（免疫学专业论文）基因工程双价、双特异小分子抗体的研制.pdf

中 文 摘 要 基因工程双价、双特异小分子抗体的研制 双特异抗体可以结合两种不同的抗原，具有特殊性能，在临床诊 疗中具有广阔的应用前景，目 前为国际上研究热点之一。本研 利用单链抗体 ( s c f v ) 构建两种基因工程双特异小分子抗体模型， 为双特异小分子抗体的开发和研究提供基础。 ( s c f v 是 一 个 重 链 可 变 区( v h ， 一 个 轻 链 可 变 区( v l ， 由 连 接 肤 ( l i n k e r )连在一起构成的单价小分子抗体。为使其能组装成双价， 本研究对一个抗人红细胞s c f v 和一个抗h b s a g 人s c f v 进行了改造， 将l i n k e r 缩短，强迫不同分子间的v 。 和v l 组合成f v ， 从而形成双价 和双特异小分子抗体 ( d i a b o d i e s ) 。在大肠杆菌中分泌表达的双特异 性d i a b o d y ，具有与h b s a g 和r b c结合的双重活性，并具有双特异功 能即同时结合h b s a g和r b c ，能使含有h b s a g的r b c 悬液产生血 球凝集。证明了双价、双特异 d i a b o d y模型的可行性。为了稳定 d i a b o d y 结构，经基因突变，构建了二硫键 d i a b o d y ，结果使 d i a b o d y 的热稳定性和在尿素中的稳定性得到了一定程度的提高。 我们又利用重链恒定区c h 3 的 双聚化作用，将s c f v 基因与c h 3 融合， 构建了另一种双特异模型 m i n i b o d y 。为了 促进异源二聚体 的形成，我们在 c h 3基因引入突变，分别形成含大侧链氨基酸的柞 状结构 ( k n o b ) ，和含小侧链氨基酸的臼状结构 ( h o l e ) 。然后将 k n o b ” 和“ h o l e ” 分别与 抗h b s a g 和抗r b c单 链抗体基因融合， 构 建成双特异m i n i b o d y 表达载体。 经大肠杆菌 分泌表 达， 检测其双 特 异功能，显示c h 3 界面经适当改造，可促进异源二聚体形成。 在以上双特异抗体制备成功的基础上，率先创建了用基因工程双 特异抗体快速检测血中抗原的方法。外周血一滴与双特异抗体混合， 在 h b s a g( 抗原)阳性时，可迅速导致自 身 r b c凝集。此方法简便 、快速、易观察、不须用静脉血，对乙肝的预防可起到积极作用。具 有直接的经济和社会效益，并为建立新型简便快速的方法检测血中抗 原 提 供了 新 思 路 守 / 关 键词: 双特异抗体d i a b o d y m i n i b o d y 凝集 习 ab s t r a c t c o n s t r u c t i o n a n d e x p r e s s i o n o f g e n e t i c a l l y e n g i n e e r e d b i v a l e n t a n d b i s p e c i f i c a n t i b o d y f r a g me n t s b i s p e c i f i c a n t i b o d i e s h a v e i m m e n s e p o t e n t i a l i n p r a c t i c a l a p p l i c a t io n . h e r e w e d e s c r i b e t h e d e s i g n o f t w o b i s p e c i f i c s m a l l m o l e c u l e a n t ib o d y m o d e l s . s c f v s c o m p r i s e a v h d o m a i n c o n n e c t e d t o a v l d o m a in o n t h e s a m e p o l y p e p t i d e . b y u s i n g a l i n k e r t h a t i s t o o s h o r t t o a l l o w p a i r i n g b e t w e e n t h e t w o d o m a i n s w i t h i n t h e s a m e c h a i n , t h e d o ma i n s a r e f o r c e d t o p a i r w i t h t h e c o m p l e m e n t a r y d o m a i n s o f a n o t h e r c h a i n a n d c r e a t e t w o a n t i g e n - b i n g i n g s it e s ( d i a b o d ie s ) . s t a r t i n g f r o m a n t i - h u m a n r b c s c f v a n d a n t i - h b s a g s c f v , w e b u i l t b o