（农业昆虫与害虫防治专业论文）杀虫植物鸦胆子组织培养和生物活性的初步研究.pdf

杀虫植物鸦胆子组织培养和生物活性的初步研究 摘要 化学农药的长期使用，产生了严重的“3 r 问题( 即抗药性r e s i s t a n c e ， 再猖獗r e s u r g e n c e ，农药残留r e s i d e n c e ) 。从植物中寻找对有害生物有生 物活性的次生代谢物，经分离、提纯或作为人工合成新农药品种的模板 已成为当代农药研究的经典。 鸦胆子在医药、农药等多方面有很高的应用价值，本文对鸦胆子组 织培养技术体系的建立、鸦胆子提取物的生物活性等进行了初步的探讨 和研究，得出以下结论： 1 、初代培养。以鸦胆子的茎段作为外植体，先用7 5 酒精处理l o s 后，再用无菌水冲洗3 4 次，再用0 1 升汞处理8 1 0 m i n ，最后用无菌水 冲洗4 5 次，获得较好的消毒效果，污染率约1 3 ，存活率约7 30 0 ；诱导 鸦胆子茎段萌芽的最佳培养基采用m s + 6 b a ( 1 - 2 m g l ) + n a a ( 0 1 m g l ) ， 萌芽率约7 3 。 2 、继代培养。鸦胆子芽苗接在m s + 6 b a l m g l + n a a 0 0 5 m g l ，蔗糖 浓度) b 3 0 9 l ，芽苗长势好，增殖效果好，增值系数为3 5 0 。 3 、生根培养。最佳生根培养基1 2 m s + i b a 0 5 m g l ，生根率为4 6 6 7 ，平均生根数为2 2 7 条，植株生长健康。 4 、鸦胆子的茎、叶、种子和愈伤组织的提取率分别为7 6 9 、3 2 9 3 、1 6 8 8 和4 2 ，鸦胆子的愈伤组织提取率最高。 5 、鸦胆子茎、叶和种子的提取物对菜青虫和小菜蛾的幼虫都具有较 好的拒食作用，并随着浓度的增加而增强，拒食率最高达到9 8 2 4 。 6 、鸦胆子愈伤组织提取物在浓度x o m g m l 时，对菜青虫和小菜蛾 的幼虫都有一定的拒食作用，拒食率分别为5 1 5 1 和4 9 4 7 ，但拒食 效果不如茎、叶和种子的提取物。 7 、在浓度5 m g m l 时，鸦胆子愈伤组织的提取物对小菜蛾的非选择 产卵忌避率为6 3 0 7 ，与叶、种子的提取物作用相当，而好于茎的提取 物。 关键词：鸦胆子组织培养生物活性菜青虫小菜蛾 l l s t u d yo nt i s s u ec u l t u r ea n db i o a c t i v i t yo fb r u c e a j a v a n i c a ( l )m e r r x i ez h i g a n ( c o l l e g eo fa g r i c u l t u r e ，g u a n g x iu n i v e r s i t y ，n a n n i n g5 3 0 0 0 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t ： w i t ht h ep e s t i c i d eu s i n gf o ral o n gt i m e ，t h e “3 r s e r i o u sp r o b l e m s ( r e s i s t a n c e ，r e s u r g e n c ea n dr e s i d e n c e ) h a sp r o d u c e d s e e k i n gs e c o n d a r y m e t a b o l i t e sw i t hb i o l o g i c a la c t i v i t yt ot h eh a r m f u lo r g a n i s m sf r o mp l a n t s ， a f t e rs e p a r a t i o n ，d e p u r a t i o no rt a k i n ga st h et e m p l a t et ot h en e wa r t i f i c i a l s y n t h e t i cp e s t i c i d eh a sb e c o m et h ec l a s s i co ft h ec o n t e m p o r a r yp e s t i c i d e r e s e a r c h b r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r h a sm u c ha p p l i c a t i o nv a l u ei nm e d i c i n e ， p e s t i c i d ea n do t h e rf i e l d s i tw a st i s s u e c u l t i v a t i o nt e c h n o l o g ys y s t e mo f b r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r b i o a c t i v i t yo fe x t r a c tt ob r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r a n