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黑曲霉产木聚糖酶及其基因x y n b 克隆、表达的研究 摘要 木聚糖( x y l a l l ) 是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，是自然界中 继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低 聚木糖和木糖的一类酶的总称。目前，它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工 业中均有着广泛的应用。本论文以木聚糖酶为研究对象，主要分为以下几个部分： 1 黑曲霉培养基的优化。通过单因素实验确定了黑曲霉( a s 3 4 3 0 9 ) 液体发酵产 木聚糖酶的最适培养基为：以质量分数为2 麸皮为碳源，以1 酵母膏为氮源， 表面活性剂t w e e n8 0 的添加量为0 5 ，无机盐k h 2 p 0 42 6 ，c a c l 20 5 ， m g s 0 4 7 h 2 01 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 6 ，装液量为5 0 m l 2 5 0 m l ，培养的起始p h 为5 0 ，培养温度为2 8 ，培养时间为7 2h ，摇床的转速为1 5 0 r m i n ，在此条件 下，菌株产木聚糖酶活性较高，能提高至7 6 5 6 u m l ，是原始菌株的1 2 倍。 2 双水相法纯化木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶进行纯化，确定最佳的 纯化条件为：p e g 4 0 0 0 、p e g 4 0 0 0 浓度为1 9 ( w w ) 、k 2 h p 0 4 浓度为1 0 ( w w ) 、 n a c l 浓度为0 ( w w ) 。在此条件下，木聚糖酶的提取效果较好，k 和y t 的值分 别为2 9 3 4 和8 8 6 7 。 3 木聚糖酶酶学性质的研究。本文对黑曲霉木聚糖酶的酶学性质进行研究，结果 表明：该木聚糖酶的最适反应温度为5 0 ，最适p h 为5 o ，在4 0 5 0 间的热 稳定性较好，在p h 3 0 6 0 的条件范围内稳定性较好，是典型的酸性木聚糖酶； 金属离子f e 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + 对木聚糖酶活力有不同程度的促进作用，a 1 3 + 对木聚 糖酶稍有影响，使其活力降低；而其余的大部分金属离子对木聚糖酶的活性的影 响并不大。 4 基因克隆与表达。本文分别以黑曲霉基因组d n a 和e d n a 为模板，通过p c r 扩增出得到一条约为7 5 0 b p ，一条约为6 8 0 b p 的目的片段，经测序结果表明该基 因全长7 4 6 b p ，含有6 8 b p 的内含子，基因编码区长6 7 8 b p ，该基因己提交g e n e b a n k ，登录号为e u 4 2 3 8 8 1 。将测序所得正确的x y n b 基因与酵母分泌型表达载 体p p i c 9 k 进行连接，转化大肠杆菌d h 5 a ，成功构建表达载体p p i c 9 k - - x y n b 。 后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母( p i c h m 胛幻，括g s l l 5 ) ，经m m m d 快慢斑进行筛选，并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培养，4 6 天后，将其点于r b b 木聚糖平板上，可见产生了明显的透明圈，取上清测得的酶活为1 6 0 7 8 u m l ，是 出发菌株的2 1 倍。 关键词：黑曲霉，木聚糖酶，发酵，基因克隆 s t u d yo nt h ex y l a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e ra n d c l o n i n g ，e x p r e s s i o no f x y n bg e n e a b s t r a c t x y l a ni s ap o l y f i v ec a r b o ns u g a ra n di sa ni m p o r t a n tc o m p o n e n to fp l a n t h e m i c e l l u l o s e s ，w h i c ha c c o u n t sf o ro n e - t h i r do ft h et o t a lp l a n tc a r b o h y d r a t e s i n n a t u r e ，x y l a ni st h es e c o n dr i c hr e n e w a b l eb i o l o g i c a lr e s o u r c e sj u s ta f t e rt h e c e l l u l o s e x y l a n a s e i sak i n d o fe n z y m e sc o l l e c t i