（水生生物学专业论文）莱茵衣藻叶绿体中表达hemh和lba基因对其产氢影响的初步研究.pdf

论文题目：莱茵衣藻叶绿体中表达h e m h 和l b a 基因对其产氢影响的初步研究 学科专业：水生生物学 学位申请人：黄瑞 指导教师：吴双秀副教授 王全喜教授 摘要 在无氧条件下，莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i ) 中的氢化酶( h 2 a s e ) 能将光合作用过程中产生的h + 和e 或细胞内有机物分解产生的h + 和e 。合成h 2 ，释 放到细胞外。莱茵衣藻的氢化酶( h 2 a s e ) 活性高，而且衣藻培养容易、遗传学背景 清晰、生长速度快、实验操作容易，能利用太阳能和水制氢，被认为是目前非常 有开发潜力的生物制氢的模式藻种。 虽然衣藻的氢化酶( h z a s e ) 活性高，但是衣藻的氢化酶( h 2 a s e ) 活性很容 易受氧气的抑制而失去活性，而氧气又是光合作用的主要产物，这就导致了莱茵 衣藻产氢效率低，限制了工业化产氢的发展。目前降低衣藻细胞内氧气含量的方 法主要是通过去除培养基中硫元素来抑制光合系统i i ( p s i i ) 活性、进而降低光 解水产生的氧气，但是该方法同时抑制了光解水所产生的电子产量，限制了产氢 的电子来源，所以最终导致产氢效率低。因此，要提高衣藻的产氢效率就需要既 降低细胞内的氧浓度又要保障电子的供应。 大豆根瘤中的豆血红蛋白( 1 e g h e m o g l a o b i n ，l b ) ，它与氧气有很高的亲和能 力，能帮助降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用，因而能使大豆根瘤中同样对氧气 敏感的固氮酶具有高效固氮效率，生物发酵工程研究中已经有应用血红蛋白体外 表达而使产量提高的报导。豆血红蛋白由两部分组成，一部分是球蛋白( g l o b i n ) ， 是由大豆( g l y c i n em a x ) 中的豆血红蛋白( l b s ) 基因合成；另一部分是血红素， 是由与大豆共生的慢生大豆根瘤菌( b r a d y r h i z o b i u m j a p o n i c u m ) 合成。在根瘤菌 中，h e m j 噱因编码合成的亚铁螫合酶( f e r r o c h e l a t a s e ) 它催化血红素合成的最 后一步反应，而血红素的合成前体和代谢途径与高等植物和衣藻中叶绿素的合成 相同，由5 a m i n o l e v u l i n i ca c i d ( a l a ) 经一系列反应合成而来，所以衣藻中含有 充足的血红素合成的前体。 本实验尝试将慢生大豆根瘤菌中的亚铁螯合酶h e m 日基因和大豆中的豆血红 球蛋白l b a 基因同时转入衣藻藻种c c 8 4 9 的叶绿体中，通过h e m h 基因表达亚铁螯合 酶( f e r r o c h e l a t a s e ) 催化合成血红素，与球蛋白加一起帮助降低叶绿体内氧气含 量，增加产氢酶h 2 a s e 活性；同时结合部分恢复p si i 活性以增加电子供应量，实 现p s i i 和氢酶同时最大限度行使其功能，为实现在常规条件下利用太阳能持续 生产氢能的研究奠定实验基础。 本论文的主要内容及结果如下： 1 提取慢生大豆根瘤菌的总d n a ，从总d n a 中克隆出了表达亚铁螯合酶的 基因h e m h ，与本实验室前期克隆的球蛋白基因加一起成功地构建了衣藻叶绿体 转化表达载体c 9 4 0 1 一一h e m h - l b a 。 2 通过基因枪法将载体c 9 4 0 1 一，一h e m h - l b a 转入到莱茵衣藻叶绿体中，通过 壮观霉素筛选及液固反复继代培养，获得转基因藻株。 3 通过p c r 及r t - p c r 扩增检测的方法对转基因衣藻h e m h - l b a 进行d n a 及r n a 水平的检测，p c r 结果证实h e m h 和l b a 编码区d n a 已整合到部分衣藻 叶绿体基因组中，r t - p c r 的结果表明h e m h 和l b a 基因在r n a 水平上得到转录。 4 通过w e s t e r nb l o t 方法对转基因衣藻h e m h - l b a 进行蛋白水平的检测，正 常培养条件下h e m h 基因和l b a 基因的蛋白在衣藻叶绿体中都得到了表达，第六 天( 饱和期) 表达量最大，在产氢培养第五天时蛋白量达到最大。 5 对野生藻8 4 9 和转基因衣藻h e m h - l b a 的生长情况进行检测表明：野生藻 8 4 9 饱和时的最大o d 7 5 0 值是3 5 ；转基因衣藻h e m h - l b a 饱和时的最大o d 7 5 0 值 是3 ，略低于野生藻8 4 9 。饱和期时转基因衣藻h e m h - l b a 的最大叶绿素含量为 4 0 m g l 左右，而野生藻8 4 9 的最大叶绿素含量约为3 6 m g l 左右，比转基因衣藻 h e m h - l b a 略低。结果表明，基因h e m h - l b a 的转入影响了莱茵衣藻的生长速度， 但是叶绿素含量没有受到影响。 6 利用紫外分光光度计扫描野生藻和转基因衣藻h e m h - l b a 在5 0 0 n m 到 6 0 0 n m 的o d 值，在5 5 0 n m 处转基因衣藻h e m h - l b a 有血红素吸收峰，表明有微 量血红素合成。 7 比较了野生藻8 4 9 和转基因衣藻h e m h - l b a 在不同含硫浓度0 、1 2 5 、2 5 、 5 0 1 t m 下的氢气产量，氧气含量和产氢速率。结果表明，在各个含硫浓度下转基 因衣藻h e m h - l b a 的氧气量都是比野生藻8 4 9 的氧气量下降的快，产氢量比野生 藻8 4 9 有所提高。 