ds oo nt h a tw e r ep r e l i m i n a r i l yd i s c u s s e da n dr e s e a r c h e di nt h i se x p e r i m e n t t h ec o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 、i n i t i a lc u l t u r e u s i n gt h eb r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r s t e ma se x p l a n t o ft i s s u e ，t h eb e s tw a yo fs t e r i l i z i n gf o rt h ee x p l a n tw a sa sf o l l o w s ：i m m e r s i n g i n7 5 a l c o h o l f o rl o s ，r i n s i n g3 - 4t i m e sw i t hs t e r i l i z e dw a t e r ，a n dt h e n d i s i n f e c t i n gi no 1 m e r c u r i c c h l o r i d es o l u t i o nf o r8 1 0 m i n ，l a s tr i n s i n g4 - 5 t i m e sw i t hs t e r i l i z e dw a t e r t h er a t eo fp o l l u t i o nc o u l dr e a c h13 ，a n dt h er a t e i i i o fs u r v i v a lc o u l dr e a c h7 3 ；t h em o r ef a v o r i t ei n i t i a lc u l t u r em e d i u mo f b r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r 。s t e m si sm s + 6 b a l 2 m g m l + n a a 0 。1m g r n l ， t h er a t eo fb u d sf o r m a t i o nc o u l dr e a c ha b o u t7 0 2 、s u b c u l t u r e t h eb e s ts u b c u l t u r em e d i u mw a s m s + 6 b a l m l + n a a 0 0 5 m g l ，a n ds u g a r3 0 9 ，w h e r e t h es u b c u l t u r e d p l a n t l e t sg r e w w e l l ，t h em u l t i p l i c a t i o nr a t ew a s3 5 0 3 、r o o t i n gc u l t u r e 1 2 m s + i b a 0 5 m g lw a st h eb e s tr o o t i n gm e d i u m ， i nw h i c ht h er o o t i n gr a t ew a s4 6 6 7 ，t h en u m b e ro fr o o t sw a s2 2 7 ，t h e r o o t e ds e e d l i n g sg r e wv e r yw e l l 4 、t h es t e m s 、l e a v e s 、s e e d sa n dc a l l u so fb r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r w e r ee x t r a c t e dw i t hm e t h a n o l ，a n dt h ee x t r a c tr a t e sw e r e7 6 9 ，3 2 9 3 ， 1 6 8 8 a n d4 2 ，r e s p e c t i v e l y 5 、t h ee x t r a c t sf r o ms t e m s 、l e a v e sa n ds e e d so fb r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r h a ds t r o n g e ra n t i f e e d a n ta c t i v i t yt o w a r d sl a r v a eo fp i c r i sr a p a cl a n d p l u t e l l ax y l o s t e l l a ，a n dt h ea n t i f e e d a n ta c t i v i t ye n h a n c e d ，a st h ec o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d ，t h ea n t i f e e d i n gr a t en o n - c h o