v e l yw h i c hc a nd e g r a d ex y l a ni n t o x y l o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dx y l o s e x y l a n a s ec a nd e g r a d ex y l a ni n t oo l i g ox y l o s e ， x y l o s ea n das m a l ln u m b e ro fs i n g l e - g l u c o s e x y l a n a s e h a saw i d er a n g eo f a p p l i c a t i o n so nf e e d ，p a p e r , f o o d ，p h a r m a c e u t i c a la n de n e r g yi n d u s t r i e s x y l a n a s ei s s t u d i e di nt h i sp a p e r ，i ti sd i v i d e di n t ot h ef o l l o w i n gp a r t s ： 1 a s p e r g i l l u sn i g e rm e d i u mo p t i m i z a t i o n t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ti d e n t i f i e d a s p e r g i l l u sn i g e r ( a s 3 4 3 0 9 ) l i q u i df e r m e n t a t i o n o fx y l a n a s e o p t i m u m f e r m e n t a t i o nm e d i u mf o r ：u s eq u a l i t ys c o r e so f2 b r a na sac a r b o ns o u r c e ，w i t h l y e a s te x t r a c ta sn i t r o g e ns o u r c e ，s u r f a c t a n tt w e e n8 0i sa d d e d0 5 ，晰t h 2 6 i n o r g a n i cs a l tk h 2 p 0 4 ，0 5 c a c l 2 ，1 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 016 f e s 0 4 7 h 2 0 a tt h es a m et i m e ，c u l t u r ec o n d i t i o n si sa l s oo p t i m i z e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： m e d i u mv o l u m eo f5 0m l 2 5 0m l ，i n i t i a lp ho fc u l t i v a t i o ni s5 0 ，t e m p e r a t u r eo f c u l t i v a t i o ni s2 8 ，t i m eo fc u l t i v a t i o ni s7 2 h ，r o t a t i n gs p e e do fs h a k e ri s15 0r m i n ，u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h es t r a i nx y l a n a s ea c t i v i t yo ft h eh i g h e ri n c r e a s et o 7 6 5 6u m 1 r a i s i n 9 1 2 t i m e s 2 a t p et op u r i f yx y l a n a s e t h i sm e t h o di su s e dt op u r i f yx y l a n a s ea n dd e t e r m i n e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ep u r i f i c a t i o n ：c o n c e n t r a t i o no f p e g4 0 0 0 、p e g 4 0 0 0 i s19 ( w w ) ，c o n c e n t r a t i o no fk h 2 p 0 4i s10 ( w w ) ，c o n c e n t r a t i o no fn a c li s0 ， u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，i th a sab e t t e rx y l a n a s ee x t r a c tr e s u l t s ，ki s2 9 3 4a n dy ti s 8 8 6 7 3 ar e s e a r c ho nt h ee n z y m en a t u r eo fx y l a n a s e i nt h i sp a p