（食品科学专业论文）鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制备研究.pdf

鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制各研究 摘要 我国淡水鱼资源丰富，每年大约可产生6 5 万吨的鱼鳞，除部分出口外，绝大多 数未能很好的开发利用。鱼鳞含有大量的胶原蛋白，可用来提取天然胶原蛋白并制 备胶原海绵，但目前尚未对以鱼鳞胶原蛋白为原料制备胶原海绵的工艺进行研究。 本课题研究淡水鱼主要成分随时间的变化、鱼鳞脱钙工艺、鱼鳞胶原蛋白的提取技 术以及鱼鳞胶原海绵制备工艺，为开发高价值的胶原海绵等产品奠定基础。 1 测定了4 个品种、不同生长时期的淡水鱼鱼鳞基本组成的含量。鱼鳞的基本 组成因品种不同而异，鱼鳞中蛋白质含量约占5 2 , - 0 7 8 、灰分含量1 0 - 2 9 、水 分含量为1 3 之0 、脂肪含量为1 0 o , - - 6 。在草鱼、鲢鱼、鲫鱼、鳊鱼4 种鱼鳞中， 鲢鱼鳞蛋白质含量最高，鲫鱼与鳊鱼鱼鳞中蛋白质含量次之，草鱼鳞蛋白质含量最 低。鱼鳞中基本成分随季节变化无明显规律。 2 研究并优化了鱼鳞脱钙工艺。酸种类、浓度、处理温度、时间和料液比对草 鱼鱼鳞脱钙效果有显著影响。采用3 盐酸溶液、料液比为1 ：2 0 、温度1 5 下处理 3 h ，或采用6 的柠檬酸溶液、料液比为1 ：1 5 、温度1 5 下处理4 h ，两者的脱钙率 分别达到9 9 8 5 和9 9 7 2 。 3 研究了鱼鳞胶原蛋白的提取工艺。提取温度、提取时间、胃蛋白酶用量、料 液比对鱼鳞中胶原蛋白的提取率有显著影响。采用o 5 m o l l 醋酸溶液提取鱼鳞胶原 蛋的最佳工艺条件为：料液比1 ：1 5 、提取温度1 5 c 、蛋白酶用量2 0 0 0 t 3 g p 眦i n 、提 取时间4 8 h ，在该条件下，鱼鳞胶原蛋白的提取率可达6 3 5 6 ，明显高于未添加胃 蛋白酶的。经紫外光谱、红外光谱、s d s p a g e 电泳分析，并与小牛腱i 型胶原蛋 白的比较，所提取的胶原蛋白为i 型胶原蛋白。 4 研究了胶原海绵的制备工艺。胶原蛋白浓度、p h 对鱼鳞胶原海绵的吸水性、 抗张强度有显著影响，采用o 5 的鱼鳞胶原蛋白、于p h 6 0 条件下，制备的胶原海 绵的吸水倍数高、抗张强度大，且显著高于同浓度的明胶海绵的。胶原蛋白与壳聚 糖的复配可提高胶原蛋白海绵的吸水性和抗张强度。胶原蛋白与壳聚糖比例、p h 、 总浓度对胶原海绵的吸水性、抗张强度有显著影响。当胶原蛋白与壳聚糖比为2 ：8 、 总浓度为0 6 、p h 6 0 时，胶原海绵的吸水倍数、抗张强度等特性最好，分别为9 2 和4 0 k p a 。 关键词：鱼鳞；胶原蛋白；提取工艺；胶原海绵 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a b s t r a c t i no u rc o u n t r y ，t h er e s o u r c e so ff r e s hw a t e rf i s ha r ea b u n d a n t t h e r ea r e a p p r o x i m a t e l y6 5 0 ，0 0 0t o n sf i s hs c a l e se v e r yy e a r m o s tf i s hs c a l e sa r ew a s t e de x c e p tt h a t af e wa r ee x p o r t e d t h ef i s hs c a l ec o n t a i n sa b u n d a n tc o l l a g e nw h i c hm a yb eu s e dt o p r e p a r ec o l l a g e ns p o n g e h o w e v e r , l i n l ek n o w l e d g eh a sb e e na c c u m u l a t e dr e g a r d i n g p r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo fs p o n g ef r o mf i s hs c a l ec o l l a g e n i nt h i sw o r k , b a s i cc o m p o n e n t s o ff l e s hw a t e rf i s hs c a l ea td i f f e r e n tt i m e ，d e c a l c i f y i n gp r o c e s so ff i s hs c a l e ，e x t r a c t i o no f f i s hs c a l ec o l l a g e na n dp r e p a r a t i o no fc o l l a g e ns p o n g ew e r ei n v e s t i g a t e d i tw a s a n t i c i p a t e dt oo f f e rt h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o ri m p r o v i n gp r o d u c t sw