8 通过对转基因衣藻h e m h - l b a 及其野生藻8 4 9 进行光照强度、叶绿素含量、 含硫量三因素三水平的正交实验，确定了以t a p 为培养基的转基因衣藻 h e m h - l b a 及野生藻8 4 9 的最佳产氢条件。实验结果表明，在培养条件2 5 下， 转基因衣藻h e m h - l b a 的最佳产氢条件为光照强度6 0 p m o lm 之s ，叶绿素含量 0 5 m g ，含硫量12 5 9 m o l l ；而野生藻8 4 9 的最佳产氢条件为光照强度6 0 1 a m o lm 之 s 1 ，叶绿素含量0 5 r a g ，含硫量0 m o l l 。 9 根据密码子的简并性修改了亚铁螯合酶基因( h e m h ) 的碱基，使得h e m h 碱基对中的a t 含量达到了6 3 ，利用己修改碱基的大豆球蛋白基因l b a m 成功 地构建了另一个衣藻叶绿体转化表达载体c 9 4 0 1 一j h e m h - l b a m ，现己获得转基因 藻株。 关键词：莱茵衣藻；生物制氢：豆血红蛋白；亚铁螯合酶；叶绿体转化；转基因 衣藻；产氢培养优化 t h e s i st o p i c ：p r e l i m i n a r ys t u d yo fe x p r e s s i o no fh e m ha n dl b a g e n ei nt h ec h l o r o p l a s t o fc h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i ia n di t si m p a c to nh y d r o g e np r o d u c t i o n p r o f e s s i o n a id i s c i p l i n e s ：h y d r o b i o l o g y d e g r e ea p p l i c a n t ：h u a n gr u i i n s t r u c t o r ：a s s o c i a t ep r o f 浙js h u a n g x i u p r o f w a n gq u a n x i a b s t r a c t i na n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，t h e h y d r o g e n a s e ( h 2 a s e ) i nt h ec h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i ip r o d u c e sh y d r o g e nu s i n ge l e c t r o n sa n dp r o t o n sw h i c hc o m ef r o m p h o t o s y n t h e s i sa n do r g a n i cd e c o m p o s i t i o na n dr e l e a s e si n t ot h ee x t r a c e l l u l a r t h e h 2 a s ea c t i v i t yo fcr e i n h a r d t i ii sh i g ha n dcr e i n h a r d t i ig r o w sf a s t ，i se a s yt oc u l t u r e ， h a sc l e a r l yg e n e t i cb a c k g r o u n da n de a s yf o re x p e r i m e n t t h e r e f o r e cr e i n h a r d t ii s t h em o d e la l g a ls p e c i e sf o rt h es t u d yo fb i o h y d r o g e np r o d u c t i o nb yu s i n gs o l a re n e r g y a n dw a t e ra n dh a sg r e a tp o t e n t i a lt ob eu t i l i z e di nt h ei n d u s t r yi nt h ef u t u r e b u tt h eh 2 a s eo fcr e i n h a r d t i ii se x t r e m e l yo x y g e n ( 0 2 ) - s e n s i t i v ee n z y m e ，w h i l e t h eo x y g e ni st h em a i np r o d u c to fp h o t o s y n t h e s i s ，w h i c hl e a d i n gt ot h el o wh y d r o g e n y i e l da n dl i m i t i n gt h ed e v e l o p m e n to fi t si n d u s t r i a lh y d r o g e np r o d u c t i o n c u r r e n t l y t h em e t h o dt ol o w e rt h eo x y g e nc o n t e n ti ncr e i n h a r d t i ic e l l si st or e m o v es u l f a t ei n t h ec u l t u r em e d i u mt os u p p r e s st h ep h o t o s y n t h e t i cs y s t e mi i ( p s i i ) a c t i v i t y ，t h e r e b y r e d u c i n gt h eo x y g e np r o d u c e db yp h