（植物学专业论文）拟南芥tousled基因在维持转录基因沉默中的功能分析.pdf

摘要 转录水平的基因沉默是由于外源基因整合到植物基因组中造成的转基因或同源的内源 基因沉默的现象。这种现象通常是与d n a 甲基化和组蛋白修饰有关这一过程中有很多与 d n a 甲基化和组蛋白修饰有关的蛋白参与。拟南芥中的r o s l 基因编码一个d n a 糖基化酶 ( g l y c o s y l a s e l y a s e ) ，参与d n a 去甲基化过程。r o s l 基因发生突变后能够使多拷贝的转基因 l u c 和内源r d 2 9 a 基因沉默，这是由于外源和内源r d 2 9 a 启动子甲基化升高造成的。同时 t - d n a 上与三( ，c 相邻的p r o j s s ：n p t i i 也被沉默，从而使转基因植物的卡那霉素抗性丢失。3 5 s 启动子d n a 基本没有甲基化，n p 咒瑾因的沉默是由于3 5 s 启, 动子区域组蛋白修饰变化引起 的，在这个区域中h 3 k 9 一 甲基化升高，h 3 k 4 - 二甲基化降低 我们把对卡那霉素敏感的r o s l 突变体经过e m s 诱变，从后代中挑选出一些能够恢复卡那 抗性的突变体。其中两个表型一样的等位突变体是t o u s l e d ( t s l ) 基因突变造成的。t s l 是 一个在动物和植物中保守的丝氨酸，苏氨酸激酶，最早在拟南芥中被克隆，它对于植物叶子 和花的正常发育非常重要。t s l 基因发生突变后， 驴脚基因表达，t s l r o s l 双突变体能够在 5 0 m g l 的管那培养基上正常生长，但对于l u c 和内源r d 2 9 a 基因的表达没有影响。根据亚 硫酸氢盐测序和s o u t h e r nb l o t 结果显示，t s l 基因突变并没有改变转基因和内源r d 2 9 a 启动子 的甲基化水平，对于着丝粒区，r d n a 区域以及t a 3 区域等d n a 甲基化水平很高的区域也没 有影响，而在重新活化的，5 蹦动子区域，转基因c 2 4 ，r o m 突变体和t s l r o s l 突变体中都没有 甲基化这说明t s l 影响基因表达并不是在d n a 甲基化水平上发生的。除了肝咒瑾因，t s l 突变后还能部分激活内源聊区域的转录，但是对其它转座子区域的表达没有影响。染色质 免疫共沉淀( c h i p ) 表明，在t s l r o s l 双突变体中，姗动子和t 田区域组蛋白h 3 k 9 二甲基 化水平比r o s l 突变体降低，在3 船区j 斑- 1 3 k 4 的二甲基化水平有所升高，这说明这两个区域基 因沉默的释放是由于组蛋白修饰发生了变化，而不是由d n a 甲基化变化引起的。但是w e s t e r n b l o t 结果显示，h 3 k 9 和h 3 k 4 - - 二甲基化的整体水平没有改变。这说明t s l 基因突变对组蛋白 修饰的影响可能仅限于某些特定区域。以前体外研究结果证明组蛋白h 3 可能是t s l 的底物之 一，但是根据c h i p 和w e s t e r n 结果显示t s l 可能不负责h 3 s e r l 0 的磷酸化。哺乳动物中的t s l 同源蛋白t l k 与d n a 损伤修复有关，用u v b 和m m s 处理5 天的苗显示，t s l r o s l 双突变体表 现出比转基因c 2 4 和r o s l 突变体更明显的敏感性。这说明拟南芥中的t s l 可能也与d n a 修复 有关。虽然r o s l 和t s l 都可能参与d n a 修复，但是酵母双杂交结果表明二者没有互作，因 此它们的功能可能有相对独立性。我们的证据显示，t o u s l e d 可能是以一种不依赖丁二d n a 甲基化的方式，在维持拟南芥基冈组某些区域的转录基因沉默中起作用。 关键词：t o u s l e d ，转录基因沉默，r o s l ，d n a 甲基化，组蛋白修饰 a b s t r a c t f o r e i g ng e n e si n t e g r a t e di n t op l a n tg e n o m em a yl e a dt ot r a n a c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g b s ) w h i c hr e s u l ti nt h ei n a c t i v a t i o no f t r a n s g e n e sa n dh o m o l o g o u se n d o g e n o u sg e n e s t h i sp r o c e s s i n c l u d e st h ec o o p e r a t i o no f m a n ye n z y m e sa n dp r o t e i n si n v o l v e di nr n a p r o c e s s i n g , d n a m a t h y l a t i o n , a n dh i s t e n em o d i f i c a t i o n m u t a t i o ni nr o