（药物化学专业论文）κ卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究.pdf

k 一卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法研究 摘要 k 一卡拉胶是( k c ) 由0 一( 1 3 ) 一d 一半乳糖一4 一硫酸基和a 一( 1 4 ) 一3 ，6 一内醚 一d 一半乳糖连接而成的一种海洋酸性寡糖，它有着多种生物活性，如：抗凝、抗 病毒、增强免疫功能、抗肿瘤及抗炎活性等。它也广泛应用于保健食品方面，同 时，它在结构与带电性等方面与内源性寡糖有很多相似之处，所以它有着很多潜 在的活性应用价值。 高效毛细管电泳是近2 0 年发展起来的一种新的分离技术，它以快速、高效、 高灵敏、所需样品少、低实验消耗等优点被广泛应用各个领域。八十年代末开始 应用于糖类物质的分析，并获得了快速的发展。本论文首次利用高效毛细管区带 电泳模式一紫外检测( c z e u v ) ，进行了k 一卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分离分 析方法的研究。 首先将k 一卡拉胶酸降解并且用b i o g e l p 6 柱纯化，由于降解产物没有紫外 吸收特征，也没有荧光发光基团，对其进行分析检测比较困难。利用柱前衍生技 术，与衍生试剂8 一氨基萘基一1 ，3 ，6 一三磺酸 ( 8 - a m i n o n a p h t h a l e n e 一1 ，3 ，6 一t r is u l f o n i c a c i do i s o d i u ms a l t ，a n t s ) 反应， 引入荧光基团。对衍生条件和电泳分析条件，包括衍生溶液浓度、p h 值、反应 时间、温度及缓冲液浓度、p h 值、工作电压、分离温度和缓冲液添加剂对寡糖 一a n t s 衍生物分离的影响，实现了k 一卡拉胶寡糖的高效分离，确定了标准曲线及 线性范围。并将该方法应用于k 一卡拉胶酸水解过程中产生的寡糖的分析，获得了 良好的分离分析效果。 本文较为系统的研究了k 一卡拉胶低聚糖的毛细管电泳分离分析方法。这些 方法也可借鉴于研究其它的海洋酸性多糖，对酸性寡糖毛细管电泳分离分析方法 的研究有着重要的意义。 关键词：高效毛细管电泳；k 一卡拉胶寡糖；8 一氨基萘基一1 ，3 ，6 一三磺酸；衍生化 a n a l y s iso fk c a rr a g e e n a no ii g o s a c c h a r i d e sb yh i g h p e r f o r m a n c ec a pii ia r yeie c t r o p h o r e sis a b s t r a c t k - c a r r a g e e n a n ( k c ) i sak i n d o fm a r i n ea c i d i c o l i g o s a c c h a r i d e sm a d eo f p 一( 14 3 ) - d g a l a c t o p y r a n o s e ( g a l p ) - 4 一o - s u l f og r o u pa n d 值一( 1 _ 4 ) 一3 ，6 一a n h y d r o d g a l a c t 。p y r a i l 。s e ( a n g a ，i th a sm a n yb i o - a c t i v i t i e 0 7 基a i l t i c o a g u l a n t ，a n t i v i m s ， i m p r o v i n go fi m m u n i t y , a n t i t u m o ra n da n t i i n f l a m m a t i o n a l s ok - c a r r a g e e n a nw a s a p p l i e de x t e n s i v e l yi nh e a l t hf o o d a tt h es a m et i m e ，t h e r ea r es o m ec o m p a r a b i l i t i si n s t r u c t u r ea n dt h ep r o p e r t i e so fe l e c t r i f i c a t i o nb e t w e e nk - c a r r a g e e n