o t o l y s i so fw a t e r b u tt h i sm e t h o da l s oi n h i b i t e s e l e c t r o n i cp r o d u c t i o nb yt h ep h o t o l y s i so fw a t e r , w h i c hl i m i t i n gt h ee l e c t r o ns o u r c e f o rt h eh y d r o g e np r o d u c t i o na n df i n a l l yl e a d i n gt ot h el o wh y d r o g e np r o d u c t i o no fc r e i n h a r d t i i t h e r e f o r e ，t oi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo fh y d r o g e np r o d u c t i o no fc r e i n h a r d t i ir e q u i r e sn o to n l yr e d u c i n gt h eo x y g e nc o n c e n t r a t i o ni n s i d et h ec e l l sb u t a l s om a i n t a i n i n gt h es u p p l yo fe l e c t r o n s l e g h e m o g l o b i n ( l b ) i ns o y b e a nr o o tn o d u l e sh a sah i g ha f f i n i t yw i t ho x y g e n a n dc a p a b i l i t i e s i tc a nr e d u c ei n t r a c e l l u l a r o x y g e nc o n c e n t r a t i o na n dr e g u l a t e r e s p i r a t i o n ，t h u se n a b l et h eo x y g e n - s e n s i t i v en i t r o g e n a s ee n z y m ei nt h es o y b e a nr o o t n o d u l e sh a sah i g h l ye f f i c i e n tn i t r o g e n f i x i n ge f f i c i e n c y i ns e v e r a lb i o f e r m e n t a t i o n e n g i n e e r i n gr e s e a r c h e s ，t h eh e m o g l o b i nh a sb e e na p p l i e dt oe x p r e s si nv i t r oa n d i n c r e a s e dp r o d u c t i o no ft h ec u l t u r e s l bc o n s i s t so ft w op a r t s o n ep a r ti sg l o b u l i n ( g l o b i n ) ，e n c o d e db ys o y b e a n ( g l y c i n em a x ) a n o t h e rp a r t i se n c o d e db yt h e s y m b i o t i cb r a d y r h i z o b i u mj a p o n i c u m i nt h e8 j a p o n i c u m h e m hg e n ee n c o d e st h e f e r r o c h e l a t a s ew h i c hc a t a l y z e st h ef i n a ls t e pi nh e m es y n t h e s i sa n di sn e c e s s a r yi nt h e h e m e ( h e m e ) s y n t h e s i s t h ep r e c u r s o r so fh e m ea r es i m i l a rt ot h o s eo fc h l o r o p h y l l si n cr e i n h a r d t i ia n dh i g h e rp l a n t sv i at h e5 - a m i n o l e v u l i n i ca c i d ( a l a ) p a t h w a y t h e r e f o r e i ncr e i n h a r d t i ic e l l st h e r ea r ea d e q u a t ep r e c u r s o r sf o rh e m es y n t h e s i s t h i ss t u d ya t t e m p t st ot r a n s f e rt h es o y b e a nr h i z o b i ah e m hg e n ea n ds o y b e a nl b a g e n ei n t ot h ec h l o r o p l a s t so fc r e i n h a r d t i is t r a i nc c8 4 9t os y n t h e s i z et h ea c t i v el b ， w h i c hw o u l dh e l pt or e d u c et h eo x y g e nc o n t e n ti n s i d et h ec h l o r o