s i ，ap u t a t i v ed n ag l y e n s y l a s e a y a s e , r e s u l t si nh y p e r m e t h y l a t i o no f e n d o g e n o u sa n dt r a n s g e n i cr d 2 9 d p r o m o t e ra n dt h es i l e n c eo f t r a n s g e n i cr d 2 9 a - l u c a n di t sl i n k e d3 5 s - n p t i ls or o s lm u t a n t sa r cs e n s i t i v et ok a n a r n y c i n t h e r ei sn e a r l yn od n am e t h y l a t i o ni n3 5 sp r o m o t e ri nr o s lm u t a n t s , w h i l eh i s t o n eh 3 k 9 d i m a t h y l a t i o ni si n c r e a s e da n dh 3 k 4d i m e t h y l a t i o ni sd e c r e a s e di nt h i sr e g i o n as c r e e na f t e re t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e ( e m s ) m u t a g e n e s i sf o rm u t a t i o n st h a tr e s u 3 t h e k a n a m y c i nr e s i s t a n c ey i e l d e dt w om u t a n t sw i t h t h es a l n ep h e n o t y p e t h e ya l et w oa l l e l e so f t o u s l e d ( 掩) g e n e ，ac o n s e r v e ds e r t h rp r o t e i nk i n a s ei np l a n t sa n d i m a l s ，w h i c hi s i m p o r t a n tf o rt h ep r o p e rm o r p h o g e n e s i so f l e a v e sa n df l o w e r s m u t a t i o n si nt s lr e l e a s et h et g s o f 3 5 s - n p t i i t r a n s g e n e ，s ot s l r o s ld o u b l em u t a n tc a l ls u r v i v eo nm sc o n t a i n i n g5 0 m g l k a n a m y c i n , b u tl u ca n de n d o g e n o u sr d 2 9 ag e n es t i l lk e e ps i l e n c e b i s u l f i t es e q u e n c i n ga n d s o u t h e r nb l o ts h o wd n am e t h y l a t i o nh a sn oc h a n g e sb c t w c c f lr o s a n d 招l r o s lm u t a n ti nr d 2 9 a p r o m o t e r , r d n a ，c e n t r o m e f i cd n a ，a n dt a 3r e g i o n s ，w h i l ei n3 5 sp r o m o t e rr e g i o n , d n a m e t h y l a t i o n i sh a r d l y d e t e c t e d i na d d i t i o n t o n p t i i g e n e , t r a n s c r i p t i o n a l l ys i l e n t t s l s ( t r a n s c n p t i o n a ls i l e n c i n gi n f o r m a t i o n ) a r ea l s op a r t i a l l yr e a c t i v a t e di nt s l r o s lm u t a n t ，t h o u g ho t h e r t r a n s p o s o u sa r en o ta f f e c t e d c h r o m a t i ni m m u n o p r c c i p i t a t i o n ( c h i p ) i n d i c a t e st h a th i s t o n eh 3 k 9 d i m e t h y l a t i o ni sd e c r e a s e di n3 5 sp r o