t h b i v a l e n t a n d b i s p e c i f i c d i a b o d i e s . t h e d i a b o d i e s w e r e e x p r e s s e d b y s e c r e t i o n f r o m b a c t e r i a a n d s h o w n t o b i n d s p e c i f i c a l l y t o r b c a n d / o r h b s a g . t h e b i s p e c i f i c d i a b o d y c o u l d c a u s e a g g l u t in a t i o n o f h u m a n r b c w h e n h b s a g w a s p r e s e n t , d e m o n s t r a t i n g t h e b i s p e c i f i c b i n d in g a c t i v i t y . i n o r d e r t o i m p r o v e t h e s t a b i l it y o f t h e d i a b o d y , c y s t e i n e s w a s i n t r o d u c e d i n t o t h e v r e g io n s b y s it e - d ir e c t e d m u t a t i o n a n d d i s u l f i d e - s t a b i l i z e d b i s p e c i f i c d i a b o d y w a s c o n s t r u c t e d . c o m p a r e d w i t h t h e p a r e n t d i a b o d y t h e d i s u l f i d e - s t a b i l i z e d b i s p e c i f i c d i a b o d y w a s m o r e s t a b l e t o h e a t a n d u r e a . u s i n g h u m a n i g g i c h 3 a s d i m e r i z a t i o n d o m a i n , w e c o n s t r u c t e d a n o t h e r b i s p e c i f i c a n t i b o d y f o r m a t -m i n i b o d y . i n o r d e r t o f a c i l i t a t e t h e f o r m a t i o n o f h e t e r o d i m e r , a ic n o b - i n t o - h o l e c h 3 w a s i n t r o d u c e d i n t o m i n i b o d y m o l e c u l e s . t h e k n o b v a r i a n t w a s o b t a i n e d b y r e p l a c e m e n t o f a s m a l l a m in o a c i d w i t h a l a r g e r o n e i n t h e c h 3 d o m a i n a n d t h e h o l e w a s c r e a t e d b y r e p l a c e m e n t o f t h r e e l a r g e r e s i d u e s w i t h t h r e e s m a l l e r r e s i d u e s . u s i n g t h i s a p p r o a c h a n t i - h b s a g / r b c b i s p e c i f i c m i n i b o d y w a s c o n s t r u c t e d a n d e x p r e s s e d i n e .c o l i . r b c a g g l u t i n a t i o n t e s t s h o w e d t h a t e n g i n e e r e d i n t e r f a c e o f c h 3 c o u l d p r o m o t e f o r m a t i o n o f h e t e r o d i m e r s o f d i f f e r e n t a n t i b o d i e s. t h e n a n o v e l s y s t e m f o r r a p i d d e t e c t i o n o f s e r u m h b s a g i n w h o l e b l o o d w a s d e v e l o p e d b y u s i n g t h e g e n e t i c a l l y e n