a na n de n d o g e n o u s s u b s t a n c e s ，s oi th a v em a n yp o t e n t i a la c t i v i t i e sa n da p p l i e dv a l u e h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c 勘i san e wa n a l y t i c a lt e c h n o l o g y w h i c hh a sb e e nd e v e l o p e di nt h el a s tt w e n t yy e a r s i th a sb e e na p p l i e di nm a n ya r e a s f o ri t sc e l e r i t y , e f f i c i e n c y , h i 曲s e n s i t i v i t y ，l o we x p e r i m e n t a lc o n s u m p t i o na n dl e s s s a m p l i n ga m o u n t - h p c eh a sb e g u nt ob e 鲤a l y z _ , es a c c h a r i d e sa tt h ee n do ft h e 艘ja n d 映d e v e l o p e d v e r y f a s t - i nt h i s p a p e r , o l i g o s a c c h a r i d e s o f k - c a r r a g e e n a nh a v eb e e ns e p a r a t e da n da n a l y z e db yc z e - u vo fh i g l lp e r f o r m a n c e c a p i l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) t h ek c a r r a g e e n a nw a s d e g r a d e dt h r o u 曲a c i dh y d r o l y s i s a n dp u r i f i e d b y b i n - g e l p 6 a c c o r d i n g t ot h e i rm o l e c u l a r w e i g h t a t f i r s t k c a r r a g e e n a n o l i g o s a c c h a r i d e s d e g r a d e d b y a c i d o 箩 d i r i v a t i z e d w i t h 8 - a m i n o n a p h t h a l e n e 一1 ，3 , 6 一t r i s u l f o n i c a c i dd i s o d i u m s a l t ( a n t s ) b y r e d u c t i v e a m i n a t i o nu s i n gc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sb yp r e - c o l u m nd e f i v a t i z a t i o n ，t h e i r a n t sd e r i v a t i v e sa r es e p a r a t e da n dd e t e c t e db yc a p i l l a r yz o n ee l e c l r o p h o r e s i sw i t h u v t h ed e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fa n t s ，p h v a l u eo f d e r i v a t i z a t i o nb u f f e r , r e a c t i o nt i m e ，t e m p e r a t u r ea n ds e p a r a t i o nc o n d i t i o n sa r e i n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h ea n t s o l i g o s a c c h a