m o t e ra n dt s i sr e g i o n si nt s l r o s lm u t a n tc o m p a r e dt or o s l i ti ss u g g e s t e dt h a tt h er e l e a s eo f g e n es i l e n c i n gi sd u et ot h ec h a n g e so f h i s t o n em o d i f i c a t i o nb u t n o td n a m e t h y l a t i o n w e s t e r nb l o ts h o w st h a tt h ew h o l el e v e lo f h i s t o n eh 3 k 9d i m e t h y l a t i o na n d h 3 k 4d i m e t h y l a t i o nd o e sn o tc h a n g ei nt s l r o s lm u t a n t , s ot s lm i g h ti n f l u e n c eo nh i s t o n e m o d i f i c a t i o n j u s ti ns o m es p e c i f i cr e g i o n s t s lm i g h tn o tb er e s p o n s i b l ef o rh i s t o n eh 3 s 1 0 p h o s p h o r y t a t i o n ，t h o u g hi nv i t r os t u d yp r o v e dh i s t o n eh 3i so n eo f t b es u b s t r a t e so f t s l k i n a s e t h et s ls e e d l i n g sa r em o r es e n s i t i v et od n a d a m a g er e g e n tm m s a n du v - bl i g h t , s ot s lm i g h t p a r t i c i p a t ei nd n ar e p a i r , l i k et l k i na n i m a l s y e a s t - t w oh y b r i da s s a ys h o w st h e r ei sn o i n t e r a c t i o nb e t w e e nr o s ia n dt s l ，s ot h e ym a yf u n c t i o ni n d e p e n d e n t l y o u rr e s u l t sp r o v i d e e v i d e n c et h a tt s lp e r h a p sh a sa ni m p o r t a n tr o l ei nt r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n gi nad n a m e t h y l a t i o ni n d e p e n d e n tm a m m c ri n a r a b i d o p s 括 k e yw o r d s ：t o u s l e d ，t r a n s c r i p t i o n a lg o n es i l e n c i n g , r o s i ，d n am e t h ) l a t i o n , h i s t o n e m o d i f i c a t i o n i i a m p b s c a | v 3 5 s c h i p 伽 d e p c 髓 e d l a 西l s k d k a n 螂s 船 n p t i i s s l p s t a e t e t r i s d s b 缩略词表 a m p i c i l i i n b i s u l f i t es e q u e n c i n g c a t i v 3 5 sp r o m o t e r c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n c e t y l t r i m et h y l a m m o n i u mb r o m i d d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h i d i o mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a u c e t i ca c i d e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e k il o d a l t o n k a n a m y c i n m e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e m u r a s h i g e s k o o gm e d i u