p l a s ta n di n c r e a s e a c t i v i t y o fh 2 a s e w i t ht h eh e l p so fp a r t i a lr e s t o r a t i o no fp si ia c t i v i t y , t h e i m p r o v e m e n to ft h ee l e c t r o ns u p p l yf r o mp s i im a i g h ti n c r e a s et h eh y d r o g e ny i e l do f t h et r a n s g e n i ca l g a e t h ew o r ki san e w a t t e m p tt oi m p r o v e m e n to fh y d r o g e ny i e l db y u s i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c so fl e g h e m o g l o b i n t h em a i nr e s u l t so ft h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 t o t a ld n a o f 丑j a p o n i c u mh a sb e e ne x t r a c t e d t h ec o d i n gr e g i o no fb o t h t h ef e r r o c h e l a t a s eg e n e ，h e m h , f r o m 丑j a p o n i c u m ，a n dt h el e g h e m o g l o b i ng e n e ，l b a , f r o mg l y c i n em a x ，w e r et r a n s f e r r e di n t oc h l o r o p l a s to fc r e i n h a r d t i i c h l o r o p l a s t t r a n s f o r m a t i o nv e c t o rc 9 4 0 1 一j 一h e m h - l b aw a sc o n s t r u c t e d 2 t r a n s g e n i cc r e i n h a r d t i iw a sg o t t e db yt h eg e n ep a r t i c l em e t h o da n ds c r e e n e d o nt h es o l i ds p e c t i n o m y c i nm e d i u s u b c u l t u r e du n d e rl i q u i d - s o l i dm e d i u mw i m s p e c t i n o m y c i nr e p e a t e d l yt om a i n t a i nt h et r a n s g e n i ca l g a e 3 t r a n s g e n i ccr e i n h a r d t i i w e r ei d e n t i f i e d b y t h ep c ra n dr t - p c r a m p l i f i c a t i o nb a s e do nt o t a ld n a a n dr n a r e s p e c t i v e l y p c rr e s u l t sc o n f i r m e d h e m ha n dl b ac o d i n gr e g i o nd n a sh a v e b e e ni n t e g r a t e di n t op a r to fa l g a lc h l o r o p l a s t g e n o m e s r t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h a th e m ha n dl b ag e n e sa r et r a n s c r i b e da tt h e r n al e v e l 4 w e s t e r nb l o t t i n gr e s u l t sc o n f i r m e dt h a tf e r r o c h e l a t a s ea n dl b ap r o t e i ne x p r e s s e d s u c c e s s f u l l yi nc r e i n h a r d t i ic h l o r o p l a s t sb o t hi nt h en o r m a lc u l t u r ec o n d i t i o na n di n t h ea n a e r o b i cc o n d i t i o n t h em a x i m u me x p r e s s i o nl e v e la p p e a r e do nt h es i x t hd a yo f n o r m a lc u l t u r ec o n d i t i o na n do nt h ef i f t hd a yo ft h ea n a e r o b i cc o n d i t i o n ，r e s p e c t i v e l y 5 b yc o m p a r i s o no ft h eg r o w t ho fw i l da n dt r a n s g e n i c ，t h eo d 7 5 0o ft r a n s g e n i c a l g a ei s3 ，a b o u t14 