g i n e e r e d b i s p e c i f i c a n t i b o d y f r a g m e n t s . wh e n s u p e rna t a n t s c o n t a i n i n g t h e b i s p e c i f i c a n t i b o d y i s m i x e d w i t h o n e d r o p o f w h o l e b l o o d s a m p l e , i t c a u s e s r a p i d s p e c i f i c a g g l u t i n a t i o n o f t h e p a t i e n t s o w n r b c i f t h e s a m p l e c o n t a i n s h b s a g . t h i s t e c h n o l o g y r e p r e s e n t s a n a d v a n c e w h i c h a l l o w s s i m p l e a n d r a p i d d e t e c t i o n o f s e r u m a n t i g e n s . k e y w o r d s : b i s p e c i fi c a n t i b o d y ; d i a b o d y ; m i n i b o d y ; a g g l u t i n a t i o n 引言 文献综述 双价双特异小分子抗体研究进展 自 从 1 9 7 5 年 k o h l e : 和 mi l s t e i n首次报道用杂交瘤技术制备小鼠单 克隆抗体以来，抗体的应用在生物学研究和临床诊断、预防、治疗等 方面显示出广阔的前景。一些抗体在临床已显示出非常好的效果，如 针对h e r - 2 / n e u 基因编码蛋白p 1 8 5 的抗体治疗乳腺癌， 可使h e r - 2 / n e u 高表达的病人病情缓解或治愈， 疗效显著，已被美国f d a批准上市。 目 前已有 9个抗体经 f d a批准上市，掀起了 抗体研究的热潮。 近年 来，基因工程抗体的研究，使人们可以通过基因重组技术获得各种新 型的小分子抗体，如f a b . f v . s c f v等。这些小分子抗体由于分子 量小、易穿透组织、制备简单等优势而备受关注。由基因工程构建的 小分子抗体多为单价，与单克隆抗体相比 ( 双价或多价) ，抗原结合 能力差，若能将它们制备为双价，可提高抗原结合能力;进一步制备 成双特异，可同时结合两种不同的抗原，则具有独特的性能和更为广 阔的临床应用价值。 一、 小分子抗体 抗体分子的抗原结合部位局限 在由 重链可变区 ( v ,i )和轻链可变 区 ( v , )组成的 f v区，从而可以构建分子量较小的具有抗原结合功 能的分子片段，称为小分子抗体。由于小分子抗体的分子量较小而具 有以下优点:( 1 )可以 在大肠杆菌等原核细胞表达体系表达，通过细 菌发酵生产，从而降低了生产成本。( 2 )因其分子量小，易于穿过血 管壁或组织屏障，进入病灶部位， 有利于对肿瘤等疾病的治疗。( 3 ) 不含有f c 段，可减少因广泛分布的f c 受体而带来的不利影响，如放 射免疫显像时的本底。( 4 )在体内半衰期较短，这虽在导向治疗中是 不利因素，但有利于体内毒性物质的清除和降低放射免疫显像的本 底。( 5 )易于进一步进行基因工程改造，如构建抗体融合蛋白等。 小分子 抗体包括: f a b , f v 、 单链抗体 ( s i n g le - c h a i n f v , s c f v ) , 单区抗体 ( s i n g l e - d o m a i n a b ) 和最小识别单位 ( m in i m a l r e c o g n i t i o n u n i t，mr u )等。这里重点介绍f v 和 s c f v . f v是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段 ( h u s t o n e t a 1 , 1 9 8 8 ; b i r d e t a l , 1 9 8 8 ; ) ，由v , 和v ,， 组成， 二者以 非共价键结 合在一 起，分子量仅为完整抗体的1 / 6 0 f v分子在大肠杆菌中的表达:分别 将vi 基因 和vh 5 端接上细菌 蛋白 的信号序列 ( s i g n a l s e q u e n c e )， 所表达的v l 和v h 片段在细菌 信号肤的引导下分泌到细菌质周腔 ( p e r i p l a s m ) ， 信号肤被信号肤酶 ( s i g n a l p i p t i d a s e ) 所裂解， 细菌质周腔内的环境类似真核细胞粗面内 质网，生成的v i. 和v , 片段可在质周腔内 完成立体折叠， 形成有抗原 结合功能的 f v ( s k e r r a , 1 9 8 8 ) ，即分泌型表达。