i c ec o u l dr e a c h9 8 2 4 6 、w h e nt e s t e dc o n c e n t r a t i o nr e a c h e dl o m g m l ，c a l l u se x t r a c t sf r o m b r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r h a da n t i f e e d a n ta c t i v i t yt o w a r d sl a r v a eo fp i c r i s r a p a cl a n dp l u t e l l ax y l o s t e l l a ，a n dt h ea n t i f e e d i n g r a t en o n c h o i c ew a s 5 1 5 1 、4 9 4 7 ，b u ti tw a sn o tb e t t e rt h a nt h ee x t r a c t so fs t e m s 、l e a v e sa n d s e e d s 7 、w h e nt e s t e dc o n c e n t r a t i o nr e a c h e d5 m g m l ，t h eo v i p o s i t i o n i v d e t e r r e n c ee f f e c to ft h ec a l l u se x t r a c t sf r o mb r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r w a s 6 3 0 7 u n d e rn o n c h o i c ec o n d i t i o n ，i tw a ss i m i l a rt ot h ee x t r a c t so fl e a v e s a n ds e e d s ，b u tw a sb e t t e rt h a nt h ee x t r a c to fs t e m s k e yw o r d s ：b r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e r r t i s s u e c u l t u r e b i o a c t i v i t y p i c r i sr a p a cl p l u t e l l ax y l o s t u a v 缩略词 m s 6 b a n a a 2 ，4 d m a 中英文缩略词 英文全称中文全称 m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m sm s 培养基 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e 6 苄基氨基嘌呤 q - n a p h t h y l e n ea c e t i ca c i d q - 萘乙酸 2 ，4 - d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d 2 ，4 - 氯苯氧乙酸 i n d o l e 一3 一b u t y r i ca c i d 吲哚丁酸 v i 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究 工作提供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：；射趱千 日期： 2 0o g 莎月，占日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不 以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论 文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索 与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢 利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。 口不保密。 学位论文全文电子版提交后： 口同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名：邋堂日期：! 丛兰盆1 6 旦 导师签名：望魁日期：丝昼幺鳗垄壁 |1 广西大学蝎i 旺b 掣堰盘论文杀虫植物鸦胆子舞l 织培崮u p 生物活性的初步研究 1 前言 1 1 植物源杀虫剂研究进展 1 1 1 植物源杀虫剂研究的意义 1 1 12 0 世纪3 0 年代末，p a u l m u l l e r 首次将d d t 用于害虫防治，开创了害虫防治史上 的新时代，全世界对农药的需求呈与日俱增的态势( 吴文君，1 9 9 8 ) 。到目前为止， 有机杀虫剂的应用仍是防治农业害虫、卫生害虫、保障农作物丰收和人类健康不可缺 少的重要手段( 姚建仁，2 0 0 3 ) 。然而，由于诸多因素，有机化学农药的应用导致了 众所周知的农药三大副作用，即害虫再猖獗、农药残留、害虫产生抗药性，其影响之 大，范围之广，引起世界范围内的高度重视。