e r , i tm a k e sar e s e a r c ho n t h ee n z y m en a t u r eo fx y l a n a s ew h i c hw a sp r o d u c t e db ya s p e r g i l l u sn i g e r , t h e r e s e a r c hr e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo ft h i sx y l a n a s ei s 5 0 ，a n dt h eo p t i m a lp hi s5 0 ，i th a sab e t t e rt h e r m a ls t a b i l i t yu n d e rt e m p e r a t u r e c o n d i t i o n sw i t l l4 0 - 5 0 i ta l s oh a sab e t t e rs t a b i l i t yu n d e ra c i d i cc o n d i t i o n sw i t h p h 3 0 6 0a n di sat y p i c a la c i dx y l a n a s e ；i nt h em e t a li o n f e 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + h a v e v a r y i n gd e g r e e sr o l ei np r o m o t i n gt h ex y l a n a s ea c t i v i t y ；a 1 3 + h a sal i t t l ei n h i b i t e f f e c to nt h ex y l a n a s e ；a n dm o s to ft h er e s to ft h em e t a li o n sh a v el i t t l ei m p a c to n t h ee n z y m ea c t i v i t y 4 t h i sp a p e ru s e das t r a i no fa s p e r g i l l u sn i g e rg e n o m i cd n aa n de d n aa st h e t e m p l a t e ，o b t a i n e dt w os i z e so fa p p r o x i m a t e l y7 5 0b pa n d6 8 0 b pf r a g m e n tb y a m p l i f i e dp c r s e q u e n c i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tt h et o t a ll e n g t ho ft h i sg e n ei s7 4 6 b p ，w h i c hc o n t a i n s6 8b pi n t r o n ，a n dt h ec o d i n gg e n e si s6 7 8b p a tp r e s e n t ，t h e g e n eh a db e e ns u b m i t t e dt og e n eb a n k ，t h el o g i nn u m b e ri se u 4 2 3 8 8 1 c o n n e c t t h ec o r r e c tx y n bg e n ew h i c hw a so b t a i n e df r o ms e q u e n c ea n dy e a s ts e c r e t a r y e x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k ，t r a n s f o r m e di n t oe c o l id h - 5 a ，c o n s t r u c t e de x p r e s s i o n v e c t o rp p i c 9 k - x y n b t h e nu s e i n ge l e c t r o p o r a t i o nm e t h o dr e c o m b i n a n tp l a s m i d i n t op i c h i ap a s t o r i s ( p i c h i ap a s t o r i s g s l l 5 ) s c r e e n i n gb yt h em m m d s p e e d a n ds l o ws p o t ，p i c k i n gaf e ws l o ws p o t sf o rm e t h a n o lc u l t i v a t i o n ，p u ti to n x y l a n a s ep l a t ea f t e r4t o6d a y s ，w ec a ns e et h a tac l e a ra n dt r a n s p a r e n tc i r c l e ， t a k et h es u p e m a t a n tt om e a s u