r i d e sw e r es u c c e s s f u l l ys e p a r a t e d w i n t h i n15r a i nb yn s eo fa c i d i c ( p h2 8 ) s o d i u mc i t r a t eb u f f e rc o n t a i n i n g15 r a mt e a a se l e c t r o l y t e ，一2 5 k vf o rt h es e p a r a t i o nv o l t a g ea n di nt h ea l k a l i n eb o r a t e b u f f e r ( p h 。1 0 2 5 ) r e s p e c t i v e l y t h ec em e t h o di su s e dt om o n i t o rt h eo l i g o s a c c h a r i d e s p r o d u c e db ya c i d i ch y d r o l y s i so fk - c a r r a g e e n a n i nt h e s es e p a r a t i o nc o n d i t i o n s k - c a r r a g e e n a no l i g o s a c c h a r i d e sa r es u c c e s s f u l l ys e p a r a t e d t h em e t h o do ft h ist h e s iso f f e r e di m p o r t a n ts t r u c t u r a ld a t af o rt h e r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fo t h e rm a r i n e a c i d i co l i g o s a c c h a r i d e sa n d e n d o u g e n o u ss u b s t a n c e s t h es t u d yo fa c i d i co l i g o s a c c h a r i d e sb yh p c eh a s i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e k e y w o r d s ：hig hp e r f o r m a n c eo a pi i la r yele e t r o p h o r e sis ：k - c a r r a g e o n a n o ii g o s a c c h a r i d e s ：d e r i v a t i z a t i o n k 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 刖吾 自然界中的四大基本物质：糖类、脂类、蛋白质、核酸等构成了生物体的基 本结构，其中糖是生物体内普遍存在的一类重要的化学物质，是植物和动物的能 量来源，在很多生命过程中起着不可或缺的作用。而新兴的糖生物化学研究发现 糖类物质除了提供能量外还有其它多方面的生物活性与功能，诸如抗癌、抗菌、 抗病毒、控制细胞分裂，调节细胞生长和人体免疫功能等作用【1 1 ，多糖及其衍生 物还被用作分离对映异构体的手性选择剂【2 ，3 1 ，所以糖类的研究受到人们越来越 多的重视。研究结果己确证，糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化，神 经系统和免疫系统平衡态的维持等方面起着重要作用；炎症和自身免疫疾病、老 化、癌细胞的异常增殖和转换、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根 瘤菌共生等生理和病理过程都有糖类的介导。近些年来，随着分子生物学特别是 细胞生物学的发展，糖的诸多生物学功能不断的被揭示和认识。特别是糖蛋白当 中的寡糖链，它参与蛋白质的靶向细胞识别以及抗体和抗原的相互作用等重要的 生命过程，其结构和功能研究成了继d n a 、蛋白质之后的一个重要的前沿课题【”。 一海洋寡糖生物活性 寡糖( o l i g o s a c c h a r i d e ) - - 般是由3 1 0 个单糖分子通过糖苷键连接而成的化合 物，它广泛存在于生命体内，主要是以糖蛋白、糖脂和糖肽等糖缀合物的形式参 与许多生命活动，而这些糖缀合物在发挥生物学功能的过程中起决定作用的往往 就是那些寡糖残基1 5j 。