m n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s i n s t r i s a c e t i ca c i dg l a c i a l e d t a t r i s - e d t a t r i s h y d r o x y m e t h y l o m i n o m e t h a n e d o u b l es t r a n dd j ab r e a k v 氨苄青霉素 甄硫酸氢盐测序 花椰菜花叶病毒启动子 染色质免疫共沉淀 十六烷基三甲基溴化胺 焦碳酸二乙脂 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 甲基磺酸乙酯 千道尔顿 卡那霉素 甲磺酸甲酯 峪培养基 新霉素磷酸转移酶基因 简单序列长度多态性 t r i s 一乙酸一e d t a 缓冲液 t r i s - e d t a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 双链d n a 断裂 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：王 时间o 6 年j 1 月蹿日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：王喻 时间：圳年1 1 月1 日 导师签名时间：潲f 年“月力日 第一章文献综述 基因表达调控决定着生物体的生长发育以及一切生命活动，对于它的研究是现代分子生物学 的重点。随着研究的深入，将使人们进一步了解各种生命现象的本质，为阐明各种生命活动的机 理奠定了坚实的基础。 除了少数r n a 病毒外，d n a 几乎是所有生物遗传信息的载体。它包括负责蛋白质氨基酸组成 的信息和基因选择性表达的信息基因的表达与否受到很多因素的影响，其中染色质的状态起了 非常重要的作用。对于决定染色质是处于转录活跃的常染色质状态，还是处于不活跃的异染色质 状态的各种因素的研究就成为人们关注的热点问题，包括d n a 甲基化和组蛋白修饰，染色质的组 装等在不同生物中，基因的表达具有一定的时间性和空间性，也就是尽管他们的d n a 序列是一 样的，但是在不同生长阶段和不同组织中基因的表达是不同的，并且这种表达调控的时序性是可 以遗传的。这是一种袭观遗传，一般由d n a 甲基化或组蛋白修饰的改变或两者共同变化引起的 在常染色质区域d 1 蛆甲基化修饰比较低或完全没有，在沉默的异染色质区如着丝粒d n a 区，r d n a 重复区域以及一些转座子区域，d n a 甲基化水平比较高在d n a 复制过程中，这种甲基化状态是 可以遗传的。除了d n a 甲基化水平，组蛋白修饰情况也是决定染色质状态的重要因素之一在真 核细胞中，d n a 和组蛋白组成串连重复的核小体结构，每个核小体包括由2 个h 2 a ，h 2 b ，h 3 ，h 4 组成的组蛋白八聚体和缠绕在外面的1 4 6 b p d n a 。这些组蛋白的修饰可以调节d n a 的可接近性。最 常见的组蛋白共价修饰包括乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化等( z h a n ga n dr e i n b e r g , 2 0 0 1 ) 由表观遗传修饰引起的基因表达调控对于生物体的一切生命活动具有至关重要的作用。因 此，这方面的研究对于阐明生命活动的机理，探索生命活动的本质具有非常重要的意义 1 1d n a 甲基化的研究进展 d n a 甲基化是一种在动植物中普遍存在的现象，它在生物体生长发育过程中的基因表达调控 中发挥了重要作用。例如，在果蝇中过表达小鼠的从头d n a 甲基转移酶d n m t 3 a ，果蝇就会表现出 非常严重的发育缺陷，同时对组蛋白的修饰也产生了影响( w e i s s m a n n , e t a l 。2 0 0 3 ) 在植物 中，d n a 甲基化会对开花( f i n n e g a ne t a t , 1 9 9 8 ) ，胚胎发育，种子存活力( x i a o e ta 1 ，2 0 0 6 ) ， 形态发育( k a k u t a n ie t a l ，1 9 9 6 ) ，基因组印迹( v i e l l e c a l z a d a e t a l ，1 9 9 9 ) 等方面有重要作用，甚 至还可以维持一些转座子的稳定( m i u r ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 1 1 1 参与d n a 甲基化的酶或蛋白 不同物种甲基化位点略有不同，动物中胞嘧啶甲基化基本位于c p o ，植物中c p n p g 和不对称 位点的胞嘧啶也可以被甲基化( g e n d r e l e t a i ，2 0 0 5 ) 。除此之外，被甲基化的胞嘧啶残基的比例 也不同，例如在拟南芥中大约是6 ( k a k u t a n ie t a l ，1 9 9 9 ) ，而在黑麦中可以达到3 3 。甲基化过 低或过高都会引起发育异常( k a k u t a n ie ta 1 ，1 9 9 6 ；w e i s s m a n ne ta 1 。