r ex y l a n a s ee n z y m ea c t i v i t y , m e a s u r e dr e s u l t so ft h e a c t i v i t yi s16 0 7 8u m 1 r a i s i n g2 1t i m e s k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r , x y l a n a s e ，f e r m e n t a t i o n ，g e n ec l o n i n g 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 签字日期： 年月日 年月日 吉林农业大学硕 ：学位论文 黑曲霉产木聚糖酶及其基冈x y n b 克隆、表达的研究 第一篇文献综述 木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组成成分，是自然界中继纤维素 之后含量第二丰富的可再生物质资源。木聚糖酶是一类降解木聚糖分子中b 1 ，4 木糖苷键的 酶系，是可将木聚糖水解为木二糖、木寡糖，以及少量阿拉伯糖和木糖的一种复杂的复合 酶系统，广泛存在于自然界的细菌和真菌中，它对自然界中大量存在的半纤维素起着重要 的作用，并广泛的应用于造纸、食品、饲料、制药等各种行业中，已成为国内外众多学者 的研究热点。然而，目前利用生物酶解法降解木聚糖的成本较高，成为限制其生物转化的 关键问题，那么寻找潜在的木聚糖酶高产菌、诱变菌、构建基因工程菌等方法都是目前解 决木聚糖酶生产水平低下的有效途径。 1 木聚糖和木聚糖降解酶类 1 1 木聚糖的结构 植物细胞壁主要是由纤维素，半纤维素和木质素等物质组成。其中半纤维素仅次于纤 维素，约占植物细胞干重的1 5 - - - 3 5 1 | ，它的主要成分就是木聚糖。木聚糖是一种杂合多 聚分子，主链上由多个吡喃木糖基通过b 一1 ，4 一木糖苷键相连而成。根据糖苷键的类型， 木聚糖可分为两种，p 1 ，4 木聚糖和p 1 ，3 木聚糖。前者存在于陆生植物细胞壁中，它的主 链是由p 1 ，4 糖苷键相连的p d 吡喃木糖残基聚合而成；而后者存在于海洋藻类的细胞壁 中，其主链是由p d 吡哺木糖残基通过1 3 - 1 ，3 糖苷键聚合而成【2 】。自然界中的木聚糖多为 异聚多糖，侧链上连着多种不同大小的短取代基，主要有o 一乙酰基、4 一甲基一d 一葡萄 醛酸残基、l 一阿拉伯糖残基等【3 】。这些侧链与植物细胞中的其它几种结构性多糖( 如木 质素、纤维素、果胶、葡聚糖等) 以共价或非共价键连接，组成植物的细胞壁结构【4 】。而 不同型木聚糖分布很少，仅见于茅草，烟草和某些种子的外壳中【5 】。不同植物或同一植物 的不同生长阶段，木聚糖的组成成分及多聚化程度都有所不同：硬木木聚糖由o 一乙酰基 一4 一o 一甲基葡糖醛酰木糖聚合而成，聚合度为1 5 0 2 0 0 ，且具有高度的乙酰化；软木 木聚糖是非乙酰化的，由阿拉伯- - 4 - - 0 - - 甲基葡糖醛酰木糖聚合而成，聚合度为7 0 1 3 0 引 不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，一般硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中的木 聚糖能占到干重的1 5 3 0 ，软材中仅占干重的7 1 0 。在某些一年生植物o n d , 麦、 甘蔗、棉子壳中，木聚糖的含量非常高，一般都能高达3 0 以上。 吉林农业人学硕士学位论文 黑曲霉产木聚糖酶及j e 基因x y n b 克隆、表达的研究 4 一o m e t h y l 一口- d - s l u e u r o n o p y r a n o s y la c i d 图1 木聚糖的结构及酶作用位点 f i g 1s t r u c t u r eo fx y l a na n dt h es i t e so fi t sa t t a c kb yx y l a n o l y t i ce n z y m e s t h eb a c k b o n eo ft h es u b s t r a t ei s c o m p o s e do f1 , 4 - 1 3 - 1 i n k e dx y l o s er e s i d u e s 1 2 木聚糖的降解酶系 1 2 1 木聚糖降解酶类 木聚糖酶属于水解酶类，是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合酶系，由 于不同来源的木聚糖主链的聚合度、支链残基的种类、数量、长度及其在主链上结合位点 的不同，要彻底将木聚糖降解需要多种酶的共同参与和协同，其中主要包括以下几种类型： ( 1 ) 内切1 3 - 1 ，4 - d 一木聚糖酶( e n d o - p - 1 ，4 一d - x y l a n a s e ) e c3 2 1 8 】 简称木聚糖酶，作用于木聚糖主链的糖苷键，主要生成木二糖和木三糖等寡糖，很少 生成木糖。大多数真菌和细菌的1 3 1 ，4 d 木聚糖酶是单亚基蛋白，分子量为8 5 0 0 - - 8 5 0 0 0 ， p i 值为3 6 - - 1 0 3 。