己 证明有效的细菌信号 肤 来自 外 膜蛋白 a ( o u t e r m e m b r a n e p r o t e in a , o m p a ) 、 碱性 磷 酸 酶 ( a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ,p h o a ) 、 果 胶酸盐裂 解酶 ( p e c t a t e l y a s e ,p e l b ) 等。 f v 分 子中， v 。 和v 。 是由 非 共 价 键结 合 在 一 起的， 具 有解离 倾向 ， 有时极不稳定。不同 f v段的解离常数不同，一般在 1 0 5 - 1 0 8 m m o n 之间，因此欲获得稳定的 f v段，需设法将两个可变区连接起来。目 前有三种途径( g l o c k s h u b e r , 1 9 9 0 ) : 一是用戊二醛处理 f v段， 通过化学 方 法使v i 和v h 交联:二是通过对f v 段立体结构进行分析， 在v l 和 v ,。 立体结构的介面( in t e r f a c e ) 的骨架区，适当 部位通过点突变引入半 胧氨酸残基， 使 v l 和 v 。 之间形成链间二 硫键， ， 称为二硫键化的 f v ( d i s u l f i d e s t a b i l i z e d f v， d s f v ) ( g l o c k s h u b e r e t a 1 , 1 9 9 0 ;b r i n k m a n n e t a l , 1 9 9 3 b ) ;第三 种 方 法是 在d n a水 平 将v 。 和v h 基因 用 一段 寡 核昔 酸 链( l i n k e r ) 连接起来，使之表达成为一条单一的肤链，称为单链抗体 ( s i n g le c h a in f v ， s c f v ) ( h u s t o n e t a l , 1 9 8 8 ;b ir d e t a l , 1 9 8 8 ) .这 三 种方 法 所获得的f v 段都基本上保持了f v 段的特异性和亲和力，而增加了f v 的稳定性。第一种方法比较繁琐，采用的人很少。第二种方法目 前成 功的报道较多，效果也较好，由于没有 l i n k e r 的干扰，比 s c f v更好 地 保持了 亲本抗 体的 亲 和力， 且更 为 稳定 ( r e it e r e t a l, 1 9 9 5 ;w e b b e r e t a l , 1 9 9 5 ;b r i n k m a n n e t a l , 1 9 9 5 ;r e it e r e t a l , 1 9 9 4 ; r a j a g o p a l e t a 1 , 1 9 9 7 ) ，但在 二硫键位置的 选择具有一定难度， 半胧氨酸残基要在v , 和v t , 相邻的 介面 ( i n t e r f a c e ) ，且不干扰链内二硫键的形成，尽管通过多株 d s f v 的构建积累了一些经验，基本确定了 较为通用的导入二硫键的位置， 但在不同的抗体其最佳突变位置会有所差别。s c f v的制备由于开展较 早，方法较为成熟，得到了较为广泛的应用。本文将重点介绍s c f v o ( 一)s c f v的设计 首先是重 链和轻链可变区基因的确定，按照 k a b a t 等的定义，k 链可 变区 是从第1 到 第1 0 8 位氨基酸，x 链是1 一 1 0 7 位氨基酸， v h 包 括 1 - 1 1 3位氨基酸 ( k a b a t , 1 9 9 1 ) ，这是通过晶体结构分析确定的， v l 和 v , 的最后一个氨基酸残基涉及到骨架之间 氢键的 形成。 但在用 p c r构建 s c f v时，由于通用引物的设计及内切酶位点的引入，不可 避免地要造成可变区两端氨基酸序列的改变，多数情况下未发现对抗 体的特异性和亲和力带来影响，但有时可改变抗体的结合特性，尤且 是n端氨基酸的改 变 ( j i n g , 1 9 9 9 ) ， 尽管该 部位在第一 骨架区， 但它 们与c d r平面靠近， 有可能影响抗原结合部位的构象 ( p a l l a n , 1 9 9 4 ) . 因此在设计 s c f v时，应尽可能保持亲本抗体可变区序列的完整性 ( f o o t e , 1 9 9 2 ) 0 s c f v中的v 。 和v h 是由 接头 ( l i n k e r ) 连在一 起， v 。 和v 。 的 取 向可 有两种方 式， v , ; l i n k e r - v 。 或 v l l i n k e r - v h ， 两种方式都被证明 不 影响 s c f v的特异性和亲和力，但有报道在大肠杆菌分泌型表达时， 某些s c f v的分泌效率与v l 和v 。 的取向 有关， 尽管表达总量相同， v l - l in k e r - v 。 比v f; l in k e r - v 。 的 外 分 泌 量 要高2 0 倍。 s c f v分子中l i n k e r 的设计对保持亲本抗体的亲和力有重要影响， 它 应当 不 干 扰v l 和v 。 的 立 体折 叠， 并 且 不 对 抗原 结合 部 位 造成 妨 碍。 为不使 f v的立体结构变形，l i n k e : 的长度应不短于3 . 5 毫微米，由于 相邻肤键的距离约为0 . 