s l i g h t l yl o w e rt h a nt h a to fs t r a i nc c 8 4 9 b u t ，t h ec h l o r o p h y l l c o n t e n to ft h et r a n s g e n i ca l g a ew a sa b o u t4 0m g l ，h i g h e rt h a nt h a to fs t r a i nc c 8 4 9 t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h et r a n s f o r m a t i o no fh e m h - l b ag e n ea f f e c t e dt h eg r o w t ha n d c h l o r o p h y l lc o n t e n to ft r a n s g e n i ca l g a e 6 u s i n gu vs p e c t r o p h o t o m e t e rt os c a nt h eh e m ee x t r a c t i o no fs t r a i nc c 8 4 9 a n dt r a n s g e n i ca l g ah e m h - l b ab e t w e e n5 0 0 n ma n d6 0 0 n m ，t h e r ei sas m a l la b s o r p t i o n p e a ki n5 5 0 n m t h er e s u l ts h o w e dt h a tt r a n s g e n i ca l g ah e m h - l b as y n t h e s i z e ds m a l l q u a n t i t yo fh e m e 7 t oc o m p a r et h ea m o u n to fh y d r o g e ny i e l d ，o x y g e nc o n t e n ta n dh y d r o g e n p r o d u c t i o nr a t eo fs t r a i nc c 8 4 9a n dt r a n s g e n i ca l g ah e m h - l b aa td i f f e r e n ts u l f u r c o n c e n t r a t i o n so f0 ，12 5 ，2 5 ，5 0 ，t h er e s u l t ss h o wt h a ti nv a r i o u ss u l f u rc o n c e n t r a t i o n ， t h eo x y g e nc o n s u m p t i o nr a t eo ft r a n s g e n i ca l g ah e m h - l b aa r el a r g e rt h a nt h a to fs t r a i n c c 8 4 9a n dh y d r o g e np r o d u c t i o ni n c r e a s e dc o m p a r e dt ow i l da l g a e8 4 9 8 t h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n to fl i g h ti n t e n s i t y , c h l o r o p h y l lc o n t e n t ， s u l f u rc o n t e n t ( t h r e ef a c t o r sa n dt h r e el e v e l s ) ，t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rh y d r o g e n p r o d u c t i o n o ft r a n s g e n i c a l g ah e m h - l b aa n dw i l da l g a e 8 4 9w e r ei d e n t i f i e d r e s p e c t i v e l y i nc u l t u r ec o n d i t i o n sa t2 5 * ( 2 ，6 0 l am o lm 。2s 。1 l i g h ti n t e n s i t y , o 5 m g b o t t l e o ft h ec h l o r o p h y l lc o n t e n ta n d ，1 2 5 1 x m o ll 。1 o fs u l f u rc o n t e n tf a v o r e d t r a n s g e n i ca l g ah e m h l b a sh y d r o g e np r o d u c t i o n w h i l ei tw a s6 0 m o lm 2s 。1l i g h t i n t e n s i t y , 0 5 m gb o t t l e o ft h ec h l o r o p h y l lc o n t e n t ，0 m o ll 。