根据对几十种1 3 1 ，4 d 木聚糖酶的分子量和等电点进行统计后发现：7 0 的酸性b 1 ，4 d 木聚糖酶分子量在3 0 0 0 0 以上，而碱性b 1 ，4 d 木聚糖酶为则多在3 0 0 0 0 以下【_ 7 1 。绝大多数p 1 ，4 d 内切木聚糖酶的最适p h 值小于7 0 ，最适反应温度在4 5 , - - 7 5 。c 之 间。多数内切木聚糖酶能够水解d p 值大于2 的寡聚木聚糖，其亲和力随着d p 值的降低而降 低【引。 ( 2 ) d d 一木糖苷酶( 1 3 - - d - - x y l o s i d a s e ) e c3 2 1 3 7 】 该酶有单体、二聚体或四聚体等组成形式，分子量为2 6 0 0 0 - 3 6 0 0 0 。p i 值为3 3 - - - , 7 3 。 在细菌和酵母中，p 木糖苷酶主要存在于细胞内。d 木糖苷酶主要作用于寡聚木糖，属于 外切酶的一类。它对底物的亲和力随着底物的d p 值降低而增加，因此对寡聚木糖中，二 聚木糖是木糖苷酶的最佳底物。 p 一木糖苷酶是一个多功能酶。来源于木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i 和t r 缸h o d e r m a 2 吉林农业人学硕上学位论文黑曲霉产木聚糖酶及j 基因x y n b 克隆、表达的研究 e t h a n o l i c u s ) 的木糖苷酶具有阿拉伯糖苷酶的活性。黑曲霉的b 一木糖苷酶既能酶切木糖苷 键，又能酶切0 【一阿拉伯糖苷键、p 一葡萄糖苷键和p 一半乳糖苷键。许多p 一木糖苷酶具有 l ，4 一和1 ，3 一木糖苷转移酶的活性，在底物浓度很高的情况下更是如此，从而使低聚木糖 转变为木聚多糖一j 。 ( 3 ) a l 一呋喃型阿拉伯糖苷酶( a - - l - - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ) 它分为两种类型，一种是占多数的外切型0 【l 呋喃阿拉伯糖苷酶【e c 3 2 1 5 5 】，作 用于d 一硝基酚一呋喃型阿拉伯糖苷或者分支阿拉伯聚糖；另一种是内切1 ，5 a l 阿拉伯 聚糖酶 e c3 2 1 9 9 】，只对阿拉伯聚糖侧链起作用。由于缺少合适的天然底物等诸多原 因，使得该酶的研究遇到了很多困难，因而在过去的2 0 多年里，有关该酶的报道很少。目 前研究较多的是0 【l 阿拉伯呋哺糖苷酶，它多以单体形式存在，也有二聚体、四聚体、六 聚体、八聚体等形式，分子量为5 3 4 9 5 k d a ，p i 值为2 5 9 3 之间，最适p h 值在2 5 6 9 之间。 ( 4 ) a d 葡萄糖醛酸苷酶( 0 【d g l u c u r o n i d a s e s ) 【e c3 2 2 3 9 】 0 【葡萄糖醛酸苷酶主要水解葡萄糖醛酸木聚糖中的木糖和d 葡萄糖醛酸及其4 甲基 化酯之间的0 【1 ，2 糖苷键，释放出4 o 甲基葡萄糖醛酸。尽管该酶在木聚糖的生物降解中 同样发挥作用，但由于许多真菌的半纤维素酶制剂中缺乏此酶活性，所以，直至u 1 9 8 6 年才 有相关的描述，迄今报道的也只有少数几种【l o 】。现在已知的0 【葡萄糖醛酸苷酶，分子量一 般在l o o k d a 以上。 ( 5 ) 乙酰木聚糖酶( a c e t y l x y l a ne s t e r a s e s ) 【e c3 2 7 2 】 由于木聚糖酶难以接近高度乙酰化的木聚糖的主链骨架，因此，酰基化的木聚糖及其 寡糖的完全降解还需要相应的酯酶参与。乙酰木聚糖酶可以从乙酰木聚糖的c 2 与c 3 位置 上除去氧乙酰基，释放出醋酸。因此消除了乙酰基团对木聚糖酶作用的空间阻碍作用，增 强木聚糖酶对木聚糖的亲和力及降解速度【i 。 ( 6 ) 酚酸酯酶( p h e n o la c i de s t e r a s e s ) 酚酸酯酶主要包括主要包括阿魏酸酯酶( f a e ) 和香豆酸酯酶( c a e ) 。阿魏酸酯酶 切开木聚糖上阿拉伯糖侧链与阿魏酸之间的酯键，香豆酸酯酶则切开阿拉伯糖与香豆酸之 间的酯键。如新美丽丝菌( n e o c a l l i m a s t i x 朋d 2 ) 产生两种阿魏酸酯酶( f a b ，尉b 口) ， 均为单亚基蛋白，分子量分别为6 8 k d a ，2 4 k d a ，p i 为4 2 ，5 7 ，最适作用p h 为6 2 ，7 0 。 该真菌还产生一种香豆酸酯酶，是二聚体，分子量为1l k d a ，p i 为4 7 ，最适作用p h 为7 2 ， 酶活受h 孑+ 乘 f e 2 + 离子的抑制【1 2 】。 1 2 2 木聚糖降解酶系的多样性及协同作用 由于木聚糖结构的不均一性，使不同来源的木聚糖主链的聚合度不同，支链残基的种 类、数量、长度以及在主链上的结合位点也不同，想将其彻底降解就需要很多种酶的共同 参与和协同作用，因此，木聚糖的降解系统是很复杂的。微生物所产的木聚糖酶通常不止 吉林农业大学硕t 学位论文黑曲霉产木聚糖酶及其基冈x y n b 克隆、表达的研究 一种，而是多酶的复合物。