同时随着生活水平的提高，健康意识的 增强，人们越来越祟尚天然产品、无污染食品等。因此，无论从目前的无公害农产品 的生产还是从长远的人类社会的可持续发展，都迫切需要研究、开发和应用高效、低 毒、与环境兼容、和谐的农药，减少或替代传统的广谱、高毒有机化学农药，这是农 药发展的必然趋势( 康卓，2 0 0 1 ) 。而生物源农药活性成分是自然存在的物质，自然 界有其顺畅的降解途径，不会污染环境，因此倍受关注，成为人们的研究热点( 李正 名，1 9 9 1 ；徐汉虹，2 0 0 3 ) 。一般说来，生物农药包括植物源、动物源、微生物源( 细 菌、病毒、真菌及其次级代谢产物农用抗生素) 和抗病虫草害的转基因植物等( 朱昌 雄，2 0 0 3 ) 。其中植物源杀虫剂尤其引人瞩目。 植物源杀虫剂是一类利用具有杀虫活性物质的植物的某些部分，或提取其有效 成分而制成的杀虫剂( 张文吉，2 0 0 0 ) 。植物源杀虫剂与化学杀虫剂相比，具有很多 突出的优点( 江绍玫，2 0 0 0 ；徐汉虹，2 0 0 1 ；贝纳新，2 0 0 2 ) ：( 1 ) 植物源杀虫剂 的活性成分是自然存在的物质，自然界有其降解途径，不会污染环境，因而被称为绿 色农药；其安全间隔期短，对作物不产生药害；( 2 ) 植物源杀虫剂的活性成分复杂， 能够作用于昆虫的多个器官，有利于克服害虫抗药性；( 3 ) 有些植物源杀虫剂( 如 烟草和鱼藤的加工品) 可以刺激作物的生长；( 4 ) 植物源杀虫剂原料较易得到，制 造方法简便，成本低廉；( 5 ) 生物活性多样。植物源农药不仅具有杀虫活性，还兼 有杀菌和调节植物生长的作用，且作用方式多样。( 6 ) 对高等动物及害虫天敌安全： 杀虫植物鸦胆子组织培爿l j p 生物活性的初步研究 大多数植物源农药触杀作用不强，对害虫天敌影响很小。正是由于上述的优点，研究 开发植物源杀虫剂成为当今国内外农药研究的热点和前沿。 1 1 2 我国杀虫植物资源和生产应用情况 地球上植物农药资源十分丰富，据统计，当今世界至少有2 5 万种不同植物，有 毒植物种类约占植物种类总数的4 ，而在化学性质上进行过调查研究的仅占1 0 ( b e n n e rp ，1 9 9 3 ) 。a h m e d s 于1 9 8 5 年就全世界报道过的具有控制害物性质的植 物综述了1 6 0 0 种，其中具有杀虫活性的植物1 0 0 5 种，而能引起昆虫拒食、忌避、麻 痹、引诱、生长阻滞及抑制种群繁殖的特异性杀虫植物达7 0 0 多种。中国植物资源十 分丰富，有毒植物就有上千种，中国有毒植物一书列入有毒植物1 3 0 0 余种，其中 许多种类具有杀虫( 菌) 作用或已被作为植物性农药利用。我国农药植物主要分布于 南方各省区，以云南、四川、湖南、江西、广东、广西、福建、海南及台湾等省区拥 有种类最多( 江建云，1 9 9 1 ) 。3 0 年代以来对杀虫植物烟草、鱼藤、厚果鸡血藤、羊 角扭、闹羊花、巴豆、雷公藤、昆明山海棠、博落回、百部等都进行过比较广泛的研 究。 我国是研究和应用杀虫植物最早的国家，进入8 0 年代后，中国对杀虫植物的研 究进入一个新的发展阶段。在某些方面已接近或达到了国际先进水平。华南农业大学、 西北农林科技大学和有关单位协作，在主要研究楝科植物的基础上，先后曾对分属于 3 0 余科的5 0 0 多种植物，以2 0 多种农业害虫为试虫进行了忌避、拒食、内吸、触杀 及抑制生长发育等方面的一系列室内及田间试验，发现了一批有希望的品种，取得了 可喜的成果( 康卓，2 0 0 1 ) 。目前，国外研究较多的有印楝、番荔枝、巴婆、万寿菊 等农药植物，其中最成功的当属印楝。而我国主要集中在楝科、豆科、卫矛科、柏科、 菊科等科属的多种植物，以前三科的植物被认为是最具有开发利用价值的。 1 1 3 植物源杀虫剂开发利用存在的问题 目前，植物源农药的开发利用可分为两方面( 吴文君，1 9 9 6 ) ：一是直接开发 利用，即对植物中的活性物质进行粗提取后，直接加工成可利用的制剂。二是间接利 用，即发现新的活性先导化合物，进行类推合成；发现新靶标，进行生物合理设计。 间接利用是当前国外植物源农药研究开发的盲点，也是我国植物源农药研究发展的方 向( 沈建国，2 0 0 2 ) 。但其存在以下问题( 孙明舒，2 0 0 4 ) ：( 1 ) 合成困难。由于 植物活性成分大多分子量大、官能团多、结构复杂、人工合成十分困难，给构效关系 研究带来较大的困难。 ( 2 ) 有效成分不清楚。有效成分的准确分析和测定对很多植 、 2 广西大掌硕士掌位截杀虫植物鸦胆子绸织培养和生物活性的初步研究 物来说还很难。( 3 ) 抗性问题。严格讲，通过仿生合成产生的这些农药，实际上已 脱离了植物性农药的含义，更多的则属于化学合成农药。因此仿生合成也可能存在抗 性问题，如拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等。( 4 ) 药效问题。植物体内起防御作用的次 生代谢物是长期自然选择的结果，其杀虫效果常常是多种物质相互间结合、增效表现 出的效应，非单一化学成分所致。( 5 ) 新农药创制耗资巨大而效率很低。根据英国 顾问公司p h i l l i p sm c d o u g a l l 之调查，在2 0 0 0 年- 种新农药从研发至登记完成，需耗费 1 8 4 亿美元，况且生产出来若使用不当，又很快会因抗性问题而失效。