现已发现在激素、抗体、维生素、生长素和其他各种生物 、_ f 一，。一 大分子中都有寡糖的存在。寡糖同时也存在于细胞膜的表面，使整个细胞膜表面 都覆盖有寡糖，这些寡糖在细胞正常或不正常的识别过程中都发挥着重要的作用 k 】。可以说寡糖在生物体大分子及细胞间的相互作用过程中发挥着一种信号的功 能，起着一种桥梁的作用。寡糖由于单糖结合位置和结合类型的不同，种类繁多， 功能各异。多糖链在经过不同形式的断裂后，其原有的活性得到提高，有些甚至 产生了非同一般的活性，早在1 9 6 4 年就有人发现肝素对单纯疱疹病( h s v ) 有 抑制作用1 7j ：寡糖也有很强的抗病毒活性，特别是今年来有诸多报道对寡糖的 h i v 抑制作用详加阐述。同时寡糖还具有低毒性的特征，因此对寡糖活性的研究 k 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 极为重视。 海洋是生命的最初发源地，在海洋生物中存在着大量具有特殊作用的活性物 质。国内外的研究成果表明，海洋生物的多样性及其生物活性物质化学结构的多 样性远远超过了陆生生物，以海洋生物作为药物开发的资源具有非常广泛的前 景。目前对海洋糖类的研究多集中在海藻硫酸多糖的生物活性上，发现的活性也 主要与硫酸基有关，而国内外对海洋寡糖的研究非常缺乏。所谓海洋性寡糖是指 来源于海洋的寡糖，以几丁寡糖、褐藻寡糖、卡拉胶和琼胶寡糖等为代表，它们 来源丰富，结构独特，在结构特点方面与内源性寡糖有很多相似点，有着巨大的 开发潜力。海洋性寡糖有着多种重要的生物活性，如抗凝、抗病毒、增强免疫功 能、抗肿瘤与抗炎等，加之其在保健食品工业上的应用于发展，因此有关寡糖的 研究及应用己成为结构化学、分子生物学、医学和食品学的新兴研究领域【8 j 。 总之，现代科学已表明并将进一步证明，一切重要的生命活动过程都有糖的 参与。2 l 世纪生命科学的研究焦点是对多细胞生物的高层次生命现象的解释， 因此，对生物体内细胞识别和调控过程的信息分子一糖类的研究是必不可缺的。 二卡拉胶的生物活性 卡拉胶( c a r r a g e e n a n ) 是由红藻( r e da l g a e ，r h o d o p h y t a ) 中提取的一种水溶 性胶体，我国早期曾称其为角叉菜胶、麝角菜胶，后统一为卡拉胶。作为食品添 加剂，卡拉胶已有几十年的应用历史【9 】。 最早的关于卡拉胶活性的研究主要集中在其与蛋白质的结合作用上。近年来 它在生理学和病理学研究中所表现出的生物活性也相继被人们所发现，根据文献 报道，现将其活性归为以下四个方面。 ( 一) 抗病毒活性 卡拉胶属于天然硫酸多糖，是一类低毒的广谱抗病毒化合物。首先是g e r b e r 等发现从海藻c h o n d r u sc r i s p u s 中提取的卡拉胶能够保护受孕卵抵抗流感病毒b 和腮腺炎病毒( 1 0 】。近几年来，卡拉胶的抗病毒研究集中于抗h i v 和h s v 的活性。 y a m a d a 等人( 2 0 0 0 ) 研究了沪乙酰低分子量卡拉胶的制备，并证明了其抗h i v 活性i “l 。同时研究发现卡拉胶具有抗疱疹病毒的作用。 ( 二) 抗肿瘤活性 实验表明卡拉胶能明显的抑制肿瘤生长。n o d a ( 1 9 9 0 ) 研究了卡拉胶对小鼠艾 2 k 一卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 氏腹水瘤和m e t h - a 纤维素瘤的抑制作用【1 2 1 ，师然新等( 2 0 0 0 ) 研究了部分降解 的卡拉胶对小鼠肝癌h 一2 2 的抑制作用，表明卡拉胶对以上肿瘤都有明显的抑制 作用l ”i 。 ( 三) 降血脂功能 卡拉胶能降低血清低密度脂蛋白( l d l ) 、胆固醇和控制实验性动脉粥状硬化 的形成【1 4 1 。卡拉胶的降血脂作用较其他膳食纤维更明显，因其除了影响胆固醇 吸收外，还可通过形成凝胶吸附胆酸造成胆酸减少，机体利用胆固醇合成胆酸， 使血脂减少。 ( 四) 抗凝作用 卡拉胶作为抗凝血剂，具有于肝素近似的抗凝作用，未经降解的卡拉胶与血 纤维蛋白形成不溶的复合物，而降解的卡拉胶象肝素一样与血纤维蛋白生成可溶 的复合物，其毒性比未降解的明显小1 5 i 。 卡拉胶还是有效的抗胃蛋白酶、抗溃疡、抗栓物质，包括抑制胃蛋白酶活性、 保护组织抑制溃疡、抗凝血、消除血脂等。