i t hh i 曲a d d i t i o n a l v a l u e ，s u c ha sc o l l a g e ns p o n g e 1 b a s i cc o m p o n e n t so ff r e s hw a t e rf i s hs c a l e ( g r a s sc a r p ，s i l v e rc a r p ，c r u c i a nc a r pa n d b r e a m ) w e r ed e t e r m i n e di nt h ed i f f e r e n tt i m e t h eb a s i cc o m p o n e n t sd e p e n d e do nf i s h s p e c i e s t h ep r o t e i nc o n t e n ti sa p p r o x i m a t e l y5 2 - 7 8 ，t h ea s hc o n t e n ti s 10 2 9 ， t h em o i s t u r ec o n t e n ti s13 - 2 0 ，a n dt h ef a tc o n t e n ti s1 - - 6 a m o n gt h ef o u rk i n d s o ff i s hs c a l e s ，t h ep r o t e i nc o n t e n to fs i l v e rc a r ps c a l ei st h eh i 曲e s tf o l l o w e db yc r u c i a n c a r pa n db r e a ms c a l e ，w h e r e a s ，p r o t e i nc o n t e n to fg r a s ss c a l ei st h el o w e s t t h eb a s i c c o m p o n e n t so fs c a l ew e r en o to b v i o u s l yc o r r e l a t e dw i t l lt i m e 2 t h ed e c a l c i f y i n gp r o c e s so ff i s hs c a l ew a so p t i m i z e d t h et y p ea n dc o n c e n t r a t i o no f a c i d ，t h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo fp r o c e s s i n g ，a n dt h es o l i d - l i q u i dr a t i os i g n i f i c a n t l y i n f l u e n c e dd e c a l c i f y i n gr a t eo ff i s hs c a l e d e c a l c i f i c a t i o nr a t er e a c h e d9 9 8 5 w h e n3 h y d r o c h l o r i ca c i dw a su s e dw i t h 1 ：2 0s o l i d - l i q u i dr a t i oa t 15 cf o r3 h s i m i l a r d e c a l c i f i c a t i o nr a t e ( 9 9 7 2 ) w a so b t a i n e dw h e n6 c i t r i ca c i dw a su s e d 诵t l l1 ：15 s o l i d - l i q u i dr a t i oa t15 cf o r4h 3 t h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fs c a l ec o l l a g e nw a ss t u d i e d t h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo f e x t r a c t i o n , p e p s i nd o s a g e ，a n dt h es o l i d l i q u i dr a t i os i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e de x t r a c t i o n r a t eo ff i s hs c a l ec o l l a g e n t h eo p t i m a le x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fs c a l ew a st h a t0 5m o l l a c e t i ca c i dw a su s e dw i t h2 0 0 0 u gp 眦i i ip e p s i na n d1 ：15s o l i d - l i q u i dr a t i oa t15 cf o r4 8 h t h ec o l l a g e ne x t r a c t i o nr a t er e a c h e d6 3 5 6 