（动物遗传育种与繁殖专业论文）四川白鹅和朗德鹅肝细胞间差异表达基因的筛选及鉴定.pdf

摘要 抑制消减杂交技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z i t i o n ，s s h ) 是以抑伟i j p c r 为基础的一种高效寻找差异表达基因的新方法。本研究应用s s h 方法筛选四川白鹅和 朗德鹅肝细胞间的差异表达基因，并综合运用生物信息学方法对e s t 序列进行筛选、 鉴定，由此获得品种间差异相关e s t 信息。取得了以下主要实验结论： ( 1 ) 利用改进“s e g l e n 两步胶原酶灌注”法成功分离四川白鹅和朗德鹅肝细 胞。经m t t 比色法检测，在第1 2 天细胞活性增加缓慢，在2 - - 3 天出现了一定的下降 趋势，但在第3 - - 5 天细胞活性迅速增加，之后细胞活性再次降低，与理论“s 型生 长曲线基本符合。 ( 2 ) 首次应用抑制性消减杂交技术成功构建了四川白鹅与朗德鹅肝细胞间正反 向差异表达c d n a 文库，共挑选出了3 8 4 0 个单克隆菌落，插入片段主要分布在 2 5 0 7 5 0 b p 之间，呈随机分布，表明文库克隆的插入片断大小与预期的结果相符。s s h 1 、 s s h - 2 文库的有效阳性率分别达到了9 3 和9 1 。 ( 3 ) 应用斑点杂交技术从正反向c d n a 消减文库中筛选差异表达的克隆，部分 克隆经检测后，获得了6 5 个在细胞中表达量明显上调的克隆，测序后得到个5 4 个质 量满意的差异e s t 。 ( 4 ) 通过b l a s t n 比对，在5 4 个e s t 中共获得了5 0 个已知基因、2 个已知的 e s t 和2 个全新的e s t 。在这5 4 个e s t 序列中，已知基因占9 2 6 ；已知e s t 占 3 7 ；全新占e s t 为3 7 。所得到的已知基因按照基因功能初步分为信号转导与细 胞间通信、细胞结构与运动、物质转运、细胞凋亡、细胞与机体防御、翻译与表达调 控、代谢及其它共8 类，其中参与信号转导细胞间通信和细胞结构的两类基因所占 比例分别为1 6 和2 8 ，翻译与表达调控的基因占1 4 ，其它功能方面基因所占比 例较低。 ( 5 ) 肌动蛋白( a c t i nr p r o t e i n ，a c t b ) 、结缔组织生长因子( c 粥f ) 、长链脂肪 酸延伸酶基因( e l o v l ) 、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶( s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e ) 、蛋 白翻译起始因子( g 祝) 等基因在鹅不同性状的表达调控中可能发挥重要作用，有关 这些基因的具体功能、它们的表达调控及其信号通路等还需要进一步研究。 关键词：四川白鹅；朗德鹅；肝脏细胞；抑制性消减杂交：差异表达基因；斑点杂交 s c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t i a l ye x p r e s s e dg e n e s d u r i n gh e p a t o c y t e so fl a n d e sg e e s ea n ds i c h u a nw h i t eg e e s e z h a in i n g - f e n g ( a n i m a lg e n e t i c s ，b r e e d i n ga n d r e p r o d u c t i o n ) d i r e c t e db yp r o f w a n gj i w e n a b s t r a c t s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z i t i o ni san e wa n de f f e c t i v em e t h o dt os e a r c h d i f f e r e n t i a l ye x p r e s s e dg e n e s i nt h i ss t u d y , t h eh e p a t o c y t e so fl a n d e sg e e s ea n ds i c h u a n w h i t eg e e s ew e r ei s o l a t e da sm a t e r i a l st os e a r c hd i f f e r e n t i a l ye x p r e s s e dg e n e sb e t w e e nt h e t w ob r e e d s t h ei n f o r m a t i o na b o u td i f f e r e n t i a l ye x p r e s s e de s tb e t w e e nt h et w ob r e e d sw a s g o tb ys c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o ne s ts e q u e n c em a k i n gu s eo fb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s ，t h e r e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： ( 1 ) t h i ss t u d ys u c c e e dt o t os e g r e g a t eh e p a t o c y t e so fs i c h u a nw h i t eg e e s ea n d l a n d e sg e e s eu s i n g “s e g l e nt w os t e pc o l l a g e n a s ed a b b l i n g ”a n db ym t t d e t e c t i n gc e l l c y t o a c