如p e t e rb 从绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 的培养基中分离到了 1 3 种木聚糖酶【l3 1 ，另外在粪堆梭菌( c l o s t r - i d i u ms t e r c o r a r i u m ) ，脱叶链霉菌( s t r e - p t o m y c e s e x f o l i a t u m ) m cl ，里氏木霉( t r i c h o d e r ma r e e s e i ) q m 9 4 1 ，气单胞菌( a e r o m o n a ss p ) 2 1 2 i i 引， 微紫青霉( p e n i c i l l i u m ja n t h i n e l l u m ) ”】等微生物中发现都至少有3 种以上的木聚糖酶存在。 除了木聚糖酶以外，d 一木糖苷酶，0 【一l 一阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶等也具多 样性现象。如瓦曼纳氏青霉( p e n i c i l 1 i u mw o r t h m a n n i ) 产生4 种木糖苷酶；生长在麦杆上的 淀粉酶链霉菌( s t r e p t o m y c e sd e a s t a t i c u s ) 分泌2 种不同的s - - l - - 呋喃型阿拉伯糖苷酶；里氏 木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 产生2 种均为单体糖蛋白的乙酰木聚糖酯酶；生长在纤维素上的新 美丽丝菌( n e o c a l l i m a s t i x ) m c 2 产生一个高分子量和一个低分子量的阿魏酸酯酶等【l 酬。 这些木聚糖酶系中的每种木聚糖酶除了各自发挥特异性作用外，同时，它们之间又存 在协同增效作用【j 7 1 。t a k e n i s h i 和t s u j s a k a 最先在研究中发现了两种木聚糖酶之间的协同作 用，其中一种木聚糖酶负责水解木三糖，而另一种木聚糖酶负责水解阿拉伯糖残基的底物 【15 1 。有报道显示在a n i g e r 1 7 】和c e r a t o c y s t i s p a r a d o x ac p z 1 8 】中也发现了具有协同作用的木 聚糖酶。1 9 8 6 年，b i e l y 等人发现了乙酰木聚糖需要在乙酰木聚糖酶和内切木聚糖酶的共 同作用下才能彻底降解，且由乙酰木聚糖酶降解而来的乙酸能增强内切木聚糖酶对木聚糖 主链的进攻，而内切木聚糖酶产生短链乙酰木聚糖又是乙酰木聚糖酶的良好底物。 这些都充分说明每一种类型的木聚糖酶在木聚糖的水解过程中都不是多余的。要将木 聚糖彻底分解，需要不同的木聚糖酶之间和木聚糖酶与木糖苷酶、葡萄糖醛酸糖苷酶、乙 酰酯酶等其它类型的酶的协同作用。但应当注意的是，几种酶在一起时，有时起协同作用， 但有时也无协同作用甚至起相互抑制的作用，其抑制作用的机制有两种：一是一种酶与木 聚糖结合太紧挡住了第二种酶与之结合的位点；二是一种酶作用于底物改变了底物原有的 分子构型1 19 1 。 2 木聚糖酶的分子生物学 2 1 木聚糖酶的分类 广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一类酶的总称，主要包括三种：一 是内切b 1 ，4 d 木聚糖酶 e c 3 2 1 8 】，其作用方式是在不同位点上作用于木聚糖和长链木 寡糖，从b 1 ，4 d 木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖。其水解 产物主要为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，也有少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖；二是 外切b 1 ，4 d 木聚糖酶 e c 3 2 1 9 2 1 ，主要作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产物为木糖； 三是d 1 木糖苷酶 e c 3 2 1 3 7 ，该酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基。而狭义上讲， 我们常说的木聚糖酶仅限于内切b 1 ，4 d 木聚糖酶，它负责木聚糖主链骨架的降解，是木 聚糖降解酶系中最关键的酶【2 们。木聚糖酶( p 1 ，4 d 木聚糖酶) 来源广泛、结构复杂，可 从不同方面进行分类： 4 吉林农业大学硕上学位论文 黑曲霉产木聚糖酶及其基因x y n b 克隆、表达的研究 ( 1 ) 依据木聚糖酶对底物的特异性不同，可将其分为特异性木聚糖酶和非特异性木聚糖 酶，其中，特异性酶只作用于木聚糖底物，非特异性木聚糖酶除作用于木聚糖外，还能作 用于纤维素及人工底物，故称之为双功能酶。 ( 2 ) 从酶的分子量上划分，可将木聚糖酶分为低分子量木聚糖酶和高分子量木聚糖酶， 通常低分子量木聚糖酶含有18 2 - - 一2 3 4 个氨基酸残基；高分子量木聚糖酶含2 6 9 - - 8 0 9 个氨基 酸残基1 2 1j 。 ( 3 ) 根据糖苷键水解酶催化区域的氨基酸序列组成和疏水性分析，可将糖苷水解酶类分 成不同的家族，目前发现的木聚糖酶主要属于f i o 和g 1 1 族。