3 8 毫微米，l i n k e r 应至少含有 1 0 个氨基酸残 基;l i n k e :也不宜过长，以免对抗原结合部位造成干扰。目 前文献中 报道的 l i n k e : 大多含有 1 4 - 1 5个氨基酸残基。l in k e : 缩短不利于链内 v , 和 v 。 形成立体结构， 但有实验证实短 l i n k e r 可 促进链间v , 和 v ,i 配对结合，h o l l i g e r 等将 l i n k e r 缩短为 1 0 - 。个氨基酸后，获得了双价 s c f v 分子， ( h o l l ig e r 1 9 9 3 ) ; k o r t t 将v和v l 基因首位相连，即l i n k e r 为 。时获得了三价的 s c f v ( t r i m e r ) ( k o r tt , 1 9 9 7 ) . l i n k e r 的氨基酸 组成应使 l i n k e r 具备亲水性，宜于折叠，不宜有过多的侧链，以减少 抗原性。用的最广泛的 l i n k e r是重复出现的四个甘氨酸和一个丝氨酸 ( g g g g s ) 3 ， 其中 甘氨酸是分子量最小， 侧链最短的 氨基酸，可增 加侧链的柔性，丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可增加 l i n k e r的亲水 性。 ( 二)s c f v的表达: 各种表达系统都可以用于表达s c f v ， 如: 原核酵母、 植物、昆虫、 哺乳类细胞等，但最常用的是大肠杆菌。从大肠杆菌表达 s c f v可有 两种方式:一种是表达为包涵体或非包涵体不可溶蛋白，这种表达方 式的产量较高，可达到细菌总蛋白的 5 % - 3 0 %，但需进行变性一 复性等 后续工作，使其完成正确的立体结构，恢复抗体活性。另一种是分泌 型表达，与 f v 相同，将细菌的信号序列与 s c f v的氨基端连接起来， 使 s c f v分子分泌到质周腔内，在质周腔完成二硫键的形成和肤链折 叠，成为有活性的单链抗体分子。这种方式可直接表达出有抗原结合 活性的抗体分子，但其产量比较低，一般实验室培养条件下，每升细 菌的产量在数毫克左右。 二，双价、双特异抗体: 双特异抗体可以结合两种不同的抗原，在临床具有广阔的应用前 景，如免疫诊断，在免疫组化或酶联免疫中可将酶方便的引入检测系 统，避免通过化学方法将酶与抗体偶联引起酶或抗体的失活或不均质 性;还可建立特殊的检测系统，如红细胞介导的检测体系 ( k e m p , 1 9 8 8 ) 。在免疫治疗中，双特异抗体可介导进行肿瘤细胞杀伤，介导 对病毒等微生物的清除等。由基因工程方法构建的小分子抗体均是单 价的，只有一个抗原结合位点，与天然抗体比 ( 至少是双价) ，抗原 结合能力差。如果将其构建成双价，可改善对抗原的结合特异性，有 文献报导，双价的形成可促进信号传导的起动，使原本没有抗肿瘤作 用的单抗显示出抑瘤效果 ( g h e t i e , 1 9 9 7 ) 。双价、双特异抗体有多 种制备方法，以前多用化学交联或杂交瘤方法，效果差。近年来多用 基因上 程方法。下面将各种方法进行简要综述。 c一 )单克隆双特异抗体制备方法 1 、化学交联法。 首先，分别分离纯化两种亲本单克隆抗体，采用还原剂使其解链， 获得单价抗体。之后采用异双功能交联剂，把两种具有不同抗原特异 性的单价抗体或其片段交联起来。此方法由于还原解链及交联等化学 反应，时有抗体失活，此外，其产物亦难于保证均质性。目前应用较 少。 2 、细胞工程方法 即通过细胞融合的方法，将分泌单克隆抗体 ( mc a b )的杂交瘤 与经免疫的脾细胞融合， 或使两种分泌不同mc a b 的杂交瘤彼此融合， 产生三体 瘤 ( tr io m a ) 或四 体瘤 ( q u a d r o m a ) 称为二次 杂交 瘤， 分 泌 双特异性抗体。这些方法较复杂，效果差，有时难以获得稳定表达的 融合后代，而且二次杂交瘤分泌上清轻重链随机组合，可能形成 1 0 种形式，多数为无双特异活性的分子，双特异抗体 ( b s a b )在所有抗 体 ( i g )形式中所占的比 例可由1 0 - 5 0 % 不等。 用单克隆抗体制备双特异抗体，由于产量低、纯化困难、又为鼠 源性全抗体，免疫源性强，可产生 h a ma 效应等，阻碍了双特异抗 体在临床的应用。 随着基因工程抗体的发展， 基于小分子抗体片段f v , s c f v ，可设计一种新的双特异抗体形式。这些形式由于可在原核系统 表达，可大量生产;可一步纯化:分子小易于穿透组织，利于疾病的 治疗;半衰期短，清除快，在放射治疗和放射免疫诊断中，可减小对 病人的影响;免疫原性小等优势，将在临床应用中发挥巨大的作用。 ( 二)基因工程小分子双价、双特异抗体 小分子抗体在狡基端设计半 胧氨酸残基，也可在体外经过化学交 联成为双价双特异抗体分子 ( 化学交联法) 。经典的体外组建双价、 双特异小分子抗体的方法是采用癌基因 f o s 及 j u n的亮氨酸拉链结构 ( l e u c i n e z i p p e r ) 。 亮氨酸拉链是一种蛋白 质分子相互作用的模式结 构，它是在一段肤链序列中每间隔七个氨基酸重复出现的四至五个亮 氨酸，这样在 a 螺旋结构中，每二圈就出现一个亮氨酸，这些亮氨酸 排列在 q 螺旋的一侧，两个蛋白质分子通过亮氨酸残基间疏水作用形 成的拉链式结构形成双体。