t i v e ，t h er e s u l ti n d i c a t e d ，t h ec e l lc y t o a c t i v er a i s e dv e r ys l o w l yo nt h ef i r s tt os e c o n d d a y , a n di tb e g i nt od e s c e n do nt h es e c o n dt ot h et h i r dd a y , b u tt h ec e l lc y t o a c t i v er a i s e dv e r y q u i c k l yo nt h et h i r dt ot h ef i f t hd a y l a t e ri ta g a i nb e g a nt od e p r e s s c h a n g ef o rc e l lc y t o a c t i v e i ss a m ea st h et y p i c a l “s ”g r o w t hc u r v e ( 2 ) i nt h i s d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de d n al i b r a r yw e r ef i r s tc o n s t r u a e du s i n g s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nl a n d e sg e e s ea n ds i c h u a nw h i t eg e e s e ，a n d 2 6 8 8p o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r ei n s e r t e df r a g m e n t s o f2 5 0 - 7 5 0b pi nt h er a n d o m l ys e l e c t e dp o s i t i v ec l o n e s ，w h i c hi n d i c a t e dt h es i z e so f i n s e r t e df r a g m e n t sf o rt h el i b r a r i e sc l o n e sm a t c h e dw i t he x p e c t e dc o n s e q u e n c e t h eu t i l i t y m a s c u l i n er a t ef o rs s h 1l i b r a r ya n ds s h 一2l i b r a r yr e a c h e d9 3 a n d9 1 ( 3 ) d i f f e r e n t i a l l ys c r e e n i n gw a sp e r f o r m e dt os c r e e l ld i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s u s i n gd i gd o t - b l o t t i n gm e t h o d a f t e rp a r to fc l o n e sw e r ed e t e c t e d ，s i x t yf i v es t r o n gs i g n a l s c l o n e sw e r ei s o l a t e da n ds e q u e n c e dr e s u l t i n gi nf i f t yf o u rs e q u e n c e s 。 ( 4 ) as e a r c hf o rs e q u e n c eh o m o l o g yi nt h eg e n b a n kn ra n de s td a t a b a s eb y b l a s t nr e v e a l e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no fe s tc l u s t e r sf o rh i 曲h o m o l o g yg e n e s ，h i g i l h o m o l o g ye s t sa n dn o v e le s t sw e r e5 0 ，2a n d2 ，r e s p e c t i v e l y , i n5 4e s t s t h eh i g h h o m o l o g yg e n e sw a sg r o u p e di n t o8c l u s t e r sb a s e do nt h eb e s tk n o w nf u n c t i o no ft h e r e p r o t e i np r o d u c t s ：s i g n a l i n g t r a n s d u c t i o n c o m m u n i c a t i o n ， c e l l s t r u c t u r e m o b i l i t y , t r a n s p o r t e r s ，a p o p t o s i s ，m e t a b o l i s m ，t r a n s l a t i o n e x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ，c e l l b o d yd e f e n c e a n do n ec l u s t e rt h a tf u n c t i o ni su n k n o w no rw i t h o u ta no n t o l o g i c a lt h e m e o ft h et o t a l ，t h e t w ot y p e g e n e so fs p e c i f i cg r a v i t y a r ev e r y l a r g e w h i c hi s p a r t i c i p a t es i g n a l