含3 7 3 的硫酸酯，分子量8 0 0 ，0 0 0 的卡拉胶( 角叉菜胶) ，是治疗某些胃、十二指肠溃疡良药【1 6 1 。 对卡拉胶的生物活性的研究，充分显示了卡拉胶在医药开发领域的广阔前景 d 7 1 。牟海金等人对卡拉胶寡糖的体内抗肿瘤活性进行了研究1 8 】，发现卡拉胶寡 糖对小鼠s 1 8 0 肉瘤有较好的抑制作用，同时还研究了卡拉胶寡糖对超氧化物歧 化酶s o d 和过氧化氢酶c a t 的活性，发现较低硫酸根含量的卡拉胶寡糖有着较 高硫酸根含量卡拉胶寡糖更好的抗氧化活性，认为抗肿瘤活性可能与抗氧化活 性、免疫调节和抑制肿瘤转移有关。降解的卡拉胶是一种有效的体内致炎剂【1 9 , 2 0 1 ， 广泛用于各种抗炎剂的检验。同时降解的卡拉胶已在实验中作肠道致炎剂制备多 种肠炎动物模型。所以对k 一卡拉胶寡糖的研究已成为当今医药研究领域的热点 之一。 三糖及其缀合物的分析 糖是生化领域里经常检测的对象，寡糖的各种生理活性已经得到广泛的认 识，但是由于许多寡糖的原料较为难得或寡糖的制取方法较为困难，特别是某些 糖蛋白和糖脂上的寡糖链，所以目前许多高活性的寡糖仅处于试验阶段，尤其寡 糖的分离检测方法、技术尚不完善，这些因素客观上制约着人们进一步对寡糖的 k 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 深入研究，因此，糖的分析方法直接影响着糖生物学研究的发展。 常规的测定糖的化学方法有苯酚硫酸法、二硝基水杨酸法等，但这些方法只 能测定总还原糖，不能测定各种糖的含量，且比色定量不准确。混合糖的分离鉴 定及其组成的分析方法一般采用纸色谱法、薄层色谱法及柱色谱法，能够在糖类 分离的基础上对样品中的各种糖类逐一定量分析，但这些方法存在分离效力有限 2 q 和非专一性响应的问题【2 2 | 2 3 】，气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法【2 4 】 分离能力高，方法灵敏快速，在糖的分离分析中己显出巨大的优越性。 1 、气相色谱( g c ) 法 气相色谱法是一种以气体为流动相的柱色谱分离分析方法，此方法测定糖类 始于1 9 5 8 年，主要用于分析多糖和寡糖的单糖组成，在国内外得到了广泛的应 用1 2 5 1 。在全部色谱分析的对象中，约2 0 的物质可用气相色谱分析。气相色谱 法具有分离效率高、灵敏度高，分析速度快及应用范围广等特点。在仪器允许的 气化下，凡是能够气化且热稳定，不具腐蚀性的液体或气体，都可用气相色谱法 分析。有的化合物因沸点过高难以气化或热不稳定而分解，则可以通过化学衍生 化的方法，使其转变成易气化或热稳定的物质后再进行分析1 2 6 】。单糖、寡糖可 直接制备成衍生物进行g c 测定。 由于糖的异构化，多糖需先降解成单糖或寡糖后制成衍生物再进行g c 测定 【2 7 - 2 9 1 。多糖在水解过程中，往往产生一系列的中问产物的异构体，在色谱分析时 产生多重峰影响组分的分离和测定娜j 。因此在分析复杂样品时，应选择适宜的 衍生物制备方法。常用的衍生物有：糖的三甲基硅醚衍生物，糖醇三氯乙酸酯3 1 1 衍生物，糖腈乙酸酯衍生物。 2 、高效液相色谱( h p l c ) 法 7 0 年代以来的现代色谱时期是以高效液相色谱( 1 1 i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 为代表。在已知化合物中7 0 以上为不挥发性化合物， 某些化合物通过衍生技术虽然能提高挥发性，然后用气相色谱分析，但却不如液 相色谱直接简便。高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快和应用范围广泛的 特点，特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。 到目前为止，有两种通常采用的方法：一是使用化学键合固定相，以乙腈一 水或乙腈一甲醇一水作为流动相，单糖或寡糖由示差折射检测器检测。为了提高 k 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 检测的灵敏度和分辨率，糖类经常有紫外或荧光标记的衍生化后，用硅胶做固定 相，以正己烷一二氧六环为流动相，在紫外或荧光检测器上检测单糖或寡糖；另 一种方法是以离子交换树脂或凝胶做固定相，水或盐溶液为流动相，用示差检测 器或采用柱后衍生化方法，用可见光、紫外光或荧光检测器检测，以提高检测灵 敏度。此外，h p l c 还可以测定多糖的分子量，可以对糖进行定量分析，在此方面 是其他方法无可比拟的【3 “。