原癌基因产物 f o s 和 j u n是典型的带有亮 氨酸拉链结构的蛋白质分子，它们的亮氨酸拉链结构被用来构建双价 双特异抗体分子。在两种 f d的c末端分别拼接 f o s 及 j u n的片段， 二者经原核表达后，分离纯化，在一定条件下即可通过亮氨酸拉链结 构匹配为双特异抗体。如: 在抗c d 3 和抗i l - 2 受体 ( i l - 2 r )的f a b 3 端分别加上 f o s 和 j u n的亮氨酸拉链序列，将两种 f a b段在体外混 合，可生成双特异 f a b ，具有介导 t细胞对表达有 i l - 2 r的细胞的杀 伤作用。 通过对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双价、双特 异抗体分子，较体外组建更为简便有效，如在 s c f v中引入半肤氨酸 使形成 二硫键 而成 为双价或双特异 ( c u m b e r 1 9 9 2 ;a d a n s 1 9 9 3 ;k ip r i y a n o v 1 9 9 4 ;m c c a r tn e y 1 9 9 5 ) .将s c f v用另 一条多 肤 链 直 接 连在一起形成双特异s c f v ( g r u b e r , 1 9 9 4 ; m a c k , 1 9 9 5 ;n e r i ; 1 9 9 5 ) . 小分 子双价双特异抗体的细胞内形成还可以利用可促进双聚化形成的区域 如 k 轻链恒定区 ( m c g r e g o r , 1 9 9 4 ;z h u , 2 0 0 0 ) ，亮氨酸拉链等 ( m a l l e n d e r , 1 9 9 4 ; k o s t e l n y , 1 9 9 2 ) 。目 前应用较多和效果较好的细胞 内 组建方法有d i a b o d y 和m i n i b o d y 方法，这里重点介绍。 1 、 d i a b o d y 方法 1 9 9 3年英国剑桥 wi n t e r教授的实验室首先报道用缩短单链抗体 l i n k e r 的方法构建了d i a b o d y ( h o l l i g e r , 1 9 9 3 ) ， 其基本原理是:单链抗体 是由 重链可变区v和轻链可变区v , 由多 肤链l i n k e r 连在一起构成的， 为使v , 和v : 能 顺利地组合在一起形成有功能的f v 结构， 连接肤的 长度不得少于 1 0 个氨基酸，一般为 1 4 - 1 5 个氨基酸。将连接肤缩短不 利于同 一肤链内v 。 和v : 形成立 体结 构， 则 促进不同 分子间v和v , 配对结合，从而形成由两个抗体片段配对组成的双体抗体，即 d i a b o d y 。若两个片段相同，则形成具有两个相同抗原结合位点的双 价d i a b o d y ; 若两个片段分别含有抗两种抗原的轻重链可变区 基因( 交 叉配对) ，则形成可结合两种不同 抗原的双特异d i a b o d y o d i a b o d y 的设 计及构建: ( i ) l i n k e r 的长度及其效果: h o l l i g e r尝试将l i n k e r 设计为1 5 , 5 和。 个氨基酸( h o l l i g e r , 1 9 9 3 ) , 结果显示， l i n k e r 为1 5 和5 个氨基酸残基时，d i a b o d y 的亲和力与母 本 一 样，l in k e : 为。 时，d ia b o d y 有 较缓 慢的 解离 特性， 改 善了 对 抗 原的亲合力。立体结构显小，当l i n k e r 为 1 5 时，抗体的抗原结合位点 与亲本一样，缩短 l i n k e r ，则两个抗原的结合位点在相反的方向，与 其它免疫球蛋白不同，强迫链间配对可导致抗原结合位点发生结构变 化。在 d i a b o d y分泌上清中同时存在着异源二聚体 ( h e t e r o d i m e r s ) , 同 源一聚体 ( h o m o d i m e r s ) 和单体( m o n o m e r s ) . l i n k e r 较长， 则d i a b o d y 柔韧性较好， 由于链内配对， 分泌上清中产生同源单体比例较多; l i n k e r 短则d i a b o d y柔韧性差， 但可促使有功能的同 源二聚体形成。 有人将 v 。 和v , 首 尾相连， ( 即l i n k e r 为0 ) ， 构建双 特异 抗体， 观察可形 成 三体结构 ( t r i m e r ) ( l a w r e n c e , 1 9 9 8 ) 。