u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n , a n dw a s o b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a tw i t h o u tp e p s i n t h es c a l ec o l l a g e nw a si d e n t i f i e d 勰t y p e i c o l l a g e nb yu l t r a v i o l e ts p e c t r u m ，i n f r a r e ds p e c t r u m ，s d s p a g e ，a n d 埘t l lc o m p a r i s o nt o s m a l lb e e ft e n d o nt y p eic o l l a g e n 4 p r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fc o l l a g e ns p o n g ew a ss t u d i e d t h ec o l l a g e nc o n c e n t r a t i o n a n dp hv a l u es i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e dw a t e ra b s o r p t i o na n dt e n s i o ns t r e n g t ho fs c a l e c o l l a g e ns p o n g e w h e nc o l l a g e ns p o n g ew a sp r e p a r e df r o m0 5 s c a l ec o l l a g e na tp h 6 0 ， 2 鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制备研究 i tc o u l do b t a i nh i g hw a t e ra b s o r p t i o nc a p a c i t ya n dt e n s i o ns t r e n g t h u n d e rt h e p r o c e s s i n g c o n d i t i o n ，c o l l a g e ns p o n g eo w n e ds i g n i f i c a n t l yh i g h e rw a t e ra b s o r p t i o nc a p a c i t ya n d t e n s i o ns t r e n g t ht h a ng e l a t i ns p o n g e a d d i t i o no fc h i t o s a ns i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dw a t e r a b s o r p t i o nc a p a c i t ya n dt h et e n s i o ns t r e n g t ho fc o l l a g e ns p o n g e t h er a t i oo fc o l l a g e nt o c h i t o s a n ，p hv a l u ea n dt o t a lc o n c e n t r a t i o nh a v er e m a r k a b l ei n f l u e n c eo nw a t e ra b s o r p t i o n c a p a c i t ya n dt e n s i o ns t r e n g t ho fs p o n g e t h ec o l l a g e n c h i t o s a nm i x e ds p o n g eo b t a i n e dt h e h i g h e s tw a t e ra b s o r p t i o nc a p a c i t y ( 9 2 ) a n dt e n s i o ns t r e n g t h ( 4 0k p a ) w h e nt h er a t i oo f c o l l a g e nt oc h i t o s a ni s2 ：8a tp h 6 0w i t hat o t a lc o n c e n t r a t i o no f0 6 k e yw o r d s ：f i s hs c a l e ；c o l l a g e n ；e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ；c o l l a g e ns p o n g e 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间 年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：钱曼 时问：2 8 年6 月午日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 f 学位论文作者鲐钱曼 导师橼奠舌够 签名日期：加0 3 年月睁日签名日期 白即多年多月乒日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 前言 1 1 我国淡水产品加工与综合利用 1 1 1 我国水产品加工现状 改革开放2 0 多年来，我国渔业发展取得了举世瞩目的成就。