i n g t r a n s d u c t i o n c o m m u n i c a t i o na n dc e l ls t r u c t u r e m o b i l i t y , a n dt h e yw e r e16 a n d2 8 ，a n d t h er a t i oo ft r a n s l a t i o n e x p r e s s i o nr e g u l a t i o ng e n e sw a s14 ( 5 ) r o l e so fd i f f e r e n tc h a r a c t e rf e a t u r eo f p a r t i a ld i f e r e n t i a l l ye x p r e e s e dg e n e si nt w o g e e s eb r e e d sw e r ep r e s u m e db a s e do nr e f e r e n c e sa n do u rr e s e a r c hr e s u l t s a c t , g s t , c t g ee l ov l ，s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e ，a n de l f lw e r ec o n s i d e r e dp l a y i n ga ni m p o r t a n t r o l ei nd i f f e r e n tc h a r a c t e rf e a f i a r ei nd i f f e r e n t g e e s e ，b u t i t s s p e c i f i cf u n c t i o n ， t r a n s l a t i o n e x p r e s s i o nr e g u l a t i o na n ds i g n a lp a t h w a yf o r t h et w og e e s eb r e e d sn e e dt ob e r e s e a r c h e df u r t h e r l y k e yw o r d s ：l a n d e sg e e s e ，s i c h u a nw h i t eg e e s e ，h e p a t i cc e l l s ，s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ( s s h ) ，d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e ，s p o th y b r i d i z a t i o n 缩略词表 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 翟乎虱 删孑年月c j 7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 翟 旁虱 导师签名：奶侈d 0 8 年g 具。- e t 硼年6 月矽日 月l j 吾 我国养鹅历史悠久，是世界上养鹅最多的国家，饲养量占世界总量的9 0 左右， 品种资源丰富，大、中、小型地方鹅品种或培育品种达4 0 多个【l 】。但是，由于不同鹅 种来源、长期所处的地理环境以及所接受的饲养方式和选育性状重点的不同，形成了 各自的种质特性，并在性状表现方面存在较大的差异。中国地方鹅种具有对周围环境 的适应性强、抗病性强、繁殖力高、肉质好等优点，欧洲鹅种具有生长速度快、产肝 性能高等特点，朗德鹅尤以产肥肝性能高而著名。本研究主要是选用产肝性能高的朗 德鹅和繁殖性能高、产肝性能中等的四川白鹅为试验材料，通过体外培养肝细胞提取 总r n a ，运用抑制消减杂交( s s h ) 技术构建了两品种鹅肝细胞的正反向消减c d n a 文库，然后分别分离特异表达的差异e s t ，并采用斑点杂交方法对其差异的真实性进 行验证，从而了解这两种鹅在肝脏组织中基因差异表达的概况。通过这些研究，一方 面可能找到有价值的基因作为不同品种鹅产肝性状的相关基因，另一方面还可以从基 因表达水平上揭示不同品种鹅性状差异的遗传基础，探讨不同品种鹅重要性状表现差 异的分子机理，并对加快新品种或品系的培育提供理论依据。 1 文献综述 1 1 不同鹅种的主要生产性能差异 1 1 1 产肝性能 品种是影响鹅肥肝生产的关键因素，不同品种的产肝性能差异较大。国内不少学 者对不同鹅种进行肥肝性能比较试验结果表明，一般是大型鹅种产肝性能好，中型鹅 次之，小型鹅种较差。产于欧洲的朗德鹅是目前世界公认的肥肝专用鹅种，具有早期 生长发育快，肥肝质量好，肝重可达7 0 0 9 0 0 9 ，料肝比可达2 3 8 ：l 2 1 。我国鹅种以狮 头鹅、溆浦鹅肥肝性能最为突出，毛战生 3 1 研究结果表明，湖南溆浦鹅填饲4 周平均 肝重6 0 0 3 克，最大肝重9 2 9 克，绝大部分肥肝在5 0 0 克以上( 占8 5 9 6 ) 。狮头鹅 是我国唯一的大型鹅种，平均肝重6 0 0 克，最大肥肝可达1 4 0 0 克，肥肝占屠体重达 1 3 ，料肝比为4 0 ：1 。四川白鹅具有适应性好、体形较大、繁殖力强等特点，经填肥， 肥肝平均重3 4 4 克，最大5 2 0 克，料肝比4 2 ：1 。 鹅种的产肝性能差异与一些相关调控基因有关。脂蛋白脂酶( 1 i p o p r o t e i nl i p a s e ， l p l ) 催化血浆中由极低密度脂蛋白( v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ，v l d l ) 携带 的甘油三酯( t g ) 水解，生成的游离脂肪酸( f f a ) 对于脂肪组织的脂肪贮存有重要 作用【4 】，而未被l p l 水解t g 返回肝脏，促进肝脂肪变性。许恒勇等 5 】的研究结果表明， 填饲后四川白鹅和朗德鹅的血浆上凡的活性、血浆中的v l d l 和t g 的浓度、皮脂重、 腹脂重、肝脏重和肝脏脂肪含量以及使皮脂和腹脂表达量均显著或极显著的上升，填 饲后朗德鹅肝重量与三凡活性呈负相关( 严一o 3 7 ，p 0 0 5 ) ，采食量的高低以及食物 脂肪含量的高低均是诱导组织l p l m r n a 表达差异的因素。