1o ft h es u l f u rc o n t e n tb e s t f o rs t r a i nc c 8 4 9 sh y d r o g e np r o d u c t i o n 9 a c c o r d i n gt oc o d o nb i a so ft h ec h l o r o p l a s td n ao fcr e i n h a r d t i i t h e n u c l e a ra c i d so fh e m hg e n ea n d h ag e n ew e r em o d i f i e dt om a k et h ea tc o n t e n t r e a c h i n g6 3 t h em o d i f i e dh e m hg e n ea n d b ag e n ew e r ea l s os u c c e s s f u l l y t r a n s f o r m e di n t ot h ec h l o r o p l a s to fcr e i n h a r d t i i k e yw o r d s ： c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ；b i o l o g i c a lh y d r o g e np r o d u c t i o n ； l e g h e m o g l o b i n ；f e r r o c h e l a t a s e ；c h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n ；t r a n s g e n i ca l g a e ；c u l t u r e o p t i m i z a t i o n 声明上海师范大学硕士毕业论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：黼日期：f 吃严坤 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名铀导师签名同期：印f 哆锄 上海师范人学硕士学位论文第一部分综述 第一部分：综述 1 0 引言 生物质能作为一种清洁的低碳燃料，其含硫和含氮量均较低，同时灰分含 量也很小，所以燃烧后s 0 2 、n o 和灰尘排放量比化石燃料要小得多，是可再生 能源中理想的清洁燃料之一n 3 3 。众多生物质中，藻类是低等植物中种类繁多、 分布极其广泛的一个自养植物类群，与其他生物质如木质纤维素材料( 木材) 相 比，藻类具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高 的特点，同时藻类在水中生长，不占用农业用地，其养殖过程可以实现自动化 控制h 。1 们。此外自然水体( 海洋、湖泊等) 每年能提供非常丰富的藻类生物量，因 此藻类是制备生物质能源的良好材料。 由于氢气具有重量轻、储量丰富、燃烧热值高、清洁可再生和利用形式多 样等优点，被认为是未来社会最具潜力的“含能体能源”。随着燃料电池技术的进 步，可以实现把氢能直接转化为电能，制氢技术的研究颇具潜力1 。 传统的制氢方法需要消耗大量的能量或化石原料，生产成本高，环境污染 重，还排放大量的温室气体。因此，利用低成本、可再生的生物质资源为原料制 备氢气备受人们关注。微藻相对于其他生物质制氢原料而言，具有光合作用效率 高、生长快、氢酶活性高、放氢时间长等优点，是理想的制氢原料之一n 卜1 2 1 ， 其中的莱茵衣藻光解水制氢技术是目前国际上生物制氢领域的研究热点。 1 1 微藻产氢的研究进展 微藻能利用太阳能光水解制氢，是通过微藻光合作用系统及其特有的产氢 酶系把水分解为氢气和氧气的过程。根据所利用的产氢酶系的不同，主要分为固 氮酶制氢、氢酶制氢n 5 l 。 1 1 1 利用固氮酶产氢的蓝藻 第一部分综述 上海师范人学硕士学位论文 在1 9 世纪术有人报道将自然生长的蓝细菌放入玻璃瓶中培养时能够产生氢 气n6 | ，b e n e m a n n 等n 7 1 于1 9 7 4 年发现蓝细菌在氩气中保存几个小时后可以产生氢 气和氧气，至今蓝细菌的放氢研究已有3 0 多年历史，但是目前蓝细菌光能产氢 的能量转化效率较低，在实验室低光度和小于户外同照的0 3 情况下光能转化 为氢能的最高效率仅有1 - 2 n 引。 蓝细菌放氢是固氮酶、吸氢酶和可逆氢酶共同作用的结果，但是主要依靠 固氮酶产氢1 8 棚】，固氮酶( 也包括其它固氮微生物) 把氮气转化为氨气，同时还 原一产生h 2 。具体过程是固氮酶是由m o f e 蛋白( 2 2 0 2 4 0 k d a ) 和f e 蛋白 ( 6 0 7 0 k d a ) 组成，f e 蛋白将外部电子供体传递给m o f e 蛋白，m o f e 蛋白将氮气 还原为氨，同时催化质子的还原瞳0 。2 2 1 ，这个反应需要消耗大量a t p ，反应式为呦3 ： 1 6 a t p + 1 6 h 2 0 + n 2 + 1 0 h + + 8 e 。n i t r o g e n a s l 6 a d p + 1 6 p i + 2 n h 4 + + h 2 av e g e t a t i v ec e l i f s p a t i a ls e p a r a t i o n ) b h e t e r o c y s t s p a t i a ls e p a r a t i o n ) o rp h o t o s y n t h e s i z i n gc e l l ( t e m p o r a ls e p a r a t i o n )o rn lfl x i n gc e l l ( t e m p o r a ls e p a r a t i o n ) 图1 1 蓝细菌营养细胞与异型胞中固氮酶的产氢代谢图 f i g 1 - 1b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fp h o t o b i o l o g i c a lp r o d u c t i o no fh y d r o g e nb yc y a n o b a c t e r i a ( 引自：h i d e r h i r os a k u r a i ，h a j i m em a s u k a w a p r o m o t i n gr & di np h o t o b i o l o g i c a lh y d r o g e n p r o d u c t i o nu t i l i z i n gm a r i c u l t u r e - r a i s e dc y a n o b a c t e r i a ，m a r i n eb i o t e c h n o l o g y , 2 0 0 7 ，3 ：1 2 8 - 1 4 5 ) 2 氢气是固氮反应的副产物眙 捌，产氢反应速度是固氮速度的l 3 1 4 ，在有 上海师范大学硕士学位论文 第一部分综述 氧气的环境下，固氮酶活性受到抑制，产氢停止，所以蓝藻制氢时一般充氩气， 这是因为有氩气存在时，不存在固氮酶的底物n 2 ，因此固氮酶就将所有的电子 用来产氢。