2 0 0 6 年，我国水 产品总量约5 2 9 0 万吨，连续1 6 年居世界第一，占世界1 3 亿万吨产量的4 0 。水 产品进出口总额达到1 3 6 6 亿美元，其中水产品出口量为3 0 1 5 万吨，出口额为9 3 6 亿美元，占世界水产品出口的1 0 ，占我国农产品出口总额的3 0 ，继续居我国大 宗农产品出口首位。2 0 0 6 年我国水产养殖产量达到了3 5 9 7 万吨，占我国渔业总产 量的6 8 ，占世界水产品养殖总产量的7 0 ，是目前唯一养殖产量超过捕捞产量的 国家( 江兴龙等，2 0 0 8 ) 。 随着我国渔业的快速发展，水产加工业也发展迅猛。2 0 0 4 年我国水产加工企业 达到8 7 4 5 家，年水产加工能力1 4 2 7 万吨，水产加工品总量1 0 3 2 万吨，比1 9 9 9 年 增长6 5 4 。开发生产了冷冻制品、干熏制品、鱼糜及其制品、罐藏制品、饲料蛋 白等类型产品，但我国水产加工业的总体水平较低，水产品加工比例低( 平均3 5 ， 而淡水鱼加工比例不足5 ) 、水产品贸易的国际化程度较低、加工出口率低、产品 技术含量低、附加值低、加工废弃物的综合利用低。一些水产品深加工技术尚未取 得重大突破，如除腥技术、淡水鱼类加工技术等( 励建荣和马永钧，2 0 0 8 ) 。因此， 十一五期间，我国水产品加工业重点是淡水鱼类加工，研究烤鳗、鱼糜制品、鲟鱼 子、水产模拟食品等精深加工技术，开发冷冻调理食品、冷藏保鲜鱼制品、即食食 品和休闲食品；利用加工废弃物，研究开发氨基酸、调味品、营养品、健康饮料、 功能食品等；开发淡水鱼a n - v _ 专用成套设备；建立淡水鱼加工的全程质量控制体系 ( 云龙，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 淡水产品废弃物综合利用 鱼品在加工的过程中，会产生大量的下脚料( 包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、 鱼骨及其残留鱼肉) 。2 0 0 5 年全国水产品总产量5 1 0 1 6 5 万吨，其下脚料占2 0 4 0 6 6 - 2 8 0 5 9 1 万吨，如果不进行有效处理，不仅会污染环境，而且浪费大量的营养物质。 下脚料中蕴含丰富的蛋白质、油脂资源，如鲢鱼鱼头、鱼皮、鱼骨刺混合物中蛋白 质含量达1 4 ，油脂为9 2 2 ；鳗骨、鳗头等废弃物中含有丰富的蛋白质、磷脂质、 软骨素、维生素等( 龚钢明等，2 0 0 3 ) 。目前发达国家的水产品加工率在7 0 以上， 而我国的水产品加工率仅3 5 ，其中淡水鱼加工率不到1 0 ，下脚料的加工更是少 之又少( 江新业和宋钢，2 0 0 7 ) 。 目前在我国，鱼下脚料的利用途径主要包括：( 1 ) 加工成饲料鱼粉；( 2 ) 鱼 4 鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制备研究 头、鱼骨加工成鱼骨糊、鱼骨粉；( 3 ) 从鱼内脏中提取鱼油，提炼e p a 、d h a 制 品：( 4 ) 从鱼鳞中提取鱼鳞胶；( 5 ) 鱼皮制革；( 6 ) 鱼肚( 鱼鳔经清洗浸洗干燥 而成) 的加工( 苑艳辉，1 9 9 9 ) 。淡水鱼采肉率较低，鱼糜加工中约有7 0 的副产 物产生，因此淡水鱼下脚料的综合利用已引起众多部门及企业的重视，如湖北省有 关院所与企业已对下脚料进行过比较深入的研究，鄂州武昌鱼股份公司利用下脚料 加工成下脚料粉，用于饲料；鄂州振源科技发展有限公司利用与体内源酶水解鱼体， 开发生产出鱼蛋白酶解产物( 复合氨基酸) 并出口到俄罗斯。 1 2 鱼鳞资源加工利用现状 鱼鳞是有鳞鱼加工的主要副产品之一，鱼鳞大约占鱼体总质量的5 。2 0 0 5 年淡 水鱼总产量2 1 8 4 万吨，其中有鳞鱼1 3 l o 万吨以上，每年大约可产生6 5 万吨的鱼鳞， 这些鱼鳞除部分出口外，绝大多数未能很好的开发利用。而根据已有的研究情况来 看，鱼鳞可以加工成胶原蛋白、明胶等应用于食品以及化妆品工业：从鱼鳞中提取 鱼银，用于珍珠装饰业和油漆制造业( n a g a ie ta 1 ，2 0 0 2 a ；m o r i m u r ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ； 制备鱼鳞水解液，用于食品工业和保健品行业；制备羟基磷灰石，用于医药、化工 行业( h i r o y u k ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 1 鱼鳞的组织结构特点 鱼鳞是鱼真皮层的变形物，占鱼体重量的1 5 ，主要由结缔组织构成，起 到保护鱼体免遭损害的作用。鱼鳞大致可分为3 种：_ 种是板鳃鱼所特有的木盾鳞， 另一种是斜方型、边缘相联的硬鳞，第三种是最常见的骨鳞，在硬骨鱼中最多( 王 南平和郭鹏达，2 0 0 1 ) 。目前国内外关于鱼鳞的研究大多以硬骨鱼的骨鳞为主。 不同种的鱼鳞形状、结构有所不同。