2 0 0 3 ) 。甲基化胞嘧啶的分布 中国农业大学博i 学位论文第一章文献综述 不是随机的，大多数发生在异染色质的重复d n a 区，以及产生s i r n a 的区域( f i n n e g a na n dk o v a c ， 2 0 0 0 ) ，在单拷贝d n a 区域发生的胞嘧啶甲基化对基因表达的调节具有重要作用( j a c o b s e na n d m e y e r o w i t z , 1 9 9 7 ；c u b a se ta t ，1 9 9 9 ) 。d n a 甲基化是由d n a 甲基转移酶催化完成的。d n a 复制 完成后，甲基转移酶会催化s - - 腺苷酰一l 一甲硫氨酸( s a m ) 上的甲基转移到d n a 分子的腺 嘌呤或胞嘧啶上。在动植物中有很多参与此过程的d n a 甲基转移酶 正确的d n a 甲基化模式需要从头甲基化和甲基化的维持两个过程，即未甲基化的d n a 序 列重新起始甲基化和能够忠实的复制已经存在的甲基化( c a na n dj a c o b s e n , 2 0 0 2 ) 维持d n a 甲基化的酶优先催化半甲基化的底物，在新合成的d n a 链上修饰没有甲基化的胞嘧啶，从头甲基 化的酶可以在新合成的d n a 链上从头进行非对称的甲基化( f i n n e g a na n d k o v a c 。2 0 0 0 ) 目前已 知在拟南芥中有两类甲基转移酶负责d n a 甲基化的维持：m e t i 是一个小的多基因家族，可能有 5 个成员，主要负责c p c 甲基化的维持( f i n n e g a na n dd e n n i s ，1 9 9 3 ；k i s h i m o t oe ta 1 ，2 0 0 1 ) ，它与哺 乳动物中的d n m t i 同源，且功能相似。抑制拟南芥中m e t 基因的表达会引起整体胞嘧啶甲基化 的降低，特别是c p g 位点f f i n n e g a ne ta 1 ，1 9 9 6 ；r o n e m u se ta 1 。1 9 9 6 ) 。c h r o m o m e t h y l a s e s ( c m t ) 家族至少有3 个成员，它们的特点是在两个催化m o t i f si 和i v 之间有一个c h r o m o d o m a i n 它们负责 维持c p n p c 甲基化，仅限于植物中有。例如，利用双驴e r 捌虚点和剐瑾因为研究对象，人们 发现c m t 3 基因突变后，会降低t e c p g 位点的d n a 基化( l i n d r o t he t a l ，2 0 0 1 ：b a r t e ee ta i 2 0 0 1 ) 另外一类甲基转移酶d r m ( d o m a i n sr e a r r a n g e d 眦t h y l t r a n s f e i t a s e ) 负责d n a 甲 基化的从头起始，它与动物中的甲基转移酶d n m t 3 a b 具有相似的功能( c a ne t a l ，2 0 0 0 ；c a n a n d j a c o b s e n 。2 0 0 2 ) 。 d d m l 也是参与d n a 甲基化过程的一个重要的蛋白它是s n f 2 s w l 2 家族成员，具有d n a 依 赖的a t p a s e 的活性。d d m l 基因突变后会导致基因组整体甲基化降低，特别是在一些重复序列， 这对很多基因的转录，基因沉默的维持，染色质重塑，d n a 修复等方面都有影响( f i n n e g a na n d k o v a c ，2 0 0 0 ；j e d d e l o he t a l 。1 9 9 8 ) 。另外还有一种s n f 2 s w l 2 类的蛋白d r d i ，它突变后发生在 靶启动子的r n a 诱导的非c p g 甲基化减少，导致基因重新活化，但是着丝粒和r d n a 重复区域的 甲基化不受影响，这与引起整个基因组甲基化降低的d d m i 不同( k a n n oe ta 1 ，2 0 0 4 ) - - _ 此b d n a 糖基化酶还会参与d n a 去甲基化过程。r o s l 是一个d n a 糖基化酶，它能够通过去 甲基化的作用抑制同源依赖的转基因沉默，并且参与d n a 修复( g o n g e ta 1 ，2 0 0 2 ) r o s i 基因 的克隆首先是通过将一段连有兄d 2 劓启动子、工，c 报告基因以及，j 蹁动子- n p t i i 筛选标记的 t - d n a 转入c 2 4 型拟南芥中，在得到稳定的转基因株系后，经e m s 诱变，筛选出工【，c 基因不表达 的突变体，然后克隆到的一个基因( g o n g e t a l 。2 0 0 2 ) 我们的工作就是以r o $ 1 突变体为材料， 再经过e m s 诱变，筛选r o s l 的抑制因子最近研究表明过表i 盘_ g o s l 会导致转基因植株胞嘧啶甲 基化水平下降，增加靶基因的表达( a g i u s e ta 1 ，2 0 0 6 ) d e m e t e r ( d m e ) 也是一个糖基化 酶，它能够通过移去5 甲基胞嘧啶激活母本m f m 等位基因的表达。