这些问题严重 制约着植物源农药的发展步伐。 目前，我国在直接利用方面做的工作较多，已开发出印楝素乳油、苦皮藤乳油、 鱼藤酮乳油、油酸烟碱等多种商品化制剂。这种利用方式最大的优势一是无抗性问题， 二是可以综合利用粗提取物中各种成分之间的增效互补作用来增强杀虫效果。而且投 资少，开发周期短。但这种应用方式同样存在许多难关：( 1 ) 植物中有效成分含量 不稳定。这是因为原料不能标准化，要保证质量，就必须不断地根据原料质量调整配 方。( 2 ) 药效不稳定。同一般化学杀虫剂一样，植物源杀虫剂也具有毒杀幼虫、蛹 及成虫的效果，但其杀虫功效受多种因素影响，差异较大。如因植物生长成熟程度及 植物种类、采用植物的部位、抽提用的溶剂、生长的地理位置，以及药效评价方法等 因素的不同，其效果常有差异。此外，其对光不稳定，如光活化毒剂，光照虽可提高 其杀虫效果，但其光活性过程也是降解过程，持效期短。( 3 ) 商品化困难。高活性 的植物成分多存在含量少、稳定性差等缺陷，给直接利用带来较大困难。植物源杀虫 剂是依靠多种草药的药性配制来搭配药方的。这种配剂需要大量植物材料，目前难以 形成化学合成农药那样的大宗商品化生产。( 4 ) 原料问题。直接利用自然资源生产 加工植物杀虫剂与保护植被、绿化和水土保持等方面存在矛盾。当前植物源农药开发 利用存在的种种问题，是影响植物源农药大规模利用的主要因素。 1 2 植物源杀虫剂与植物组织培养 1 2 1 植物组织培养的发展概况 植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生 质体，在人工配制的培养基上给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等， 最后长成完整植株的生物技术。由于是在试管内培养，且培养的是脱离植株母体的培 养物，放也称离体培养或试管培养( 李浚明，2 0 0 2 ) 3 广西大掌硕士学位论文杀虫植物鸦胆子组织培爿l j 生物活性的初步研究 植物组织培养的历史可以追溯到2 0 世纪初。在s c h w a n n 和s c h l e i d e n 仓j j 立的细胞学 说基础上，1 9 0 2 年德国植物生理学家h a b e r l a n d t 提出了著名论点，即植物细胞具有再 生成完整植株的潜在全能性，成为植物组织培养的理论依据。当时他培养了小野芝麻 和风眼蓝的胚组织、万年青属植物的表皮细胞等，限于当时的技术条件，培养未能成 功。但它对植物组织培养的发展起了先导和启发作用，在技术上也是一个良好的开端。 2 0 世纪2 0 年代初至3 0 年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。1 9 2 2 年h a b e d a n d t 的学生k o t t e 和美国的r o b b i n s 采用无机盐、葡萄糖和各种氨基酸培养豌豆 和玉米的茎尖，结果形成缺绿的叶和根，但能进行有限地生长。虽然生长不完全，但 是对植物组织培养的发展起到重要作用。1 9 3 3 年我国植物生理学创基人李继侗进行了 银杏离体胚胎的培养，发现3 n m 以上大小的胚能够正常生长，并观察到银杏胚乳提取 物可促进离体胚的生长，这对于利用植物胚乳汁、幼小种子以及果实的提取物促进培 养组织的生长具有重要意义。1 9 3 4 年w h i t e 成功培养了番茄的根，并建立了第一个生 长十分活跃的无性繁殖系，在以后的2 8 年间转接培养1 6 0 0 代仍能生长。1 9 3 7 年他们首 先配制成综合培养基，发现了b 族维生素对离体根生长的重要性( 李浚明，2 0 0 2 ) 。 同年法国的g a u t h e r e t 、n o b e c o u r t 培养的块根和木本植物形成层得到很好的生长结果。 我国学者罗宗洛于1 9 3 5 - - 1 9 4 2 年进行了玉米根尖离体培养，并取得了很好的结果。他 们确立的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。 2 0 世纪3 0 年代末至4 0 年代，研究工作主要集中在植物细胞器官与营养需求之间的 关系上。1 9 4 1 年o v e r b e e k 在曼陀罗幼胚的培养基中，以椰子乳作为附加物，发现幼胚 可以成熟。1 9 4 3 年，w h i t e 提出了植物细胞“全能性”学说并出版了植物组织培养 手册，使植物组织培养开始成为- - i 1 新兴学科。1 9 4 6 年我国学者罗士韦利用寄生植 物冤丝草茎尖培养观察到花的形成，这对于后人用组织培养方法诱导花芽形成起到了 积极作用。 2 0 世纪5 0 年代后，植物组织培养得到了迅速发展，并广泛应用于生物学和农业科 学的各个领域。s k o o g ( 1 9 4 4 ) 和我国学者崔澄( 1 9 4 8 ) 在研究烟草茎段和髓培养及 其器官形成的工作中，发现腺嘌呤或腺苷不仅能够促进愈伤组织的形成，而且还能解 除培养基中i a a 对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的 比例是控制芽和根形成的重要条件( 刘庆昌，2 0 0 3 ) 。