n a g a i 等( 2 0 0 1 ) 研究了赤立鱼( p a g r u sm a j o r ) 鳞的组织结构发现，赤立鱼鳞分为上下两层，其中上层为骨质层，主要成分是羟基 磷灰石，并零散地分布着一些胶原纤维；下层为纤维质层，直径7 0 - - - 8 0n m 的胶原纤 维在同一薄层中紧密地平行排列，且与相邻薄层中的胶原纤维成9 0 0 夹角，形成由多 层薄片构成的正交式夹板结构。z y l b e r b e r g 等( 1 9 9 1 ) 人研究的孔雀鱼( p o e c i l i a r e t i c u l a t a ) 鱼鳞与赤立鱼鳞结构极为相似，但是o n o z a t o 等( o n o z a t oa n dw a t a b e ，1 9 7 9 ； z y l b e r b e r ga n dn i c o l a s ，1 9 8 2 ) 人研究了鲫鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 鱼鳞的结构发现胶 原纤维呈双股螺旋式夹板结构。鱼鳞中是否尚存在其它的结构形式还有待于进一步 的探索。 鱼鳞中羟基磷灰石与胶原纤维的排列方式有两种观点，一种观点认为羟基磷灰 石同时存在于鱼鳞的骨质层与纤维质层中，在纤维板层内部羟基磷灰石与胶原纤维 束平行排列( z y l b e r b e r ge ta 1 ，1 9 9 2 ；n a g a ie ta 1 ，2 0 0 3 ) ，n a g a i ( 2 0 0 1 ) 等人利用x 射线和能谱在赤立鱼鳞内层非常清晰的找到了羟基磷灰石的晶体，并给出了羟基磷 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 灰石中p 2 0 5 、n a 2 0 、m g o 和c a o 的百分含量分别为4 1 、3 、2 和5 4 。另一种观 点认为在鱼鳞纤维板层的内部没有羟基磷灰石存在，羟基磷灰石只分布在鱼鳞的表 面，覆盖并保护鱼鳞的结构。段蕊等研究认为鲤鱼鳞内部不含或含极少量的无机质 ( 段蕊等，2 0 0 6 ) 。无论那种观点均表明胶原纤维与羟基磷灰石互相粘附，所以在 预处理中要加强脱钙，以便于胶原脱离磷灰石晶格的束缚而溶出。 1 2 2 鱼鳞胶原蛋白的生理功能与生物价值 鱼鳞中主要成分为胶原蛋白和羟基磷灰石。鱼鳞中蛋白质含量大约5 0 - - - 6 0 ， 其中胶原蛋白约占2 0 - - 4 0 。鱼鳞灰分含量高，约占3 0 ，主要成分是羟基磷 灰石，绝大部分集中在骨质层。鱼鳞中脂质含量少( 刘文涛等，2 0 0 6 ) ，海水鱼鳞 中含有较为丰富的磷脂，占7 左右，具有提高机体免疫力、延缓衰老、增强骨细 胞和神经细胞功能的作用，还与机体的生殖生理和激素的代谢密切相关( 许益民， 1 9 9 4 ) 。鱼鳞中还含有多种不饱和脂肪酸，可在血液中以结合蛋白的形式帮助传送 和乳化脂肪，减少胆固醇在血管壁上的沉积，具有防止动脉硬化、预防高血压及心 脏病等功用( 张憨和张骏，2 0 0 6 ) 。 1 5 0 0 年前的名医别录对鱼鳞的药用价值有记载：取鲤、鲫之鳞片，文火熬 成胶胨，可治妇女崩中带下，并对紫癜、齿龈出血有效。陈藏器、李时珍等对鱼鳞 进行了专门的著述，指出t 鱼鳞其性味甘、成、平。功能主治t 养血、止血、再生 障碍贫血、崩漏带下、烫火伤、补肾固精、白血病、产后血晕等。现代研究表明， 鱼鳞还有抗癌、抗衰老、降低血压等生理功能( 王彩理，2 0 0 2 ) ，可以替代来源稀 少的龟胶，有效率在9 5 以上( 谢克难等，1 9 9 6 ；郭庆和艾春香，2 0 0 5 ) 。 鱼鳞特有的生理功能产生的原因主要有： ( 1 ) 鱼鳞中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量最高。有人曾经研究过阿胶、龟 甲胶、明胶等不同胶原蛋白中甘氨酸和脯氨酸的比例，证明不同种类的胶原蛋白中， 甘氨酸和脯氨酸的比例不同，疗效和功能也不相同。 ( 2 ) 鱼鳞在熬煮或消化过程中功能性肽类的产生。现在的研究已经证明一些 短肽也可以被人体吸收，已经有动物实验证明：鱼鳞蛋白水解液形成的分子量在1 0 0 0 以内的短肽，具有降低小白鼠血压、抗体内血栓的形成和抗氧化的作用。 ( 3 ) 胶原蛋白分子的类纤维素性质。日本学者田中等曾经以鱼鳞及膳食纤维 对大白鼠进行试验，发现鱼鳞对大白鼠降低胆固醇的作用比膳食纤维效果好。由于 胶原蛋白中具有较多的中性和酸性氨基酸的特性( 甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨 酸) ，从而有聚负离子集团的作用，可以吸附肠道毒素和重金属。又由于胶原蛋白 具有一定的乳化性能，疏水性较强的氨基酸被包埋在分子内部，形成特定的疏水区 域，胆固醇、甘油脂类等物质可以进入分子内部，有效防止高胆固醇血症的形成， 具有明显的降低血清t g 和t c 的功能。 6 鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制备研究 ( 4 ) 鱼鳞中微量元素的作用。鱼鳞表层的钙化层中钙、磷和铁的含量较高的， 胶类的生血、补血功能与铁的含量密切相关。也有人研究发现：脾气虚弱患者或阴 虚、阳虚患者血液中锌的含量比正常人低，锌铜比值低。锌是许多酶类的辅基，而 胶中的锌铜比值是很高的，因此胶类在调节人体微量元素的平衡方面也起着非常重 要的作用。 ( 5 ) 聚负离子基的作用。由于胶中含有较多的中性氨基酸和酸性氨基酸，具 有形成聚负离子基的基础。