来自母本的m e a 基因是表 达的，来自父本的m e a 基因是沉默的，它受到m e t i 的控制( g e h r i n ge t a l ，2 0 0 6 ) 。d m e 在种 子发育中的作用可能与m e t l 互相拮抗( x i a oe t a l , 2 0 0 3 ) 。 1 1 2d n a 甲基化的建立和维持 2 中同农业大学博l 学位论文第一章文献综述 d n a 甲基化可以分为d n a 介导的d n a 甲基化和r n a 指导的d n a 甲基化。d n a 指导的d n a 甲 基化可以由同源d n a 序列配对，两侧序列的影响，d n a 形成特殊结构的能力，以及特殊序列内 c p g 或c p n p o 的识别造成( w a s s c n e g g e r , 2 0 0 0 ) 大量的研究证据表明d n a 甲基化可以被小 r n a 所介导( m a t z k ee ta 1 ，2 0 0 i ) ，这被称为r n a 依赖的d n a 甲基化( r n a - d e p e n d e dd n a m c t h y l a t i o n ) r d d m 。它首先在植物中的类病毒系统中发现( w a s s e n g g e r , 2 0 0 0 ) 。在细胞核内， 双链r n a 由r n a 依赖的r n a 聚合酶2 ( r d r 2 ) 以单链r n a 为模板产生或通过d n a 依赖的r n a 聚 合酶转录反向重复d n a 产生。然后被d i c e r - l i k e 家族的酶，如d c l 3 加工成2 1 - - 2 6 n t 的长度，它 可以导致靶r n a 被切割，蛋白编码区或启动子区甲基化( a u f s a t zc t a l ，2 0 0 2 ) 。这种甲基化不仅发 生在c 口g 位点，而且在c p n p g 和不对称位点也有。植物中发现的三种d n a 甲基转移酶在这个过程 中所起的作用也有所不同。根据研究表明，d r m 在r d d m 中负责起始建立c p o ，c p n p o 和不对称 位点的甲基化，c m t 3 负责维持c p n p o 和不对称位点的甲基化，与d r m 有部分功能冗余，且它们 都在s i r n a 积累的下游作用。m e t l 则在这个过程中维持c p g 甲基化( 示意图1 ) ( c a oe t a l ，2 0 0 3 ) 研究表明s w l 2 s n f 2 家族的d r d i 也参与这种r n a 指导的d n a 甲基化( k a n n oe ta 1 ，2 0 0 4 ) ，它可能 使d n a 可以接近r n a 信号。h d a 6 和d d m l 可能在此过程中参与维持c p g 甲基化( j e d d e l o he ta 1 ， 1 9 9 9 ；v i e l l c - c a l z a d a c t a l 1 9 9 9 ) 。d n a 糖基化酶d m e 和r o s i 选择性的去掉某些基因的甲基化 ( m a t z k ee ta l 一2 0 0 5 ) 转录 5- l - _ i _ _ - _ - 反向d n a 重复 或 d s r n a $ i r n a 示意图l 拟南芥【p r n a 指导的d n a 甲基化作用模式( 参 c a ee t a t , 2 0 0 3 ；m a t z l me t a t , z o o s ) 3 1 2 组蛋白修饰 在真核细胞中。染色质的基本单位核小体是由1 4 6 b p 的d n a 包裹着组蛋白八聚体构成，核小 体之间由连接组蛋白h l 连接核心组蛋白进化保守，并且有一个氨基末端的尾巴伸出核小体 ( f i s c h l ee ta 1 。2 0 0 3 ) 组蛋白可以有不同的翻译后修饰，如甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化 等( 示意图2 ) ( z h a n ga n dr e i n b e r g , 2 0 0 1 ) 。这些修饰在转录调节，d n a 复匍j 等方面起了重要作 用。 s k c h t o t o w 1 2 b 示意图2 组蛋白翻译后修饰位点( 参考z h a n ga n dr e i n b e r g , 2 0 0 1 ) 4 中雨农业大学博十。学位论文第一章文献综述 1 2 1 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化通常发生在组蛋白1 - 1 3 或h 4 不同位点的赖氨酸、精氨酸上。包括h 3 k 4 、k 9 、k 2 7 、 k 3 6 、k 7 9 、r 2 、r 1 7 、r 2 6 以及h 4 1 ( 2 0 、r 3 等位点。组蛋白精氨酸甲基化参与基因的活化，是由 组蛋白甲基转移酶中c a r m l p r m t i 家族完成的。不同的组蛋白赖氨酸甲基化修饰对于转录有不 同的作用。在不同物种中的功能也略有不同。