1 9 5 6 年，m i l l e r 等发现了激动素 亦可促进芽的形成，其效力约为腺嘌呤的3 0 0 0 0 倍。同年，美国的r o u t i e r f t 羽n i c k e l l 提 出了从植物细胞培养物合成天然产物的专利。他们试图摆脱自然条件的限制，在人工 4 杀虫植物鸦胆子皇“5 游养和生物活性的初步研究 控制条件下，利用植物细胞的大量培养，工业化生产各种药物( w 巴尔茨，1 9 8 3 ) 。 1 9 5 8 年，英国学者s t e w a r d 在美国把胡萝卜髓细胞培养成为一个完整的植株( n i ug ， 9 9 6 ) 。这是人类第一次实现了人工体细胞胚，使h a b e r l a n d t 的愿望得以实现，也证明 了植物细胞的全能性。这是植物组织培养的第一个突破，它对植物组织和细胞培养产 生了深远影响。 2 0 世纪6 0 年代后，植物组织培养工作已经遍及世界大多数国家，并获得了突飞猛 进的发展，组织和器官培养技术日趋成熟和完善，越来越多的植物物种通过离体培养 获得了再生植株，包括大蒜、黄瓜、番茄等蔬菜，小麦、玉米等经济作物，油棕、泡 桐等经济林木。 2 0 世纪7 0 年代中叶后，由于微生物发酵技术发展迅速，各种形式的发酵装置如气 升式反应器、鼓泡塔反应器等广泛地在微生物发酵培养中得到应用，这也使植物细胞 大量培养的研究得到迅速发展。在国外，由于具备了高度发达的微生物工业，一些植 物学家和微生物学家都想采用类似的常规发酵技术培养植物细胞以生产有用的化合 物。大量的科研投入使这一时期通过植物细胞培养生产的天然产物不断出现。日本电 器公司和北里大学合作研究的人参细胞3 0 吨级发酵培养获得了成功；前联邦德国1 0 0 吨级毛地黄细胞培养已投入工业生产；加拿大细胞培养生产长春花碱和秋水仙碱已进 入中试阶段；法国贡比涅大学在细胞固相化研究方面取得了重要的进展；前苏联己取 得了植物细胞优良突变株系液氮保存的成功。近年来，我国已对三分三、人参、三七 仔、金线莲、红豆杉等进行了大规模的探索并取得了一定的成绩，在工业化方面正在 加紧步伐。 随着对植物组织培养技术研究的不断深入，该技术已渗透到植物生理学、病理学、 药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域。特别是近年来，植物组织培养技 术与分子生物学、分子遗传学以及细胞生物学紧密结合，为细胞杂交、变种筛选、细 胞器移植、外源目的基因的导入，体外酶促基因重组等工作提供了新思路、新领域， 成为生物学科中重要的研究技术和手段之一，并广泛应用于农业、林业、工业、医药 业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，成为当代生物科学中最有生命的 一门学科。 1 2 2 杀虫植物组织培养的研究概况 直接利用成熟的植物细胞或组织培养生产植物性杀虫剂较为简便，是用生物工程 法批量生产植物性杀虫剂最有希望的一条途径( 孙明舒等，2 0 0 4 ) 。利用组织培养技 杀虫植物羽l 胆子组织培爿l j p 生物活性的初步研究 术获得杀虫活性物质的方法比常规获取杀虫活性物质的途径有许多优点( 郭勇等， 2 0 0 3 ；王蜀秀等，1 9 9 5 ；徐庆毅，1 9 9 5 ；曾鑫年等，1 9 9 8 ；郑光植，1 9 8 8 ) 。 ( 1 ) 不受地区、季节、土壤及有害生物包括病虫害的影响。不论北方、南方、冬季、 夏季都可以进行生产，不像常规栽培受到很大的局限性，其外占地面积少，便于工厂 化生产。 ( 2 ) 细胞生长的自动控制和代谢过程的合理调节将有助于降低成本和提高生长率。 利用人工控制和调节，可以获得最大的生长量和合成有用的次生代谢物的最大产量。 ( 3 ) 便于筛选高产细胞株，利于生物转化，寻找新的有效药物成分。对植物进行单 细胞培养，通过辐射等手段，有可能筛选出生长迅速、合成能力强的细胞系，并且利 于寻找新的有效药物成分。 ( 4 ) 个体差异小，实验周期短，设备简单，能节省人力、物力。 ( 5 ) 不需作高度提纯即可以使用，且有助于害虫的杀虫活性提高。 杀虫植物组织培养技术的应用主要包括两个方面：一是利用快速繁殖技术生产大 量优质种苗以满足人工栽培的需要；二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，从杀 虫植物细胞或组织中直接提取杀虫活性物质或通过生物转化、酶促反应等生产杀虫活 性物质。 1 2 2 1 杀虫植物的离体快繁 植物离体快繁是目前植物组织细胞培养应用最多、最有效的一个方面。植物离体 繁殖的突出优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景单一，不受季节和地区等的 限制，重复性好。离体快繁比常规方法快数万倍至百万倍( 刘庆昌，2 0 0 3 ) 。目前， 在国内外研究杀虫植物组织培养方面，离体快繁的研究较多。e e s w a r a 等( 1 9 9 6 ) 将 印楝叶培养于含o 0 8 m g l 细胞分裂素( k t ) 、0 1 m g l ：书基腺嘌呤( 6 b a ) 以及0 6 m g l 腺嘌呤肌酸盐m s 培养基上，最终获得再生植株。龚伟等( 2 0 0 4 ) 以印楝带芽茎段为 外植体，愈伤组织诱导率为1 0 0 ，其繁殖系数3 0 d 可达5 7 倍，生根率3 0 d 可达1 0 0 ， 且根多、生根整齐，生根苗移栽成活率在9 5 以上。