此结构由于带有较多的负电荷，可以不进入细胞，仅通 过细胞外间质的代谢改善细胞的功能，改善细胞的微环境，对生物体的各项机能起 到调节作用。 1 2 3 鱼鳞资源的开发利用 目前对鱼鳞的开发利用主要有以下几个方面： ( 1 ) 提取鱼鳞胶。鱼鳞胶是鱼鳞经脱色、酸碱处理、熬炼出来的一种由胶原 蛋白转变成的明胶，具有滋阴止血、润肺、补肺等独特功效，可用作为胶凝剂、稳 定剂、乳化剂、增稠剂、发泡剂和澄清剂等，广泛应用于罐头、饮料、乳品加工、 肉制品加工、果酒酿造等方面。鱼鳞胶的制取可采用酸碱法，也可采用酶法，酶法 制取的鱼鳞胶具有更好的品质，是鱼鳞胶制取的发展方向。王彩理等的研究表明， 酶处理可代替长时间浸灰，还能将不溶解的粗蛋白分解，保留原料中的有效活性成 分；采用枯草杆菌中性蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白的最佳工艺条件是：温度5 0 ，酶 用量1 5 9 d l ，水解时间6h ，底物浓度2 0 ( 王彩理，2 0 0 2 ) 。 ( 2 ) 制备鱼鳞水解液。加入不同类型的蛋白酶将鱼鳞中的胶原蛋白大分子进 行水解，可得到聚合度较小的多肽类和游离的氨基酸。鱼鳞含有比较多的甘氨酸、 天冬氨酸、脯氨酸、丙氨酸，少量的胱氨酸、色氨酸等，其中呈味氨基酸的含量很 高。鱼鳞胶原蛋白在水解过程中还会产生具有特定功能的功能肽。实验证明，鱼鳞 蛋白水解液具有抗氧化、降血压、降低血液总胆固醇、抗衰老等功效。k e n j i ( k e n j i e ta 1 ，2 0 0 1 ) 等人介绍了以鱼鳞或其它水产废弃物为原料，生产具有清除体内自由 基和具有a c e ( 血管紧张素) 抑制活性的寡肽的方法，可同时得到无色羟基磷灰石。 刘庆慧等人则报道鱼鳞提取物能显著降低大鼠血清、肝脏脂质过氧化物丙二醛 ( m d a ) 含量，而使超氧化物歧化酶( s o d ) 活力增强( 刘庆慧等，2 0 0 0 ) ( 3 ) 提取羟基磷灰石。羟基鱼鳞中的钙离子主要以羟基磷灰石的形式存在。 羟基磷灰石有良好的生物相容性和生物活性，能与骨形成强的活性连接，可以作为 植入性材料用于美容、医学领域。以鱼鳞为原料生产羟基磷灰石的方法有3 种，( a ) 烧成法，即将去胶原后的鱼鳞高温煅烧，可以得到亚微米羟基磷灰石，拥有3 一- 2 0n m 的细孔和1 2 0i n 2 g 的比表面积，经过煅烧之后的羟基磷灰石基本保持了鱼鳞原有无 机颗粒的形态，是一种制备亚微米磷灰石的简便方法；( b ) 碱溶法，即利用碱液将 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 胶原蛋白除去，经过洗涤干燥得到几十纳米的羟基磷灰石； ( c ) 酸溶解再加碱合成 的方法。 羟基磷灰石对重金属具有吸附作用，晶格中的c a 2 + 对p b 、c d 、c u 等重金属具有 选择性。在常温下，可以很快发生置换反应，使溶液中重金属离子浓度很快降低。 利用羟基磷灰石的性质，由鱼鳞制备廉价的产品用于废水的处理是有前途的，目前 已有一些研究报告。利用水产羟基磷灰石的安全性比较高的特点，也可以用在牙齿 修复、美容、骨科、医药化工等多个行业，日本由鳕鱼制备的磷灰石价格是鳕鱼鱼 粉价格的几倍。 ( 4 ) 提取鱼银。鱼银是鱼鳞表面具有金属光泽的物质，从鱼鳞中提取的鱼银 是一种昂贵的生化试剂，用于珍珠装饰业和油漆制造业，国内外市场很畅销( 张俊 杰，曾庆孝，2 0 0 4 ) 。 ( 5 ) 提取胶原蛋白。胶原蛋白的提取可分为未变性胶原蛋白的提取与变性胶 原蛋白的提取两部分，未变性胶原蛋白的提取一般采用酸法或胃蛋白酶在低温下提 取，胃蛋白酶可以使胶原蛋白在酸溶液中的溶解性增加，既可以增加胶原的提取率 又不会破坏胶原的结构，可以代替长时间的碱液处理。经过胃蛋白酶处理后胶原蛋 白的提取率可以增加一倍到两倍( 段蕊等，2 0 0 6 ) 。i k o m a 等先采用e d t a 去掉鱼鳞 中的矿物质，然后用胃蛋白酶水解得到了i 型胶原蛋白，是一种有潜在高价值的医 学原料( i k o m ae ta 1 ，2 0 0 3 a ) 。变性胶原蛋白一般采用直接加热提取，胶原蛋白的 三螺旋结构在热力作用下解体，生成单链的结构，使胶原蛋白的溶解性大大增强。 加热提取的胶原蛋白再经过真空浓缩、干燥、粉碎等工艺得到产品。 ( 6 ) 其它利用。低值淡水鱼的鱼鳞可用来开发鱼鳞凉粉、鱼鳞冻膏、干制鱼 鳞等食品。鲤鱼、草鱼、青鱼等鱼鳞经洗净、碱水处理、染色阴干后，可根据需要 组合成各种工艺品。 早在2 0 世纪5 0 6 0 年代，我国就开始利用鱼鳞生产明胶，但由于原料来源和质 量问题而被迫停产。日本老太罐头公司已经成功地从鱼鳞中提取出胶原和磷灰石， 并开始商品化生产含胶原和磷灰石的片剂和罐头食品c o l l a g e t i t e 。上海市水产研究所 在2 0 0 3 年与日本金枪鱼饵料株式会社建立了技术、经济合作关系，并将鱼鳞胶原蛋 白的最终产品出口到日本。 1 3 鱼类胶原蛋白特性 1 3 1 胶原蛋白概述 胶原蛋白( c o l l a g e n ) 主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腰、韧带和血 管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能( 蒋挺大， 张春萍2 0 0 1 ) 。