液相色谱作为一种分析方法，其最大特点在于将复 杂的混合物分离为各个有关的组成后，逐个地加以检测。目前，美国药典、欧洲 药典、英国药典和中国药典致力于用高效液相色谱法取代所有不具专属性的方 法，高效液相色谱法己成为药物分析学科领域中重要的分离分析技术。 3 、高效毛细管电泳技术 毛细管电泳又称高效毛细管电泳( h p c e ) 或毛细管电分离法( c e s m ) ，是一类以 毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。它是经 典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，综合了高效液相色谱和凝胶电泳的优 点。高效毛细管电泳( h p c e ) 3 3 l 是一种迅速发展于8 0 年代中后期的分离新技术， 具有分离效率高，分析时间短，进样量少、检测限低和多模式等特点，广泛地应 用于各类化合物的分析，如无机离子、手性分子、多肽和蛋白质、d n a 的分析等 3 4 - 3 6 1 ，已被广泛地用到生物、化学、医药、环保、食品等领域，具有很好的应用 前景【3 7 , 3 8 1 。而在糖分析中应用却比较少，这是因为糖一般为亲水性强的电中性物 质，不能直接进行毛细管区带电泳分析，也很难直接采用胶束电动色谱分离模式。 另一方面，糖既无u v 吸收，又无荧光发光基团，检测上存在困难。但这并不妨 碍h p c e 作为一种强有力的分新技术在糖分析中的应用。1 9 8 9 年h o n d a 等 3 9 1 报道 了还原糖的毛细管电泳测定方法，为这一领域的研究开辟了道路。近年来，随着 毛细管电泳技术的不断完善，各种新的糖衍生化方法和检测技术的出现，使毛细 管电泳在糖分析中的运用越来越广泛【4 。 3 1 毛细管电泳发展简介 毛细管电泳技术是在最近的二十余年间快速发展起来的一门新的分离分析 技术，但是从该技术的发展角度来看，最早利用窄孔径管作电泳分离的报告，可 追溯到1 9 4 2 年m a r t i n 的工作。以毛细管等速电泳( c i t p ) 的发展为起点可以上溯 到1 9 6 0 年甚至更远。多数学者以毛细管区带电泳( c z e ) 的出现为毛细管电泳研究 k 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 的起点，即便如此，其历史亦可上溯到1 9 6 0 年代中期。c z e 是瑞典科学家h i e n e n 首先提出的。毛细管电泳技术作为一项电泳分析手段在世界各地得到发展是始于 1 9 8 8 年，j o r g e n s o n 和r o s e 共同提出毛细管电泳作微量制备的可行性，他们用 7 5 ”m i d 的熔融石英毛细管做毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c l s o p h o r e s i s ， c z e ) ，利用电迁移进样和荧光检测，对氨基酸实现了快速、高效分离，在3 0 k v 下产生了4 1 0 5 片m 的效率，从而创立了现代毛细管电泳，成为毛细管电泳发 展史上一个划时代的里程碑，轰动了分离科学界。 国内的毛细管电泳研究首先由竺安教授于1 9 8 0 年开始。他先后在中国科学 院化学研究所和浙江大学建立了两个研究组，并从1 9 8 6 年开始陆续在有关会议 和杂志上发表研究结果，其中关于红细胞c z e 4 1 - 4 3 、扁毛细管区电泳1 4 4 ，4 5 1 、低背 景毛细管凝胶电泳和毛细管梯度凝胶电泳 4 6 , 4 7 培具有理论和实际意义。1 9 9 2 年 后，毛细管电泳开始在国内受到广泛重视，发展很快。1 9 9 3 年，由中国科学院 化学研究所和大连化学物理研究所共同组织，在北京召开了第一届全国毛细管电 泳学术讨论会，此后，每两年举行一次。进人9 0 年代以来，毛细管电泳技术在 我国分析化学领域里亦展示了它的独特优点即分辨率高，快速且所需样品和试剂 微量。现今，毛细管电泳技术已显示出其在肽、蛋白质、核酸和药物等物质分离 分析上的巨大优势。 随着，c e 技术的不断发展，h p c e 分析仪器也不断完善，1 9 8 8 1 9 8 9 年间 第一台商品h p c e 仪面世，是h p c e 技术走向应用时期的重要标志；第一届国 际毛细管电泳会议召开，标志着一门新分支学科的产生，此后各国科学工作者之 间的学术交流活动频繁活跃，i - i p c e 技术在各个领域开始突飞猛进的发展。