h 3 k 4 ，h 3 k 3 6 ，h 3 k 7 9 甲基化是转录活跃的染色质的 标志，它们在真核生物中是比较保守的。但是也有例外，例如出芽酵母r d n a 的沉默就需要甲基 转移酶s c t l 催化的h 3 k 4 甲基化( b d g g se ta 1 ，2 0 0 1 ；8 r y ke ta 1 ，2 0 0 2 ) ；1 4 3 k 9 ，h 3 k 2 7 ，h 4 k 2 0 甲基 化是沉默的异染色质的标志，但是在不同物种间会有所不同( f a c h se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。例如，在酵母中 h 3 k 9 m c 2 主要位于着丝粒，端粒，配型位点这类处于抑制状态的染色质区域( n a k a y a m ae ta 1 ，2 0 0 1 ； n o m a e t a l 2 0 0 1 ) ，没有发现h 3 k 2 7 甲基化，h 4 k 2 0 - - 、二、三甲基化都有，但是可能并不参与 调节异染色质形成( l a t i m e re ta 1 。2 0 0 4 ；s a n d e r se ta 1 ，2 0 0 4 ) ：在果蝇中h 3 k 9 m e l ，2 ，h 3 k 2 7 m e l ，2 和h 4 k 2 0 m e 3 都是异染色质的标志，h 3 k 9 m e 3 和h 3 k 2 7 m e 3 也主要分布在染色中心( e b e r te ta 1 ， 2 0 0 4 ；s c h o t t ae ta 1 。2 0 0 4 ) ；在小鼠中h 3 k 9 m e 3 ，h 3 k 2 7 m e l 和h 4 k 2 0 m e 3 是组成型异染色质的标志 ( p e t e r se ta 1 2 0 0 3 ；r i c ee ta 1 。2 0 0 3 ) ，h 3 k 9 m e 2 ，h 3 k 2 7 m e 3 和h 4 k 2 0 m e i 是偶然的异染色质的标 志，如失活的x 染色体( s i l v a e t a l ，2 0 0 3 ；h e a r d ，2 0 0 5 ) ：在拟南芥中h 3 k 4 m e l ，2 ，3 ，h 3 k 3 6 m e l 23 h 3 k 9 m e 3 。h 3 k 2 7 m e 3 和h 4 k 2 0 m e 2 ，3 是常染色质的标志( s o p p ec ta 1 ，2 0 0 2 ；j a c k s o ne ta 1 ，2 0 0 4 ； l i n d r o t he ta 1 2 0 0 4 ；n a u m a n ne ta 1 。2 0 0 5 ) ，而h 3 k 9 m e l ，2 ，h 3 k 2 7 m e l ，2 承l h 4 k 2 0 m e i 主要集中在异 染色质区( l i n d r o t he ta 1 ，2 0 0 4 ；n a u m a n ne ta 1 ，2 0 0 5 ；j a s e n c a k o v ae ta 1 ，2 0 0 3 ；t a r i qe ta 1 ，2 0 0 3 ) s e t d o m a i n 家族成员是在动物中进化保守的一类组蛋白赖氨酸甲基转移酶，它在基因表达的表观 遗传控制和染色质压缩中起重要作用。根据果蝇中的同源蛋白可以分为四类：e ( z ) ，t r x ，a s h i a n ds u ( v a r ) 3 - 9 ( b a u m b u s c he ta 1 2 0 0 1 ) 果蝇中h 3 k 9 二、三甲基化被s u ( v a r ) 3 - 9 控制，二 h 3 k 2 7 甲基化则是p c - g r o u p 酶e ( z ) 介导的( e b e r t e t a l ，2 0 0 4 ) 哺乳动物中的组蛋白甲基转移酶 s u v 3 9 h 特异性的修饰h 3 k 9 ，转移甲基基团。植物中也有相应的同源基因，许多是通过筛选具有 发育表型的突变体发现的。例如拟南芥中编码动物毋刁同源蛋白的c l f ( g o o d r i c h e t a l ，1 9 9 7 ) ， m e a ( g r o s s n i k l a u se t a i 。1 9 9 8 ) 等。s u v h 蛋白控制着异染色质组蛋白甲基化标记。拟南芥中有l o 个s 僭基因编码的s u ( v a r ) 3 - 9 同源物，其中s u v h i ，s u v h 2 , s u v h 4 ( k r y p t o n l t e ) 代表了不同 的s u v t 瑾因类型。s u w 4 ( k y p ) 是第一个被研究的s u v h 蛋白，它在体外有h 3 k 9 组蛋白甲基转 移酶的活性，并且能够通过c m t 3 和甲基化组蛋白的互作控制c p n p g 甲基化( j a c k s o n e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 s u v h 2 对异染色质的形成和基因沉默具有非常重要的影响，它不仅在体外能够甲基化h 3 ，h 4 ，而 且在体内它还是h 3 k 9 一、二甲基化和h 4 k 2 0 单甲基化转移酶之一，同时也能够影响h 3 k 2 7 单、二 甲基化( k a t h r i n n a u m a n n e t a l 2 0 0 5 ) 。