胶原蛋白中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸的2 7 ，其一级结 8 鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制各研究 构均为“g l y x y ”重复序列。脯氨酸和羟脯氨酸的含量也特别高，分别占1 4 ，这 两种是胶原蛋白质的特有氨基酸，而色氨酸、酪氨酸以及蛋氨酸等必需氨基酸含量 低，因此，胶原蛋白属不完全蛋白质。胶原蛋白呈白色，是一种糖蛋白，含有少量 的半乳糖和葡萄糖。胶原蛋白具有很强的延伸力，不溶于水，在酸中可溶解( 徐新 宇，2 0 0 4 ：李小勇等，2 0 0 6 ) 。 至今人们己发现1 9 种不同类型的胶原( i 型到xix 型) ，其中容易分离出 来且产量比较高的是前五种胶原。由于各型胶原蛋白的分布以及含量因组织不同而 有很大的差异，因此有目地的选择富含所需胶原蛋白的组织对于获取大量且高纯度 的胶原蛋白制品是相当重要的。如i 型胶原在骨、跟腱、皮肤、血管壁、子宫壁、 羊膜和胎盘中含量丰富，i i 型胶原在透明软骨中含量丰富，i 型胶原在皮肤、血管 壁、子宫壁中含量丰富，主要存在于晶状体中，而v 主要在皮肤和血管壁中含量 丰富( 徐新字，2 0 0 4 ) 。 1 3 2 鱼类胶原蛋白特点 胶原蛋白广泛存在于鱼体中的鱼头、鱼骨、鱼皮、鱼鳞中，一些软体动物如海 蜇、海参等海产品中胶原蛋白的含量也非常丰富。目前，提取胶原所使用的原料主 要来自猪和牛等动物的皮肤等结缔组织，水产动物胶原蛋白特性、组成等不同于猪、 牛等陆生动物的胶原蛋白的，且使用安全性较高( 张艳等，2 0 0 6 ) 。 在国外，对胶原的研究主要围绕海洋鱼类展开，日本的n a g a i 等人已从贝葵 ( n a g a ia n ds u z u k i ，2 0 0 2 c ) 、乌贼( n a g a ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 、紫海胆( n a g a ia n ds u z u k i ， 2 0 0 0 ) 等海生动物皮提取胶原，k i m u l a 等研究了海蜇( k i m u r ae ta 1 ，1 9 8 3 ，m i u r ae t a 1 ，1 9 8 5 ) 、海星( k i m u r ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 、章鱼( k i m u r ae ta 1 ，1 9 8 1 ) 的胶原蛋白。 s a d o w s d a 等( 2 0 0 3 ) 对鳕鱼，p h a n a t 等( 2 0 0 5 ) 对哥鲤等海鱼类皮胶原也进行了 提取和研究。国内学者秦玉青等( 秦玉青和刘承初，2 0 0 2 ) 测定了鱿鱼皮胶原含量， 并探讨了其回收方法；傅燕凤等( 2 0 0 4 ) 对鲢鱼、鳙鱼和草鱼等淡水鱼鱼皮胶原进 行了提取；陈申如等( 2 0 0 4 ) 对鲨鱼、鲢鱼和罗非鱼等鱼皮胶原进行提取，并研究 了它们的酶解性质。 胶原蛋白对温度较为敏感，变性温度一般在3 0 - - , 4 0 。c 范围之内。不同来源的胶 原蛋白热稳定不同，鱼类胶原蛋白的变性温度低于陆上哺乳动物，冷水鱼类胶原蛋 白的变性温度低于热带鱼类胶原蛋白。日本i k o m a ( 2 0 0 3 b ) 等人研究真稠( p a g r u s m a j o r ) 、罗非鱼( o r e o c h r o m 西n i l o t i c a s ) 鱼鳞的变性温度分别为3 0 、3 5 。n o m u r a 研究了沙丁鱼鱼鳞的变性温度为2 7 。n a g a i 等报道沙丁鱼、真稠、日本花鲈的变 性温度分别为2 8 5 、2 8 、2 8 ，李春美等研究了草鱼的变性温度，发现通过黏 度测定的草鱼鳞的变性温度为3 2 ，而通过圆二色谱分析草鱼鳞的变性温度在 3 5 - 4 0 之间，并用拉曼光谱证实了这一结果( l ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。所有研究均表明鱼 9 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 类胶原蛋白的变性温度要低于哺乳动物，如猪皮4 1 ( n a g a ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 胶原蛋白的热稳定性与环境及体温有关，环境温度影响鱼体的体温，进而影响 鱼体中胶原蛋白的氨基酸组成。胶原蛋白的变性温度与胶原蛋白中的氨基酸组成有 关，特别是含有亚氨基的脯氨酸和羟脯氨酸含量有关，另外与胶原蛋白结构中的 g l y x y 序列有关。 1 4 胶原蛋白的应用 胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和 生物可降解性，可广泛应用在医药、食品、化妆品等工业中。 1 4 1 医疗方面的应用 胶原蛋白具有低免疫性、生物可降解性和良好的生物相容性，在医用材料方面 有良好的应用前景。胶原蛋白具有三股螺旋结构，可吸附血浆蛋白，诱导血小板黏 附、聚集、变形，而且能激活凝血系统和纤溶系统形成血栓，促进血浆结块阻止流 血，可利用这一特性开发生产具有止血功能的胶原海绵( 俞耀庭和张兴栋，2 0 0 0 ) 。 