s u j a t h 等( 1 9 9 7 ) 进行苦楝微繁 殖时，使用等级低、价格便宜的琼脂、蔗糖，减少诱根的程序，直接把没有根的幼芽 移栽到土壤中，同样获得再生植株，这比种子获取苗更为经济、有效。刺果番荔枝( 赵 沛基等，2 0 0 0 ) ，苦皮藤( 马艳等，2 0 0 3 ) ，烟草( 施和平等，2 0 0 3 ；周仕顺等，2 0 0 5 ) 等杀虫植物均有离体快繁的研究报道。 1 2 2 2 杀虫植物的细胞培养 6 g - 西大掣蝎页士学位该咒杀虫檀物捌胆子胄“$ 己| 奇爿l j p 生物活性的初步研究 细胞培养研究重点是提高植物细胞培养物中的次生代谢产物。影响植物细胞培养 次生代谢物产量的因素很多，在杀虫植物方面的研究主要有以下几方面： ( 1 调控技术应用研究 自b o n n e r 报道了银胶菊植物组织培养物能产生橡胶以来，利用组织、细胞培养 技术生产植物次生物质方面已获得了很大成就。迄今为止，已经研究过的4 0 0 多种植 物的细胞培养可以产生超过6 0 0 种的成分，许多重要的药用植物如紫草、人参、黄连、 毛地黄、长春花、西洋参等细胞培养都十分成功，有些已实现工业化生产。 ( 2 ) 细胞系筛选及培养基优化 在提高植物细胞培养次生代谢物的产率的方法中，最传统的是细胞系筛选以及培 养基优化。在细胞系研究方面，l a m b e r t 等( 1 9 9 3 ) 报道非洲山毛豆的自养营养细胞 系比异养细胞系的愈伤组织合成鱼藤酮的能力强，光混合营养的愈伤组织主要合成鱼 藤酮及其类似物，异养的细胞系的愈伤组织合成的主要是鱼藤素和灰毛豆素。董建新 ( 2 0 0 3 ) 建立了除虫菊细胞悬浮培养体系，并筛选出高产的细胞悬浮株系。在培养基 研究方面，w e w e t z e r ( 1 9 9 6 ) 研究表明，在蔗糖含量n 1 5 9 , l n 培养基中培养的愈伤 组织，印楝素的含量是3 0 9 l n 糖培养基中的3 倍。但有报道印楝细胞的悬浮培养中含 有3 0 9 ，】已蔗糖的培养液更有利于印楝素的合成和积累( 梁军等，2 0 0 3 ；张娟芳等，2 0 0 3 ) 。 吴智鹏等( 2 0 0 6 ) 筛选得到了除虫菊细胞悬浮培养的较优改良m s 培养基，该培养基 中碳、氮和磷等元素的浓度分别为4 0 6 0 9 l 、8 5 9 5 m o l 【和0 7 8 m o l l 采用该培 养基进行除虫菊细胞培养，细胞鲜重较优化前提高9 3 。 ( 3 ) 培养方法的选择 培养方法对培养细胞中的次生代谢物产量的提高有很大影响，常用的培养方法有 液体悬浮培养、固定化细胞培养、两步培养法、两相培养法等。液体悬浮培养雷公藤 愈伤组织生产速度明显高于固体培养下的组织，其生产最快可达1 1 9 3 9 ( l d ) ，二萜 内酯含量高到6 4 1 4 m g l ( 尹作鸿，1 9 9 2 ) 。p e p i n 等( 1 9 9 1 ) 利用固定化雷公藤细胞 产生雷公藤二萜、三萜，研究表明：固体化细胞技术在产物获得方面具有悬浮培养所 无法比拟的优点，目前已经在2 l 的反应罐中成功了固定化细胞的发酵。有些植物细胞 的次生代谢物生产与细胞生长并不是同步进行的，而是落后于细胞生长，即在细胞生 长末期或结束时才开始累积次生物质，而且，细胞次生物质累积过程中，对培养基中 的营养元素的要求可能不同于细胞生长时期所需求的营养元素，因而，采用两步培养 法较适合这一类植物，可显著提高次生代谢物产量。在黄花篙( a r t e m i s i aa n n u a ) 细 7 杀虫植物鸦胆子组织培 嵴和生物活性的初步研究 胞培养过程中：分两步培养，第一步在含有0 2 0 4 m g l 6 & 谛3 - 4 m g l i a a 的n 6 培养基 中进行细胞的增殖培养，第二步将培养好的细胞转入含0 2 0 4 m g l 6 b a f f 【1 0 2 0 4 m g ij aa 的改良n 6 培养基中进行青篙素的合成，青篙素的合成量为1 9 0 t g l ，干细胞左 右( 李弘剑等，1 9 9 9 ) 。 ( 4 ) 发状根培养技术 发状根培养技术被认为是生产植物次生物质的一条新途径，是利用土壤中的一种 发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 感染植物叶片组织，在感染过程中，发根农 杆菌质粒r i 转移并整合到植物基因中，诱导植物产生发状根( 徐汉虹，2 0 0 1 ) 。 m u k u n d a n 等( 1 9 9 0 ) 对比了正常的根愈伤组织和用发根农杆菌系t r l 0 5 侵染黄花篙组 织产生的发状根，结果表明，发状根比正常的根愈伤组织生长速度快，而且生物合成 量也要高。 ( 5 ) 代谢调控技术 在细胞培养过程中，适时适量加入营养物、前体、引发剂等物质，使代谢向着合 成所需目的产物的方向进行，从而获得高出率。这种代谢调控技术成功的关键是明了 整个代谢网络，并对其中控制点有相当清楚的了解( 徐汉虹，2 0 0 1 ) 。谢建军( 2 0 0 0 ) 对毛鱼藤离体培养生物合成鱼藤酮的调控技术进行了系统和深入的探讨，添加不同浓 度前体物对毛鱼藤愈伤组织合成鱼藤酮的能力有明显的影响，l o o u g m l 和1 5 0u g m l 苯丙氮酸对其合成能力有较大的提高，每升培养基鱼藤酮的总产量可达2 9 8 4 3 9 u g l 和2 4 6 6 4 6 u g l ，比对照高出近一倍的量。 