我国 学者在h p c e 方面的研究较为全面，有些成果达到国际先进水平。国外出版的有 关毛细管电泳的专著已经出版多种，在国内也先后出版了中文毛细管电泳专著 4 8 - 5 0 ，在一些相关的色谱技术专著中都将h p c e 技术列入f 5 1 , 5 2 】。 3 2 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳是离子或带电粒子以高压电场为驱动力，在毛细管中按其淌度差 别或和分配系数的不同进行高效、快速分离的一种新型电泳技术。带电粒子在 电解质中，在电场作用下以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电 泳，粒子在单位电场下的电泳速度( 1 j e ) 称为淌度，即淌度是指溶质在给定缓 6 x 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 冲溶液中单位时间间隔和单位场强下移动的距离。淌度与粒子所带电荷数及体积 大小相关，因此不同的粒子由于淌度不同从而实现电泳分离。在充满自由溶液的 毛细管中，一个离子的淌度可以近似表达为1 5 3 l ： u 。= 8 ( i ( 4 “1 1 ) 式中，为流体的介电常数；”为介质粘度： 3 时，其内表面带负电荷，和溶液接触形成一双电层，在高电压作用下，双 电层中的水合阳电子层引起溶液在毛细管内整体向负极移动，形成电渗流( e o f ) 。带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和e o f 二者的矢量 和。带正电粒子最先流出，中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度相当于 e o f 速度，带负电粒子运动方向与e o f 方向相反，因e o f 速度一般大于电泳速 度，故它将在中性粒子之后流出，各种粒子因迁移速度不同而实现分离。 c z e 的突出特点是简单，但是因为中性物质的淌度差为零，所以不能分离 中性物质。c z e 模式是h p c e 中最简单、应用最广的一种操作模式，是其他操 作模式的基础，包括氨基酸、多肽、蛋白质的分析鉴定、药物对映体的分析、糖 x 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 类、离子及小分子等样品的定性定量分析。 ( 2 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ；c g e ) c g e 是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作为支持物而进行的电泳，凝胶具 有多孑l 性，起到类似分子筛的作用，溶质分子按照大小逐一分离。常用聚丙烯酰 胺在毛细管内交联制成凝胶柱，可用于分离测定蛋白质和d n a 片段。其缺点是 凝胶柱制各困难，寿命偏短；后来发展起来的无胶筛分，用低粘度的线性聚合物 代替高粘度的聚丙烯酰胺，同样起到电泳分离的效果，方法简单，但分离能力较 c g e 差。 ( 3 ) 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ；c i e f ) 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c m f ) ，是一种根据等电点差 别分离生物大分子的高分辨电泳技术。两性物质以电中性状态存在时的p h 值叫 做等电点。如氨基酸、蛋白质、多肽等在其等电点时为电中性淌度为零，溶解度 最小。当两性物质在毛细管中形成p h 梯度时，不同等电点的溶质在外电场的作 用下，分别向其等电点的p h 范围迁移，此过程叫聚焦。当溶质迁移到等于其等 电点的p h 范围时，就不再移动，形成一个很窄的溶质带。由于不同两性物质的 等电点不同，聚焦的p h 范围不同，可以形成一个个独立的溶质带而彼此分开。 c i f f 是用两性电解质在毛细管内建立p h 梯度，使各种不同等电点的蛋白质 在电场作用下迁移到各自等电点的位置，形成窄的聚焦区带，再依次通过检测器 分别加以确认。c i f f 法已成功应用于蛋白质等电点的测定，分离异构体和其他 方法难以分离的蛋白质。 ( 4 ) 毛细管等速电泳( c a p i l l a r t yi s o t a c h o p h o r e s i s ；c i t p ) c i t p 是一种较早的分离模式，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电 泳淌度不同加以分离，现在常用作柱前浓缩方法用以富集样品，以提高h p c e 测定中浓度灵敏度。