目前国外已有g e l f i x 的胶原蛋白海绵，具有良好的止血性能，国内大多为明胶海绵产 品，鱼鳞胶原蛋白海绵的研究目前还处于实验室阶段。 1 4 2 食品方面的应用 近年来胶原蛋白及其降解产物被普遍地用在功能食品和蛋白饮料中，特别是其 降解物几乎没有致敏性、机体能完全吸收。日本厚生省将其作为“健康食品”推向市 场。胶原蛋白还可以作为一种补钙的保健食品，因为血浆中来自胶原蛋白的羟脯氨 酸是将血浆中的钙运输到骨细胞的运载工具，因此摄入足够的胶原蛋白，就能在一 定程度上保证正常的钙质需要量。香港大学预防疾病研究所王凯教授指出，如果缺 少胶原蛋白，用补钙来防治骨质疏松，再多的钙也无法改善( 陈秀金等，2 0 0 2 ) 。 胶原蛋白具有紧密的三螺旋结构，其氨基酸组成具有良好的成膜性，可制成可 食性包装材料，用胶原蛋白制成的香肠肠衣、肉类、鱼类的包装纸、涂抹层及可食 包装膜，具有良好的抗拉强度、热封性、较高的阻气、阻油、阻湿性能，可防止食 品吸潮及干缩变形，还可携带抗氧化剂和除菌剂，保证食品的新鲜度和天然风味。 同时，胶原蛋白还具有良好的染色性，可用天然食用色素染成近似肌肉的颜色，增 加了产品的可接受性。 1 4 3 化妆品中的应用 胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿 因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射 1 0 鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制备研究 作用，因而广泛应用于化妆品行业，现如今市场中销售的面膜、眼霜、护肤霜等化 妆品中很多都含有胶原蛋白。m a o 等研究表明，戊二醛用于胶原蛋白的交联中，可 大大提高胶原蛋白面膜的生物稳定性，从而扩大了胶原蛋白在化妆品中的应用；但 需要注意的是，随着交联度的增加，吸水能力和膨胀度却会降低( m a oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 5 研究目的与意义 我国淡水鱼资源丰富，2 0 0 5 年淡水鱼总产量2 1 8 4 万吨，其中有鳞鱼1 3 1 0 万 吨以上，每年大约可产生6 5 万吨的鱼鳞，除部分出口外，绝大多数未能很好的开发 利用。鱼鳞含有大量的胶原蛋白，可用来提取天然胶原蛋白与明胶，可用于医药、 食品、化妆品行业。因此，研究不同鱼种鱼鳞主要成分在一年中的变化、鱼鳞中灰 分的脱除方法、鱼鳞胶原蛋白的提取技术和鱼鳞胶原海绵的制备技术，对充分利用 渔业资源、减少环境污染、提高经济效益具有重要意义。 本文主要研究内容如下： ( 1 ) 不同鱼种、不同季节的鱼鳞主要成分含量测定与比较； ( 2 ) 鱼鳞脱钙工艺的研究； ( 3 ) 鱼鳞胶原蛋白提取工艺的研究； ( 4 ) 鱼鳞胶原蛋白壳聚糖海绵制备工艺的研究。 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料与仪器设备 2 1 1 试验原料 鱼鳞：华中农业大学农贸市场收集， 2 1 2 试剂 石油醚 a r 浓硫酸 a r 硫酸铜 a r 硫酸钾a r 双氧水 a r 氯化钾 a r 碳酸钠 a r 浓盐酸 a r 冰醋酸 a r 柠檬酸 a r 氢氧化钠a r 高氯酸 a r 浓硝酸 a r 氯化锶 a r 氯化钠a r 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) b r 丙烯酰胺( a c r ) a r 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) a r 十二烷基硫酸钠( s d s ) a r 过硫酸铵( a p ) a r 巯基乙醇( d m e ) a r 甘氨酸( g l y ) a r 氯胺ta r 对二甲基氨基苯甲醛a r 溴化钾 a r 甲醇 a r 洗净晾干备用。 天津化学试剂有限公司 信阳市化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 天津市博迪化工有限公司 武汉市亚泰化工试剂有限公司 上海科昌精细化学品公司 中国上海虹光化工厂 武汉化学试剂厂 天津凯通化学试剂有限公司 上海试剂一厂 国药集团化学试剂有限公司 金鹿化工有限公司 金鹿化工有限公司 上海科昌精细化工有限公司 金鹿化工有限公司 中国国药集团化学试剂公司 中国国药集团化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海惠世生化试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海三爱思试剂有限公司 上海化学试剂公司 上海振兴化工一厂 1 2 鱼鳞胶原蛋白的提取与胶原海绵的制备研究 溴酚蓝 考马斯亮蓝r 2 5 0 胃蛋白酶( 1 ：3 0 0 0 ) 羟脯氨酸标准品 次高分子量标准蛋白 小牛腱i 型胶原蛋白 柠檬酸钠 乙二醇独甲醚 无水乙醇 壳聚糖 戊二醛 明胶 2 1 3 仪器与设备 a r a r a r b r b r b r a r a r a r a r a r c p t g l 1 6g a 型高速离心机 7 2 2 型分光光度计 电热鼓风干燥箱 干燥箱 b s 2 1 0s 型分析天平 b l 2 2 0 0h 型电子天平 h h 6 型恒温水浴锅 微量凯氏定氮仪 马弗炉 索氏提取器 8 1