探针是按照 其它原理设计的，并常常有出奇制胜的效果。 t a e 等【5 l 】设计合成了一种以罗丹名为母体的荧光探针1 ，如图5 所示，该探针 的p b s 缓冲溶液中加入汞离子后荧光显著增强并红移，进一步检测发现生成了脱 硫产物。化合物l 是对汞离子有选择性的化学反应荧光分子探针，这类不可逆的 化学计量性的识别分子也被称为化学计量剂( c h 锄o d o s i m e t e r ) 。 式鳞苎 | c 、嚣 图5 化学反应型金属离子荧光探针 另外，最近报道了很多生物传感器【5 2 5 6 1 ，利用金属离子与生物识别因素( 例 如：酶、脱辅基酶蛋白质、金属键键合蛋白、抗体等) 的相互作用实现对金属离 子的检测。如图6 所示，c h u a l l 等【5 7 1 设计合成了一个包含c u + 金属调和蛋白( c u e r ) 的d n a 片断，其中碱基p 坤l o c 与g 配对，使得p y 玎o l o 的荧光猝灭，当加入c u + 后，c u + 与c u e r 结合，碱基对c 与g 分离，p y 玎0 1 0 荧光恢复。该探针对c u + 具有较 1 2 山东师范人学硕十论文 高的选择性和灵敏度。 躺弼瀚 h j c 矿 l _ - _ _ 囊 舂石啊 5 ，毙o e 嚣：艺嚣o l ：1 峨西| 譬t _ 3 珊啪抗l o j c 鼬妇a 触娥p a i f 诵l hg 渤 啦燃洫嗽听o f 粥别：逸蛳喇i l l 龇劬l 麟l 斛a 阻 御燃根黼悯蚀r 硒妇五蛔t l i e 曲a d 铆瑚删 耱c m e 堪冶远珊删弼也越僦鳓b 泌缸叠旌淞锄a 研e c u + 幻h 盈 轴庙k 钨b 粥黼l 氆砑妇go 垂? p ! | 7 n 蛩i a 一夏啊l 函h 孙i 伍绒f 窑盈i 柏娆鬟毙瞰拇越 “5 舭 图6c u e r 型生物传感器检测c u + 2 荧光探针检测金属离子的设计思路 荧光探针的基本设计思路是在荧光染料母体上引入受体单元，金属离子与受 体单元相结合，并影响荧光团的光物理性质，通过荧光的变化直观地体现金属离 子的存在。 2 1 荧光团 荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达为荧 光信号。目前用于标记或衍生的荧光试剂主要有荧光素类、罗丹明类、邻苯二甲 醛类等化合物，它们本身或衍生产物具有很高的荧光量子产率，但最大吸收波长 和荧光发射波长多小于6 0 0 衄。而对生物样品而言，其样品基体和一些杂质在此 区域也会有吸收或荧光，再加上光散射的影响往往会产生较为严重的背景干扰， 限制了荧光分析法灵敏度的提高【5 8 5 9 1 。 随着激光共聚焦成像技术的发展，在细胞内实时、在线检测金属离子成为研 究的热点，这对荧光探针提出了新的要求，即要发展近红外荧光探针。近红外荧 南“ 心v一 山东师范大学硕士论文 光染料发射波长在6 5 0 姗到9 0 0n m 之间，在这一波长范围内，生物样品基体光 吸收或荧光强度很小，因而背景干扰大大降低，并且由于散射光强度与波长的四 次方成反比，随波长的增加，拉曼散射迅速减小，使散射干扰也大为减少，从而 能够提高分析的灵敏度，因此近红外荧光探针在生物分析中显示出更大的优越性 【烈m 2 1 。目前，最常用的近红外荧光染料主要有b o d 口y 类化合物【6 3 1 ，花菁类化 合物【6 4 击6 1 ，方酸菁类染料【6 7 1 ，酞菁类染剃6 8 。6 9 】等。另外，探针中荧光团还要便于 与识别基团连接。 2 2 识别基团 识别基团的设计是探针分子设计的重要环节。它决定分子探针与被识别客体 的结合灵敏度和选择性。金属离子荧光分子探针中一般常用的识别基团有冠醚 【7 们3 1 、开链聚醚【7 4 1 、多氨基化合物【7 5 】等。 