1 3 鸦胆子研究进展 1 3 1 鸦胆子的生物学特性及地理分布 鸦胆子( b r u c e aj a v a n i c a ( l ) m e l t ) ，属苦木科( s i m a r o u b a c e a e ) 、鸦胆子属 ( b r u c e a ) ，又称老鸦胆、苦参子。鸦胆子常绿大灌木或小乔木，高达3 米，全株均 被黄色柔毛。单数羽状复叶，互生，有长柄；小叶对生，长卵状披针形，基部楔形或 两侧不对称的斜圆形，边缘有三角形粗齿，上面绿色，下面淡绿色。圆锥聚伞花序 腋生，雌雄异株，雄花序长1 0 3 0 厘米，雌花序长4 1 8 厘米；花极小，红黄色；雄 花萼片4 ，披针形，花瓣4 ，线状披针形，雄蕊4 ，着生在花盘下方，花盘4 裂；雌 花萼片4 ，三角形，花瓣4 ，长圆状披针形，子房由4 心皮组成，上部离生，下部被 花盘包围，花柱下弯，柱头长尖形。核果长卵形，先端略向外弯，成熟时黑色，具突 广西大学强炙士掌位论文 杀虫扭h 勿鸦雕争鸯瞧见培养和生物活性的初步研究 起的网纹( 瞿自明，1 9 8 9 ) 。 鸦胆子适应性很强，常生于草地、灌丛及路旁向阳处；除广泛分布于我国的广东、 广西、福建、台湾、海南和云南等省区外，在亚洲东南部至大洋洲北部也有分布。 1 3 2 鸦胆子的化学成分 鸦胆子成分为苦木内酯、黄酮、酚类等成分。 苦木内酯及其甙类：鸦胆子苦素( b r u c c i n e ) a ，b ，c ，d ，e ，f ，g ，h ，i ( 谢 晶曦，1 9 8 1 ；李铣，1 9 7 9 ，1 9 8 0 ；) 、鸦胆子苦醇( b m s a t d ) ( 李铣，1 9 7 9 ) 、去氢鸦胆 子醇( d c h y d r o b r u s a t o l ，即b r u c c i n ea ) 、去氢鸦胆子亭醇( d e h y d r o b r u c c a n t i n 0 1 ) 、双 氢鸦胆子苦素a 、b ( d i h y d r o b r u c e i n ea ，b 、去氢鸦胆子苦素a 、b ( d c h y d r o b r u c c i n e a ，b ) 、鸦胆丁( b r u c c a n t i n ) 、鸦胆亭醇( b r u c e a n t i n 0 1 ) 、鸦胆子苦素e 21 3 d 葡萄 糖甙( b r u c e i n e e 21 3d g l u c o p y r a n o s i d e ；y a d a n z i g a n ) ( 张金生，1 9 8 3 ) 、鸦胆子苦烯 ( b r u c e e n e ) ( 张金生，1 9 8 4 ) 、鸦胆子苦内酯( y a d a n z i o l i d e ) a ，b ，c 、d 、鸦胆子 甙( y a d a n z i o s i d e ) a ，b ，c ，d ，e ，f ，g ，h ，i ，j ，k ，l ，m ，n ，o ，p ( k a k a k i t ， 1 9 8 5 ) 、鸦胆子苦甙( b r u c e o s i d e ) a ，b ( 谢晶曦，1 9 8 1 ) 和鸦胆子素即鸦胆子双内 酯( j a v a n i c i n ) 。 黄酮：槲皮素3o1 3 d 半乳糖甙( q u e r c e t i n 3o1 3 d g a l a c t o s i d e ) 和木犀草 素7ob d 葡萄糖甙( l u t e o l i n 7ob - d g l u c o s e i d e ) ( 于雅男，1 9 9 0 ) 。 酚类和酸类：鸦胆子酚( b r u c c n 0 1 ) ，鸦胆子酸( b r u c e o l i c a c i d ) 、香草酸 ( v a n i l l i c a c i d ) ( 于雅男，1 9 9 0 ) 和鸦胆子酮酸( b r u c e a k e t o l i ca c i d ) 。 木脂素：含黄花菜木脂素a ( c l e o m i s e o s i na ) 。 脂肪酸：鸦胆子种仁含脂肪5 6 2 3 ，油中不皂化物占1 3 6 ，内含少许挥发油。 油中皂化物占9 2 4 7 ( 杨峰，1 9 9 8 ) ，内含油酸( o l e i ca c i d ) ( 占原脂肪油的8 1 8 7 ) 、 亚油酸( l i n o l c i ca c i d ) ( 3 3 7 ) 、硬脂酸( s t e a r i ca c i d ) ( 2 6 5 ) 、棕榈酸( p a l m i t i ca c i d ) ( 6 6 2 ) 、和三酰甘油酯( t r u o l e i n ) 。 此外还含4 乙氧甲酰基喹诺2 酮( 4 e t h o x y c a r b o n y l 2 g u i n o l o n e ( - 于雅男，1 9 9 0 ) 及胡萝卜苷等。 1 3 3 鸦胆子的应用 1 3 3 1 医药应用研究 鸦胆子作为药用植物历史悠久，据历史资料记载：其味苦性寒，具有清热燥湿、 解毒杀虫、腐蚀等作用，可治疗痢疾、久泻、疟