一般而言，f 1 0 家族的木聚 糖酶分子量高，结构较复杂，可以作用于对硝基苯和对硝基苯纤维二糖，需较少数量底物 结合位点，底物降解后的主要产物为低聚木糖；而g 11 家族的木聚糖酶则对木聚糖有很高 的特异性，酶解后的主要产物为木糖【2 2 】，【2 3 1 。 2 2 木聚糖酶的理化性质 2 2 1 木聚糖酶的热稳定性 目前对木聚糖酶性质的研究主要集中在细菌和真菌上。细菌木聚糖酶蛋白质亚基比较 单一，可大体分为两类：高分子量的耐酸木聚糖酶和低分子量的耐碱木聚糖酶。而真菌产 生的木聚糖酶蛋白质亚基较复杂，分子量大小差异也较大。不同微生物来源的木聚糖酶的 酶学性质也有所不同。 每种木聚糖酶都有其各自的最适作用温度和热稳定性，不同菌株的木聚糖酶耐热性差 别很大。一般情况下，多数细菌和放线菌所产木聚糖酶的最适作用温度在5 0 。c - - - 6 5 。c 之间， 如b a c i l l u ss p w - 1 的最适p h 为6 ，最适温度6 5o c 2 4 1 。而真菌木聚糖的热稳定性较细菌木 聚糖酶差些，最适温度在5 0 。c 左右，如a s p e r g i l l u sn i g e r 2 5 1 和t r i c h o d e r m ar e e s e i 2 6 】的木聚 糖酶的最适温度为4 5 ，最适p h 在5 0 左右；李用芳等人分离到一株黑曲霉c 2 5 6 ，它 的最适温度为5 0 c ，4 0 。c 下处理1 h 酶活可保持在9 3 以上【2 7 j 。 2 2 2 木聚糖酶的酸碱稳定性 不同来源的木聚糖酶的组成和性质都不相同，p h 值稳定性和最适p h 值的范围也各有差 异。一般而言，真菌来源的木聚糖酶的最适p h 在4 0 - 6 0 之间，多在酸性条件下具有最大 活力，属于酸性木聚糖酶；而细菌和放线菌木聚糖酶则适合在中性或碱性条件下发挥作用， p h 值稳定性也比真菌高，多在6 0 - - 8 0 之间，属于中性或碱性木聚糖酶。各种极端微生物 则能产生与其生长环境相近特性的木聚糖酶。 近年来，对各种木聚糖酶在耐酸碱特异性方面的报道很多，如黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r j 5 0 6 ) 木聚糖酶的最适p h 值为5 4 f 2 引，耐热子囊菌( t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s ) 木聚糖酶活最适 p h 为4 8 ，在p h 3 0 7 o 时稳定性较好【2 9 】。h o r i k o s h i 从碱性细菌( b a c i l l u s s p n o c 5 9 2 ) e e 纯 吉林农业人学硕上学位论文 黑曲霉产术聚糖酶及j 基冈x y n b 克隆、表达的研究 化的木聚糖酶最适p h 为6 o 8 0 t 3 0 】。t a i l e j a 等筛选到一株嗜碱真菌( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s k k 9 9 ) ，该菌产的木聚糖酶的最适p h 为8 0 1 3 1 1 。曲音波等从碱性土样中分离到一株短小芽 孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) ，其木聚糖酶的最适作用p h 值为9 0 【3 2 1 。 2 3 木聚糖酶的分子结构 了解酶的基本结构及其功能关系是研究酶分子生物学的关键所在。近年来，国内外对 木聚糖酶结构方面的研究很多。结果表明，不同微生物产生的木聚糖酶在结构和性质上差 别较大，有的木聚糖酶只含有单一的催化区，而另一些木聚糖酶则同时具备催化区和多种 非催化区。多区域的木聚糖酶分子结构中一般含有催化区( c a t a l y t i cd o m a i n , c d ) 、纤维 素结合区( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 、木聚糖结合区( x y l a n b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 、 连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 、重复序列( r e p e a t e ds e q u e n c e ) 、热稳定区( t h e r m o s t a b i l i s i n g d o m a i n ) 及其它未知功能的非催化区等。这些区域都负担着不同的生理功能【3 3 】。 2 3 1 催化区结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 木聚糖酶的催化结构域( c d ) 决定着酶的水解特性，也是该酶分类的依据之一。木 聚糖酶的氨基酸数量变化很大，但其催化区域在大小上都趋向一致。1 9 9 1 年，g i l k e s 等人 【3 4 1 就是根据木聚糖酶的催化结构域、氨基酸的同源性和疏水性的分析，将木聚糖酶分成f 族和g 族。研究表明，f 、g 族木聚糖酶在分子量、净电荷、不带电荷的碱性和酸性氨基 酸的比例等方面都不同。这两个家族木聚糖酶的催化区的氨基酸序列及催化基团周围序列 均没有有意义的同源序列，并且有不同的折叠方式，因此可以判断它们是由不同的祖先进 化而来的。