大部分受体与金属离子的选择性结合主要由杂原子( 氧，硫，氮) 与金属离子 的配位作用，和受体分子孔穴的相对尺寸决定。含氧原子的受体为硬碱，对碱金 属和碱土金属离子有较强的络合作用。当部分或全部氧原子被硫原子所替代后对 重金属或过渡金属离子有特异的络合能力。受体空腔及杂原子的不同，表现出对 不同的金属离子显著的选择性。 在生物体系中有富足其它离子，会对某一种离子的检验造成干扰。因此，受 体在荧光分子探针中具有重要的作用，它决定了分子探针与被识别客体的结合灵 敏性和选择性。这种结合性能是荧光分子探针对被识别客体具有选择性和灵敏性 的前提。 1 4 山东师范大学硕十论文 第三节细胞及组织内金属离子荧光成像 荧光成像生物分析的迅速发展，深化了人们在分子水平上对生物化学过程的 了解。荧光显微镜与荧光光谱仪耦合而成的系统仪器能够获取显微荧光成像及微 区荧光强度、荧光寿命的测定信息。选择荧光探针对被标记物进行特异性标记， 荧光探针的亮度即荧光强度可反映被标记物相对含量的多少。荧光显微镜对图像 采集后，荧光光谱仪可测量图像的荧光强度，对获取的图像进行荧光强度的定量， 为全面分析和研究细胞内部结构提供更加详尽的数据信息。它能对完整的活细胞 和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量和定位的测量，功能强大， 可操作性强，特别是在细胞生理过程的定量研究方面具有巨大的的优势。在细胞 及组织内实时，在线检测金属离子成为研究的热点，设计荧光探针与金属离子结 合，应用荧光显微技术检测细胞内游离金属离子的变化，具有灵敏度高，操作便 捷等优点【7 6 7 7 1 。 目前已报道有多种荧光探针用于金属离子的荧光成像。比如，m 矿+ 在生命过 程中能够促进骨及细胞形成，介导酶反应，参与体内能量代谢，并在能量的输送、 储存中起着关键的作用，选择合适的荧光探针分析研究m 矿+ 具有重要的现实意 义。y o s l l i os u z 出等【7 8 】设计合成了测定细胞内m 矿+ 浓度的荧光探针 l 跚g 2 0 触和g 2 7 蜥，如图7 所示，利用荧光显微镜观察p c i 2 细胞内 m 矛+ 的浓度分布，得到满意结果。z i l 2 + 在细胞生长、生存中所起到的关键作用已 在生物学和生理学中得到认识。如图8 所示，t o n l o y ah i r a i l o 等设计了检测海 马鱼组织切片中z n 2 + 的荧光探针z i l a f 一1 f 和z i u 虹2 f ，通过荧光显微镜观察切 片组织切片中z n 2 + 的荧光成像，结果令人满意。 目前有两大问题横亘在新的荧光成像技术探索的道路上：一是细胞在可见光 区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是对所研究分子的长期荧光标记观 察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。其中花菁类近红外荧 光探针应用最为广泛，本课题组设计合成了一种锌离子花菁类近红外分子荧光探 针【8 0 】，通过结合激光共聚焦扫描显微技术，我们将探针成功应用于巨噬细胞( 如 图9 所示) 。 山东师范大学硕士论文 c a 挝e rn g ft r e a t m e n t ( 3d a y s ) b d l o a d i n gw i t hk m g 2 0 - a m i p 舞0 。“潼 | 、鬻 a i 协rn g f t r 醐t m n t 5d a y 暑)l o a d i n g 籼t hk 粥g 2 7 - a 赫 f g u r e7 d i ca f 倒目u o r e s 值n li m a g e so fp c i 2c e h s o a d e d 锄t h 跚g - 2 m a 潮 1 0 p m ) a f 埘k m g 刃诅m 1 0 l | 麟了h e 洲o fl h en u c e u 8i $ e v 鸭a n ds o m eb 6 9 h 时s p o l s 啪治o b s 鲋e di nt h e 叫o p l a s ma n d 卵m h c e 图7m 9 2 + 荧光探针在p c i 2 细胞内成像 f i g u r e8 。