这些s u v h 蛋白虽然都有甲基转移酶的功能，但是分工 可能有所不同，s u v h 4 和s u v h 6 共同作用，维持能产生d s r n a 的反向重复基因的h 3 k 9 甲基化， 如p a h - p a l 4 ( e b b s e t a l 2 0 0 5 ) ，s u v h 5 在这个过程中起的作用比较小；s u v h 4 和s u 5 一起 控制转座子序列的甲基化，而s u v h 6 在这个过程中起的作用则比较小( e b b s e t a l ，2 0 0 6 ) 目前， 对含有s e t 结构域的蛋白的研究越来越深入，除了上面提到的外，还有很多，例如，哺乳动物中 的g 9 a 既可以甲基化h 3 i ( 9 ，也可以甲基化h 3 k 2 7 ( t a c h i b a n a e ta 1 ，2 0 0 1 ；t a c h i b a n a e t a l ，2 0 0 2 ) ， 并且已经有人从h e l a 细胞核中纯化出专一作用于h 3 k 4 位点的组蛋白甲基转移酶s e t - 9 s e t - 7 5 中圉农业人学博七学位论文第一章文献综述 ( w a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；n i s h i o k ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。以前，人们一直认为组蛋白甲基化是一种不可逆的修 饰，但是最近，发现一种包含j m j c 结构域的蛋白j h d m 2 a ，能够特异性的去除h 3 k 9 单甲基化和 二甲基化。这个过程中需要辅因子f “i i ) 和a 一酮戊二酸。j h d m 2 a 以一种依赖于激素的方式招募 到雄激素受体靶基因，导致i - 1 3 1 0 甲基化降低，转录激活( y a m a n e 武a 1 ，2 0 0 6 ) 。 组蛋白h 3 k 9 甲基化和d n a 甲基化被认为是异染色质的标志，二者之问的关系一直是研究的 热点之一在脉孢菌中一个具有s e t 结构域的纽蛋白h 3 甲基转移酶d i m 5 能够控制d n a 甲基化 ( t a m a r ue ta 1 。2 0 0 1 ) ，该基因突变后会引起胞嘧啶甲基化缺失。d m i 5 还能催化产生h 3 k 9 三甲 基化，它在脉胞菌里是d n a 甲基化的标志( t a m a r ue ia 1 ，2 0 0 3 ) 在动物细胞中有研究显示d n a 甲基化存在时，会使组蛋白h 4 去乙酰化，h 3 k 9 甲基化，同时阻止m k 4 甲基化( h a s h i m s h o n ye ta 1 。 2 0 0 3 ) 。在拟南芥中根据细胞学研究认为d n a 甲基化控制着h 3 k 9 甲基化和异染色质的组装( s o p p e c ta i 。2 0 0 2 ) ，而利用染色质免疫共沉淀的方法研究发现d n a 甲基化降低不直接引起h 3 k 9 甲基化 丢失，即d n a 甲基化不能控制h 3 k 9 甲基化，h 3 k 9 甲基化丢失是由于转录激活引起的。d n a 甲基 化足以引起基因沉默，而h 3 k 9 甲基化则不能( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 有人推测这两种互相矛盾 的结果可能是由于研究中使用的是部分缺失的突变体。于是利用c p g 甲基化完全丢失的m e t l - 3 突 变体研究发现，异染色质区和转录沉默的异染色质位点组蛋白h 3 k 9 的甲基化完全丢失，但是并 没有引起异染色质区域压缩结构的改变( t a r i qe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。除了h 3 k 9 外，h 3 k 2 7 甲基化修饰与 d n a 甲基化之间也有一定的关系。有研究显示在拟南芥中，异染色质高c p g 甲基化的特点阻止了 h 3 k 2 7 _ = 甲基化，但是异染色质标志h 3 k 2 7 单甲基化和二甲基化则不依赖于d n a 甲基化( m a t h i e u e ta 1 2 0 0 5 ) 。 1 2 2 组蛋白乙酰化和去乙酰化 组蛋白乙酰化也是一种常见的组蛋白修饰形式，乙酰化可以发生在组蛋白h 4 第5 ，s ，1 2 ，1 6 ， 2 0 位赖氨酸，h 3 第9 ，1 4 ，1 8 ，2 3 位赖氨酸上，h 2 a 和h 2 b 也可以发生乙酰化，但是程度比较低 ( r e y e s e t a l ，2 0 0 2 ) 。乙酰化通常都是发生在暴露在环境中的组蛋白尾巴上，这就为介导重塑染 色质的蛋白互作提供了一个平台。有研究显示，组蛋白h 4 k 8 乙酰化可以招募s w f s n f 复合物， 而h 3 k 9 和h 3 k 4 乙酰化对招募t f i l d 很重要( a g a l i o t iha 1 ，2 0 0 2 ) 。组蛋白乙酰化和去乙酰化是 调节基因转录的两个重要的可逆的过程