木聚糖酶一般是由单一的催化域组成的，但也例外，如n e o c a l l i m a s t i x f r o n t a l i s 的木聚糖酶i i i 和r u m i n o l o c c u s f a v e f a c i e u s 的x y l an 等 3 5 1 都含有两个催化域。 2 3 2 纤维素结合区( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 在木聚糖酶分子中常含有一种独立的无催化功能的区域，即纤维素结合结构域( c b d ) ， 该区域可以和结晶纤维素结合。c b d 在纤维素酶分子中广泛存在，但由于自然界中纤维 素通常是与木聚糖等半纤维素共存于植物多糖结构中，且多以纤维素为骨架，因此许多木 聚糖酶也含有c b d ，使之既能水解纤维素，也能水解木聚糖，成为双功能酶。c b d 对木 聚糖酶的催化功能不是必需的，但它可以使木聚糖酶结合在纤维素上，更加靠近底物，调 节酶对可溶性和不溶性纤维素底物的特殊活力。 2 3 3 木聚糖结合区( x y l a n b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 一些木聚糖酶的的底物结合区对木聚糖有特异性，所以称之为木聚糖结合区( x b d ) 【3 6 】。木聚糖结合结构域( x b d ) 和纤维素结合区域一样也是酶分子中独立的无催化功能区 域，能和木聚糖结合。与c b d 相比，木聚糖结合区( x b d ) 在木聚糖酶分子中较少存在， 6 吉林农业大学硕士学位论文黑曲霉产木聚糖酶及其基冈x y n b 克隆、表达的研究 可能是木聚糖中带有太多类型的取代基缘故。一般这些底物结合区不影响酶的催化活性， 但对不溶性底物有着特殊的作用。如s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i v i d i se 8 6 中的f x y n 酶，含 有催化区及x b d ，在天然状态下，它既能分解可溶性木聚糖，也可分解不溶性木聚糖， 而如果人工撤去x b d ，它就不能降解不溶性木聚糖了，但不影响对可溶性木聚糖的降解 效率。因此x b d 对降解不溶性底物是必不可少的【3 7 】。 2 3 4 连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 木聚糖酶分子中的各个功能区域都是由连接序列相连而成的。此序列的长度变化很 大，一般为6 - - - , 5 9 个氨基酸。这些蛋白质中的连接序列将不同的功能区域连接起来，形成 柔韧可伸展的绞链区。该序列中或含有较多的丝氨酸残基【3 引，或含有较多的脯氨酸和苏氨 酸残基，通常都被高度的糖基化 3 9 j 。 2 3 5 重复序列( r e p e a t e ds e q u e n c e ) 在许多纤维素酶和木聚糖酶分子中都含有重复序列，其长度为2 0 - - - 1 5 0 个氨基酸残 基。它也不是酶发挥活性所必需的结构，但往往与酶的某些特性紧密相关。也有些人认为 它是连接序列的一部分或担负着其它的重要功能。 2 3 5 热稳定区( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n ) 木聚搪酶的热稳定区中含有大量的甘氨酸残基，它们可能位于热稳定蛋白的环状域 中，易引起酶失活的天门冬氨酸和谷氨酸残基的含量则非常有限，这就避免了在温度上升 过程中可能由这两种氨基酸导致的酶变性。热稳定结构域的显著特点是其含有大量的脂肪 族氨基酸，它们很有可能是通过增加蛋白质分子的折叠紧密度来提高酶的耐热性能。 2 3 6 基因簇( g e n ec l u s t e r ) m o r i y m a a h 等研究表明，b a c i l l u s 尸“优玎淞中木聚糖酶与p 木糖苷酶基因之间仅相隔 1 4 4 k b ，但被不同的操纵子控制，有各自的启动子序列，转录也是分别进行的【4 0 1 。c a l d i c e l l u l o s i r u p t o rs a c c h r o l y t f c 淞中一段6 k b 的d n a 片段上有5 个开放阅读框，分析证明其中的3 个基因分别编码木聚糖酶，b 木糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶【4 1 1 。基因簇的存在可能是便于微 生物更有效的分解不同结构的木聚糖。 2 3 7 其它未知功能的非催化区 木聚糖酶分子中还存在很多未知功能的其它非催化区域。这些未知功能的非催化区域 的序列的出现高度变化。多聚糖酶类的非催化区要比催化区的进化自由度大得多。测定四 级结构相似性的更为敏感的序列比较技术，似乎可以缩小非催化区之间的差距。 7 吉林农业人学硕上学位论文 黑f f f f 霉产木聚糖酶及其基冈x y n b 克降、表达的研究 掣牟悔 + r 0 。| 串，l & p o i ) 一k t “l i f 1 忧川= 代冬! ；l t r l _ t 争，_ j 徊 。 ， l 。i ， i 。 一 ， 守叫中愕嘶 8 吉林农业大学硕十学位论文黑曲霉产木聚糖酶及其基冈x y n b 克隆、表达的研究 2 5 木聚糖酶基因的克隆和表达 从极端环境中筛选高表达的木聚糖酶是一种来源方便，并且是一旦筛选到就可以直接 应用的好方法，但这种方法毕竟受到地域环境和经济条件的限制