f i u o r e s c e n c el m a g e so fz n a f - 2 fd ai o a c 培dr a th i p p o c a m p u ss l i c e 8 了b es l ；c e 8w e ，ei f l c u b a t e d 封j m1 0 p m z n a f 2 fc af = d ri5 ha lr d 0 m 培m p e f u r e ，t h e nt h es l k e sw e r ew a s h e d 澌廿1a c s f wo 5ha n dn u o 潞s c e n m a g e x c 瞻da t4 7 良4 9 0n mw e f e 冉挹a s u r e df a ) b e f o r ea n d ( b a f l e rm e u b a t i 。nw i l h15 0 p m1 p e nf o ro 5ha lr o o m 协竹1 p e f a t u r e 图8z n 2 + 荧光探针在海马鱼组织切片中成像 1 j 尔师范人学硕十论文 f i g 茸e9 c o 盛x a in f e 轼e n 偿锄叠觞甜i i 饨脚拭m # h 群c e 批轻) c 毫如j l 掰曲口刚t 缸t h5m m d p 兔正膏f 缸3 0 m m 撼3 7 渤c 越k 嘲k 鲫瞳e d 旗l h1 0 0 盥m 乙，协哇犍d p a c 、柚缔曲e d 明a 铒畦蜷亭错珏kal o ：2z n 一谚捌也i 髓e 壤吐。喃渤托郾如涮簋d 殪掂c e 沲 碍搿e 砬u b 醐 d 铺出如，晒3 0 叠溆戤3 岔 a 嘲铆! 埘砸t hl o on 蹦1 班n a 托曲槭n i 母盥衄】湘酪l ，e 咖e a b l eh 翰曙- 囊凳锄 c k l a 逝融：1 柚i na t3 7 e 油蝴蹦d 姆o f 如e 脚心镡殛轳c 如蜘i n p a 嫩l 嘞c 盘曲g t 嘁晡a 蜒姆 图9 近红外分子荧光探针d p a c y 在巨噬细胞中的成像 荧光成像生物分析还需要克服诸多技术难点，如细胞背底干扰，标记分子的 光漂白时间，标记物对生物分子行为的影响，细胞内单个分子在z 轴方向运动的 观察等。解决困难需要致力于改进或创造基本技术，需要硬件及信息技术的支撑、 多种技术的联用等。双光子荧光显微技术活体研究神经系统的可塑性是荧光成像 技术进步的重大突破。相对于仅仅能吸收一个特定波长的光子来达到激发状态的 情况，一些荧光团能够同时吸收两倍波长两个光子( 能量减半) 来达到相同的激 发? 状态。不管使用什么样的方式达到激发：状态，基于荧光团弛豫回到基态能够观 察到荧光是相同的。双光子吸收并不是一个线性的光学性质，因为它与入射光的 光强有二次方关联。这种非线性能够给出吸收( 并且还有荧光) 作用的高的空间 山尔师范人学硕士论文 分辨率【8 1 1 。双光子染料吸收的使用尤其是在大约7 0 0n m 范围处的使用有一些实 际的优点：( 1 ) 可以使用商业的近红外飞秒资源：飞秒脉冲也能将检测时光对于 组织的损伤减小到最小。( 2 ) 激发和发射光子有很好的组织穿透能力。( 3 ) 高空间 分辨率，允许1 0 _ 5 升的点体积的激发。( 4 ) 低背景信号，因为有很少的物质能够 在这些波长下能够经受多光子效应。 因此，为了获得像较厚的组织部分中的金属离子分布的高分辨率的图像，设 计合成可透过横截面的双光子吸收的可