霍乱弧菌T6SS针状蛋白VgrG3及其免疫蛋白的结构和功能研究.doc

作者 签名 ：彳 锄三萝名 甌 猇 猻 纑 ， 称 的 疏 水双 层 膜，内 外 膜间 有一 个 亲 水的 间 质 。 大多 数细 菌 需要 分泌 像蛋白 酶或者 酯 酶来 把较 大的 复合物 大分子水解 成它们 能够 吸 收 的 营 养物 质 ，或 者 分泌 一 些蛋白 酶来 帮助 它们 摄 取重要 的 金 属离 子像 铁 离子更 有效地侵染 宿 主，也释 放一 些 毒性因 子到 宿 主细 胞 里，来 降低宿 主细 胞 的 抵 抗能力或 者 把宿 主细 胞 的 信 号 转 化为 对 自 身 有利 的 方向 ；琫 和 接 合转 运途径 在细 菌 迁 移和 生物 膜形 成上 有很大作 用 。泌 系统 的 识别 位点，由 T颂 逶 说街 苤 手 校缓 笸 桶 通 道 而 运出 谋 ； 于 系统 的 功 能多 样性以及它和 的 效应蛋白 一 免 疫蛋白 对群 体 受 来 行使宿 主细 胞 的 重要 使命 。 效应蛋白 一 般 定 位于 细 胞 周质 空 间 中来 降解靶 细 胞 的 细 胞 壁 或 细 胞 膜，进 而 杀 死这 些 竞 争 者 。 这 些 效应蛋白 目 前 根 据 它们 的 是 降解 细 菌 细 胞 膜的 磷脂 酰 乙 琋籑 ， 删 錱 痝 这 个最 近 电 镜研 究 表明的 两 个 蛋白 疶也形 成管 状 结构，长 管 状 复合物 ，它和 噬菌 体 尾 鞘在形 状 及位置 上 很相 似 。 管 被 认为 镶收 缩，注射 出芗 癡 胱 锤 春 衔 ：和 春 衔锏 腘 端 部分具 有极 高 的 相 似 性缤 。 道 ，的 私 峁 褂 蛴 牖袈 一 【 鶵舅 氐鞍 椎 募 鞍 捉涣 = 峁 褂 图 鉴 定 为 是 一 个 肽聚 糖水解 酶，它能水解 其 他 革 兰氏 阴性菌 竞 争 者 的 细 胞 膜肽聚 糖 引 嘶 涵帆 谩 拼 邸 海呲耐旧 、，臁 海唬篿 ： 毗 弧 猒口 啊 瘛“ 鯻 瘛 卜 ，岵 囊 凰 葜 痩瘛鲆弧 !猟叩 悃猅缮 坤呷 啊 瘛瘛鰌 丁 馮 芍 荨虸础甠 甠 輕 帅 伽 峭 畁 窈 墩鰑 啪嗅 兜稹猶 占盈瞅 ”踡卜 癐 海痟 畂 试 验手 段再 结合它们 的 三 维 结构阐 述 了 的 抑 制机 制以及的 酶活 活 存 。 室所保 存 。基因 组 由 北 京 大学 生命 科 学 学 院 苏 晓东 实 验室所 提供 。 表、疘 公 司 ；蚖 购 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶超 声 细 胞 破 碎 仪 ：武汉世纪 超 杰公 司，蛋白 胨 湍 柑 崛 觗至，高 压浞秩芙 猓 颖宜 琌 补 。 表 甘 氨 酸 郾 纺 旱缬 浓 缩胶 配 制表 ， 视 溴 酚蓝 ，混 匀 溶 解 。表 培养基配 制表组 分组 分 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶表 蛋白 的 参数统 计 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶 和 克隆 所 用 的 引 物引 物 序列 引 物 名 称目的 产物 酶切 体 系纯 化回收 酶切 产物 。 各 组 分混 均 ， 消 化过 夜 。回收 酶切 产物 。各 成分充 分混 匀 ， 恒 温 水浴 锅 中静置 。 从 。 淙 龃 蟪 司 鶥 感受 态 细 胞 冰 上 静置 。 甘 油保 菌 。 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶 平衡 好的 酸 、瞻 彼 帷 苯 丙氨 酸 各 琇 异亮 氨 酸 、缬 氨 酸 、亮 氨 酸 各 。 其 后续 步 骤同 咎 蛋白 的 纯 化策 略 。 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶 实 验结果 腝幌 咝蕴 荻 认赐 严 吕 腝尹图 的 阴离子交换 阄 鐾 计 缀 柱 上 明显 出现 四个 峰 ，这 表明在溶 液可能有不 同的 再 尝试 离子柱 纯 化发 现 其 不 挂 柱 ，就 直 接 用 肿 由 冈 爸 徊 酱 炕 如 图 ， 第 聉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶偷 鎏 跫 第 最 终 条 件是 ： 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶图 初 筛时的 晶 体图 优 化后的 晶 体 第 耉 复合物 及的 表达 、纯 化和 结晶牡鎏 跫 生长 纛 的 第 鎏 跫 牡鎏 跫 和 疘 痸牡鎏 跫 挠 呕 材 芑袢 虾 玫木 如 鞍 着任痬图 械腂 詈 蠡竦 媒虾 玫难苌涫莸木 迳 跫 持 一 个 夹 角 ，以及控制晶 体 回摆角 度的 范 围来 实 现 。 ：木 其 中为 晶 胞 中某 一点的 坐标 ，U鼍 奶寤 珽 材为 结构因 子。同 晶 置 换 法 是 在不 改 变 分子和 晶 体 结构的 情 况 下，在晶 体 中引 入 金 属重原 子 硒 代蛋白 晶 体 最 终 结构模型 的 质 量评 价 矗竿 缗型墅塑弧 州 氛 一鲋甖 岫 忡 吲 一冒閜 鼙 第 耇 癡 蛋白 晶 体 结构的 解 析 知 翻 叼 翻 删嘶 !駀咖 一 第 耇 皏 蛋白 晶 体 结构的 解 析 ：。 。 、： 一一 。 ：。 一一一一一一一，一一一一一一一一一一一一一一： 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究本 章 在已 解 析 的 复合物 以及单 体 的 三 维 结构基础上 对其 功 能进 行阐 述 和 进 行一 些 生化试 验验证 。 主要 研 究 内 容 包括：实 验材 料 阃槐 进 行构建的 。 诠鉍 口 广 丌可口 ；瓽魽一厂 茇 籸 诔 ： 口 鯝 。 ：瓵 。 厂 。 瓽。 瓽亿 ；畆丌诔 盯 渤 鎀篢 丁 ；丁 丁 几 肼 ！ 鍭兀。 瓽。 丌。 篿 。 瓵丁 册丌鍭 巧 猘 状 态 的 生物 大分子的 结构模型 。 它对 样品 的 要 求 也比较 低，并且 可在多 种不 同 溶， 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究折 射 率 的 变 化又 和 结合在金 属表面的 大分子质 量称 正比。 因 此，此技 术速 冲洗 后出现 解 离，然 后芯 片 使用 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究的 实 验数据 经处理后和 从 晶 体 学 上 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关功 能研 究整 体 的 结构覸甌 春 衔锝 峁 怪 蟹 掷 氤 隼 具 有溶 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究和 銷 主要 包括 螺 旋及醴雌叫 衟 折 叠 片 缤 中 的 鼠 疫巴 氏 杆 菌 素 与 结构具 有较 高 的 同 源性。 尽 管 和 这 些 蛋白 酶在氨 基酸 序列 上分别 是 、：；：；：；：；誊 ：髭 ：卷 ：鬈：警毫；：；：三 l洌唬桓：#海何甶帮立丘旺 唔 “且 丘姐址 登 址 址 癙 声鶩猼 觯 甹 。 ，”丘丘正正正卫屯 正卫山 丘卫址 土 廖叫簊 瘛 鰓：且 卫卫立正卫卫屯 屯 屯 蚅吐 皊 畂 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究到 。 其 中一 个 非 常明显 的 不 同 是 这 些 同 源性结构中都 有多 出的 一 个 鄣 騛螺 旋插入 片 谒 堑 腘 上 【 螺 旋插入 片 在脱 乙 酰 几 丁质 酶和 鼠 疫巴 式 杆 菌 素 蛘 咴 贑 上 折 叠 插入 片 在 脱 乙 酰 几 丁， 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究结构蛋白 的 不 同 是 ，在其 同 源物 中和 的 及是 可以活 动 的 ，这 种特 征使这 些 蛋白 酶更 容 易 获取底物 ，相 反 ，在它们却 是 固定 的 ，至于 它的 原 因 我 们 后面会 说明。这 些 在结构上 的 不 同 的 差异共 同 说明具 有一 个 独 特 的 结构构型 槐 涮 逡彩 薞 呀 饣钚 浴 饪赡苁 怯捎 贖 突 变 体 里的 主发 生了 变 化，从 而 影 响 了 酶活 活 性凹槽 的 形 状 和 大小 。 此外 ，对 于 脱 乙 酰 几 丁 质 酶维 持 其 活 性其 至关的 突 变 却 对 的 酶活 性并没有明显 的 作用 。用 ，而 处于 关 键位点的 却 对 其 活 性没有明显 作用 。 ： 对 复合物 结构整 体 而 言，分子深 深 地插入 到 的 狢 第 四章 和 复合物 晶 体 结构分析 及相 关 功 能研 究和 槐 涮 宥訲那缀土 直 鸾档 偷 揭吧 偷 鞍 锥 訲缀土 卜 的 柔 性链 而 不 能看到 它的 电 子密 度图 。 此外 ，也被 认为 可以和 ，有可能是 由 于 中间 链 的 断 裂。 在这 里，我 们 提出 个 的 薼 拖嗔赥 腶 都 参与 到 和 的 相 互作八 讨论 分析我 们 使用 瓵搜索 也对 晶 体 结构进 行相 似 性比对 ，结果 发 现 一 个 未中 ，它能够 破 坏 竞 争 者 的 细 胞。 而 对 于 和 是 否是 一 对 效应蛋白 和 免 疫蛋白 对 还 需进 一 步 的 实 验验证 。 另外 ，最 近 的 一 篇文 章 报谒 笔 苁本 蜕 硕 訮的 竞 争 优 势 ，然 后哂 姓 庵 志 赫攀 啤 亲 髡 吒鯬” 如 出控噜 妯 卫啦