也有实验显示 0 l i n k e r可导致 d i a b o d y无活性( h e l f r i c h , 1 9 9 8 ) o a t w e l l 研究 1 - 4个氨基酸的l i n k e r 显 示， 3 和4 个氨基酸的l i n k e r 形成d i a b o d y ，具有两个抗原结合位点; 1 和2 个氨基酸的l i n k e r 形成t r i a b o d y ，有二个抗原结合位点 ( a t w e l l , 1 9 9 9 ) . wh it l o w用 1 2 个氨基酸的l i n k e r 产生了 双特异s c f v ( 1 9 9 4 ) 0 d e s p l a n c q 用0 , 5 , 1 0 个 氨基 酸 l i n k e r ( d e s p l a n c q ; 1 9 9 4 ) ,a l f t h a n 则设 i f - ( 2 , 6 , 1 1 个氨基酸l i n k e r ( a l ft h a n , 1 9 9 5 ) ， 均报导 这些结构形成 了二聚体和多聚体。综 卜 所述，l i n k e r 为3 - 1 2时，多形成双体，大于 1 2 时，结构类似 s c f v ，小于3时易形成三体或多聚体。目前以l i n k e r 为5 - 6 个氨基酸的 d i a b o d y 较多。 ( 2 ) d i a b o d y 的 构建及改 建: 用短l i n k e r 连接v 和 v , ，大肠杆菌中分泌表达，则可产生具有 两个抗原结合位点的双价分子，即双价 d i a b o d y 。 用短 l i n k e : 将 一 个 抗体的v 。 基因 与另 一 个 抗 体的v , 基因 相 连， 使v 。 和v : 交叉 配对 形 成v ,冰 - v , b和v h b - v ,a的 结 构， 在同 一 细 胞中 共 表 达， 可产 生 在同 一 分子上，具有两种抗原结合位点的双价分子，即双特异d i a b o d y o 为了 提高d i a b o d y 分泌上清中功能性异源二聚体形成的比例，减少 无功能的杂合单体，并稳定二聚体结构，w i n t e r的实验室在 d i a b o d y 基础上加入了 二硫键结构，在大肠杆菌和酵母中分泌表达，提高了 d i a b o d y的稳定性和功能性异源二聚体的比 例， 尤其在酵母表达效果 更 好 ( f it z g e r a ld , 1 9 9 7 ) . c a r t e r 的 实 验室 尝 试 通 过v 。 和v 。 界 面改 造促进 d ia b o d y二聚 体的 形 成， 他们 将一 个抗 p , g 5 h e r 2 / 抗 c d , 的 d i a b o d y ， 在抗p 1 8 5 h e r 2 的v 。 和v ,. 的界面引 入半肤氨酸 残基， 使形成二硫键结构， 异源二聚体的比 例由7 2 % 提高到 %; 在 v , 和v , 介面， 通过基因突变方式，形成 “k n o b - i n t o - h o l e ”的结构，也 使异源二聚体的形成比 例得到了一定的提高( z h u , 1 9 9 7 ) . ( 3 ) d ia b o d y 优越性 及其 应 用 优越性: 制备简单， 可直 接大 肠杆菌 表达， 而且 产量高 ( z h u , 1 9 9 6 ) , 易纯化;无f c 片段，可消除由f c 带来的不利影响，如旁杀伤效应， 细胞因 子释放综合征等; d i a b o d y 的 分子 量与f a b 一样， 为i g g的1 / 3 , 易于穿透组织，易从血清中清除:分子量比 s c f v大一倍，在组织中 滞留时间及血清半衰期相对较长，在一些临床应用中具有其特殊优 势。另 外d i a b o d y 的短l i n k e r 与s c f v 的长l i n k e r 相比， 具有较强的抗 蛋白 酶消化作用。 近年 些 d i a b o d y抗体的 研究 及应用，已 显示出其 广阔的应用前景。 应用:带放射性或带毒素的 d i a b o d y在治疗肿瘤或免疫显像应用 中 ， 由 于 清 除 快， 较 单 抗 优 越。 一 端 抗 补 体c ,。 的 双 特 异d ia b o d y ， 可 介导补体激活( k n n t e r m a n n , 1 9 9 7 ) 。 一端抗酶的双特异 d i a b o d y ，则可 用于免疫检测( k n n t e r m a n n , 1 9 9 7 ) 。一端抗红细胞的双特异 d i a b o d y可 建立对血中抗原的快速检测系统。 双特异 d i a b o d y针对肿瘤的治疗报 道较多 ( 表 1 ) 0 表1 ， 抗肿瘤双特异d i a b o d y 双特异d i a b o d y l y s o z y m e / p h o x b c l - 1 / c d3 he r - 2 / c d3 f l u - na/ rbc- g1 c a l y s o z y m e / c 1 q c e a/ b e t a - ga l ce a/ mu - l am ce a/ cd3 i l 6 / cd3 e gp 2 / c d3 cd1 9 / cd3 c d 3 / a n t i - n i t r o p h e n y l 参考文献 h o l l i g e r 1 9 9 3 h o l l i g e r 1 9 9 6 z h u 1 9 9 6 at we l l 1 9 9 6 ko n t e r ma n n 1 9 9 7 a ko n t e r ma n n 1 9 9 7 b h o l l i g e r 1 9 9 7 f i t z g e r a l d 1 9 9 7 ; h o l l i g e r 1 9 9 9 kr e b s 1 9 9 8 he l f r i c h 1 9 9 8 k i p r i y a n o v 1 9 9 8 ma n z k e 1 9 9 9 总之， d i a b o d y是一种形成双价、双 特异小分子抗体的有效方法。 