一些蓝藻含有异型细胞，异型细胞具有很发达的保护机制，使固 氮酶在氧气环境中不失活，继续进行固氮产氢。在此过程中， 正常细胞进行放 氧光合作用，把合成的有机物转移到异型细胞，异型细胞分解有机物并为固氮 酶提供电子和a t p ，实现固氮和产氢，其产氢代谢过程如图1 一l 。 1 1 2 利用氢酶产氢的微藻 氢酶最早于1 9 3 1 年由s t e p h e n s o n 与s t i c k l a n d 首先发现的瞳7 。矧，它们广泛 存在于原核生物及低等真核生物体内，根据氢酶所含金属元素不同分为 n i f e 型 氢酶和 f e f e 型氢酶，【f e f e 型氢酶的催化效率比 n i f e 型氢化酶约高1 0 1 0 0 倍 之多，是生物制氢研究的热点之一嘲1 。 b s ，n e c l 妇c 野s 挂sp c c 6 8 0 3 图1 2 莱茵衣藻和蓝细菌产氢的电子传递图 f i g 1 2e l e c t r o nt r a n s f e rp m h w a y si n v o l v e di nh ，p r o d u c t i o ni nc h l o r o p l a s t so fc h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i ia n di ns y n e c h o c y s t i sp c c6 8 0 3 ( 引自：l a u r e n tc o u m a c ，f l o r e n c em u s 。e ta 1 l i m i t i n gs t e p so fh y d r o g e np r o d u c t i o ni n c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i ia n ds y n e c h o c y s t i sp c c6 8 0 3a sa n a l y s e db yl i g h t i n d u c e dg a s ， e x c h a n g et r a n s i e n t s j i n t e r n a t i o n a lj o u r n a lo f h y d r o g e ne n e r g y , 2 0 0 2 2 7 ：12 2 9 l2 3 7 ) 3 第一部分综述 上海师范大学硕+ 学位论文 蓝细菌和绿藻都具有氢酶，但是在两类藻中的氢酶是不同的口肛“1 ，蓝细菌 的可逆氢酶和吸氢酶都属于i n i f e 型氢酶。砺。：玎1 。蓝细菌的类囊体膜上存在光合电 子传递链和呼吸电子传递链，其中复合体i 位于两种电子传递链的交接处，复合 体i 既可以参与围绕p s i 的环式电子传递，又可以被从质体醌( p q ) 来的回传电 子流还原，同时还可以在呼吸作用中接受从n a d ( p ) h 传来的电子然后传给p q ( 图1 - 2 b ) ，蓝藻中的可逆氢酶就与复合体l 结合在一起，对调节电子流的分配 起重要的作用口1 。如果当光反应比暗反应快得多或p s i i 的运转速度超过p s i 超过 时，过多的电子可能会传递给氢酶产生氢气从而消耗掉多余的电子。 绿藻的氢酶是 f e f e 型氢酶，以绿藻中的莱茵衣藻为例，它有两个 f e f e 氢 酶的拷i 贝( h y d a l 和h y d a 2 ) ，克隆h y d a l 基因由h a p p e 等人于2 0 0 1 年报道【2 7 3 0 】，在细胞质中表达的h y d a l 被运输到叶绿体中并通过铁氧还蛋白与光合电子 传递链相连乜引，接受光和电子传递链的电子使质子还原产氢。h y d a l 基因的蛋 白的纯化和分析也已经完成汹1 ，之后h y d a 2 的纯化也已经完成9 。，但h y d a 2 的基因功能尚未阐明。它们编码氨基酸数目分别足4 9 8a a ( 4 8k d a ) 和5 0 5a a ( 4 9 k d a ) ，二者之间的氨基酸序列的相同率达6 8 n 州，不同种类绿藻的 f e f e 氢 酶具有很高的相似度h2 1 。虽然【f e f e 型氢酶活性很高，但是产氢过程只能维持 几分钟h 副，这是因为氢酶遇到0 2 和c o 时容易失活，在厌氧的条件下绿藻的氢 酶可以诱导表达h 4 删。 利用微藻产氢的第一篇科学报道是由g a f f r o n 和r u b i n 利用绿藻 s c e n e d e s m u so b l i q r u u s 发现的h 9 l ，当时g a f f r o n 和r u b i n 认为水和碳水化合物是氢 气产生的主要电子来源，不过他们更偏向于碳水化合物，1 9 5 8 年s p r u i tc j p 发 表的一篇文章证明了水是氢气产生的主要电子来源拍0 。，此外淀粉也是电子来源 d r - 5 2 ，电子经过传递链传给铁氧还原蛋白f d ，绿藻的氢酶将f d 传来的电子还原 质子产生氢气如( ( 图1 - 2 a ) ，绿藻是利用氢酶产氢畸驯，它存在于叶绿体的基质中， 在较短的时间内能保持较高的活性。圳，另外在厌氧的环境下，绿藻中的葡萄糖