卓伟华等【6 】发现饲喂含 1 0 猪油的高脂日粮，四川白鹅和朗德鹅皮脂、腹脂、胸肌和腿肌的l p l 表达丰度极 显著地低于对照组( p o 0 5 ) ，且血浆中的l p l 活性显著下降( 尸 0 0 5 ) 外，对其它屠 体性状则有显著( p o 0 5 ) 和极显著影响( 尸ljq口 h口一口coqpcou 寸co_oiq一砖iilo们od一i f1一一日比 t1一一时o _ i c i a 芑j d勺苗一aj-ujbt1三oeo p鲁一一吕1st1=母酗j=时。 时e苫(1苫山q一 篇蛊3 d t l u一甍一四_订u一 它=厶丈一。厶。器i盘趸皇套ocil商唇q_时厶o工4_i，(ullo口 j i i m ：一一对。一j o 芑盘工q仨)i匣口衄一rbeo_jbiiglsji眦t1一一日o q o 暑 皇o o 一 趸昌 ioco口母e9li qjoi呱一o时c对ho_i盘=舀_q暑dn立98瓮暑器一o o o q曼aj量5 d吾-o昌nco口 (2n口一寸uo广iv n o总后辱善一澄c对扫旦急ii一j=爵比j=母o o们日_u：口o-i u 葛 一o n寸n寸n n o【价on蔓z口non寸至)(hn寸苫)(n n 【n 岔一n一一oo至)( a 一寸 a n nonn寸-乏)( n n o n n岔n卜一寸_2)( 一c寸n6一9 oilioo甍u；iocjbidtlo _ 装 i 岔 寸一凸。寸 8 n o o iso苞。含 意u 急ilelsj一一鑫11一rbo n 口岭寸 nn=、芝)( n 一济 ，( d v 参召口o p i 趟套罂赌匿 p o q ) ( o u o q 覃 衄 。8 u 露霎 q 口q - o iio暑o oii口ojoogo= 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g l u t a m i n a s e3 ( l o c 4 1 9 2 1 5 ) 5 p r e d i c t e d ：g a l l u sg a l l u st h r o m b o s p o n d i nl ( t h b s1 ) 。m r n a l a n a sp l a t y r h y n c h o sb e t a a c t i n( a c t b )m r n a p a r t i a lc d s l p r e d i c t e d ：g a l l u sg a l l u ss i m i l a rt os m a l le d r k r i c hf a c t o rl ，s h o r t， ( l o c 7 6 9 4 3 4 ) m r n as e i u l b c o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r h y p e r t r o p h i cc t g f l g a l l u sg a l l u sf e r r i t i n ，h e a v yp o l y p e p t i d e1 ( f t hi ) ，m r n a l g a l l u sg a l l u sm o n o c y t et om a c r o p h a g ed i f f e r e n t i a t i o n a s s o c i a t e d ( m m d ) ， 1 m r n a 1 c y s t e i n ea n dg l y c i n e r i c hp r o t e i n2 l s i m i l a rt or p s l 6p r o t e i n( l o c 4 1 7 8 7 1 ) l g a l l u sg a l l u sp r o t e a s o r n e ( p r o s o m e ，m a c r o p a i n ) s u b u n i t ，a l p h at y p e ，2 1 ( p s m a 2 ) ，m r n a 细胞凋亡 g a l l u sg a l l u sc d 8 0m o l e c u l e ( c d 8 0 ) ，m r n a l s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s et u r n a l 细胞机体防御g a l l u sg a l l u ss i m i l a rt ol s m 3p r o t e i n ( l o c 4 1 6 0 4 0 ) ， 2 p r e d i c t e d ：g a l l u s g a l l u s s i m i l a r t o l y s m ，p u t a t i v e， p e p t i d o g l y c a n b i n d i n g ，d o m a i nc o n t a i n i n g2 ( l o c 7 6 9 4 8 8 ) ，m r n a a d p r i b o s y l a t i o nf a c t o rg t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n ( a r f g a p 2 ) l a n s e ra n s e ru b i q u i t i nci im r n a ，c o m p l e t ec d s l 物质转运 g a l l u s g a l l u se l o v lf a m i l ym e m b e r6 ，e l o n g a t i o n no fl o n g c h a i n 1 f a t t y a c i d s 1 p r e d i c t e d ：g a l l u sg a l l u ss i m i l a rt oh e c td o m a i na n dr l d5 ；c y c l i n - e 1 b i