d i a b o d y基因可来自 杂交瘤，也可来自 噬菌体显示技术的可变区基因 库，在医学和产业中它将成为双价、 双特异抗体片段的有效来源之一。 2 , m i n i b o d y 方法 在小分子抗体上设计能促进双体化作用的结构域 ( d i m e r i z a t i o n d o m a i n ) 也是形成双体的方法。天然抗体分子中， 两个重链 c h , 区有 密切的相互作用，形成紧密的球状结构。研究显示，c h , 区有明显的 促进抗体双体化作用 ( j o h n 1 9 9 6 ) 。 将c h : 融合在s c f v 梭基端， 通过 c h , 的双聚体作用，所表达的融合蛋白可 分泌到质周腔并形成双体， 称 m i n i b o d y o ( i ) 、双价及双特异m i n i b o d y 将s c f v 与 c h 3 融合， 形成的双价分子， 具有两个抗原结合位点， 称为) x 价m i n ib o d y 。 将两种针对不同 抗原的s c f v 与c h 3 融合， 在同 一细胞中共表达或转染，形成的双体分子，可以结合两种抗原，称为 双特异m i n i b o d y。 有人用s c f v 与c h 3 设计了 三个形式的m in i b o d y ，即s c f v - c h 3， v l d s v ,a c h 3和 短li n k e r s c f v， 结 果 三种 形 式 均 成功 地在真 核 细胞 表 达并形成双体结构 ( 分子量 8 0 k d a左右) ，而且抗体的特异性与亲本 抗体一致。相对亲和力以第一种形式最好， l i n k e r中二硫键的加入可 稳定二聚体结构，但二硫键和短 l i n k e r降低了两个结合位点的可流动 性，降低了 抗体的亲和力 ( e r q i u , 1 9 9 7 ) a n n a 的实验室用抗c e a单链抗体设计了 两种形式的m i n i b o d y， 开始尝试在原核系统表达，结果活性较 s c f v下降 1 0倍 。真核系统 表达活性好 、特异性好、肿瘤摄取率高，肿瘤滞留及血清清除比， 肿瘤组织与正常组织摄取比均得到比较满意的结果。 在双 特异m i n i b o d y 分泌上 清中， 异 源二 聚体，同 源二聚体比 例各 占 5 0 %，为促进有双特异功能的异源二聚体的形成，可通过对 c h 3 界面进行改造。经基因突变，使两个 c h 3界面形成柞臼结构。在 c h 3 - c h 3 界面上包括 1 6 个氨基酸残基，分布在四个反平行的0 片层， 埋入 1 0 9 0 入 。突变的设计应位于中心的两个片层。柞臼结构 ( k n o b - in t o - h o l e )的设计原理:经基因突变，在一个 c h 3界面用分子侧链大 的氨基酸，代替分子侧链小的氨基酸形成柞状结构 ( k n o b ) ，在另一 个 c h 3界面用分子侧链小的氨基酸，代替分子侧链大的氨基酸形成 臼状结构 ( h o l e ) ，分别将k n o b 和h o l e 连于两个不同的抗体基因末端， 分泌表达后 k n o b和 h o l e配对，将两个抗体片段桥连在一起，形成可 结合两种抗原的柞臼 结构 ( k n o b - i n t o - h o l e ) 的 双特异 m i n i b o d y 。 在柞 臼结构 ( k n o b - i n t o - h o l e )的基础上，引入一个二硫键 ( s - s )， 形成 k n o b - i n t o - h o l e 加s - s 的结构， 进一步稳定 双特异m i n i b o d y o c a r t e r 的 实验室于 1 9 9 6 年发文报道设计柞臼结构 ( k n o b - i n t o - h o l e ) ，在真核细 胞中 表达了 抗c d 3 / c d 4 - i g g双功能分子 ( r i d g w a y , 1 9 9 6 ) 0 1 9 9 8 年又 报 导成功地选择到最佳的柞臼结构模式即:在 c h 3区用分子侧链大的 色氨酸 ( w)代替 3 6 6位苏氨酸 ( t )形成柞状结构 “ k n o b ，在另一 个c h 3 分子上用分子侧链小的丝氨酸( s ) 、 丙氨酸( a ) 和撷氨酸( v ) 分别代替 3 6 6 t( 苏氨酸) 、3 6 8 l( 亮氨酸)和 4 0 7 y ( 酪氨酸)形成 臼状结构 “ h o l e ，并在此基础上引入一个二硫键的结构，进一步提高 了 异源二聚体形成比 例 ( 即双功能分子的比例) ( m e r c h a n t , 1 9 9 8 ) 。其 它实验