c i t p 常用于分离离子型物质，但因其要采用不连续缓冲体 系，分辨率差，目前应用不多。 ( 5 ) 胶束电动色谱( m i e e l l a re l e c t r o k i n e f i cc h r o m a t o g r a p h y ；m e k c l m e k c 分离原理是在电泳缓冲液中加入表面活性剂( 如十二烷基硫酸钠( s d s ) 等) ，当表面活性剂浓度超过其临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基 团聚集在一起形成胶束，溶质基于在水相和胶束之间的分配系数不同而得到分 1 0 * 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 离。 m e c c 将电泳技术与色谱技术结合，把电泳分离的对象从离子型化合物扩展 到中性化合物，从而使亲水性有差别的中性物质在电泳中得以分离。m e k c 使 c e 能用于中性物质的分离，拓宽了c e 的应用范围，是对c e 的极大贡献：而且 能够实现快速改变流动相和胶束相组成来增加分离选择性，非常适合手性化合物 的分离。其缺点在于对样品要求分子量小于5 0 0 0 。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ：c e c ) c e c 是把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的一种分离技术，是用装 有固定相的毛细管柱( 或有固定相涂层的空心毛细管柱) 以电渗流为驱动力，使 样品在两相间进行分配的色谱。利用涂层还能有效减少生物大分子如蛋白质在毛 细管壁的吸附，改善峰形，提高选择性，是一种很有发展前景的模式。 此外，还有在这些c e 基本分离模式基础上利用各种技术建立起来的特殊的 分离模式，如亲和毛细管电泳( 利用生物分子或其他受体分子与其相应的专一分 子可逆亲和特性来进行电泳分离) ，毛细管矩阵电泳( 大量毛细管平行分离) ，微 毛细管电泳( 将微系统技术应用于c e ，把化学反应的产物引入毛细管进行电泳 分离。微毛细管电泳装置柱短、场强大，因此速度快、效率高、检测限低，在当 今纳米技术快速发展的情况下会显示出更大的发展前景) 等等。 3 3 毛细管电泳的进样技术 毛细分离通道十分细小，所需的样品区带不过数纳升，所以象色谱的那些进 样方法就不太适用了，他们存在较大的死体积，会使分离效率严重下降。有一种 简单的办法可以实现无死体积进样，这就是让毛细管直接与样品接触，然后由重 力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动的大小或 时间的长短来控制。在保证检测器具有相当灵敏度的前提下，应尽可能减少进样 体积，以提高分离效率。 目前的进样技术主要有电动进样、压差进样、扩散进样等。电动进样对毛细 管内的填充介质没有特别的限制，属普适性方法，可以实现完全自动化操作，不 过电动进样对离子组分存在进样偏向，即迁移速率大者多进，小的少进或不进， 这会降低分析的准确性和可靠性；压力进样没有偏向问题，但选择性差，样品及 背景都同时被引入管中，对后续分离可能产生影响；扩散进样具有双向性：在样品 x 卡拉胶寡糖的高效毛细管电竦分析方法的研究 分子进入毛细管的同时，区带中的背景物质也向外扩散。由此可以得到畸变程度 较小( 和背景差别不大) 的初始区带，能抑制背景干扰，提高分离效率，扩散也与 电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的可靠性。 3 4 毛细管电泳的特点 毛细管通常使用内径为2 5 1 0 0 u r n 的弹性熔融石英毛细管，标准外径为 3 6 0 u m ，因此毛细管具有以下特性：容积小( 一根1 0 0 c m x 7 5 u r n 的毛细管容积仅 为1 7 7 n 1 ) 、侧面，截面面积比大有利于散热且可承受高电场( 1 0 啦! 0 0 0 v c m ) 、可 使用自由溶液和凝胶等支持介质、能产生平流形状的电渗流。毛细管的这些特性 决定了毛细管电泳具有以下特点： 1 高效效率在1 0 。5 1 0 石片m 间，c g e 效率可达1 0 7 片m 以上： 2 快速。由于毛细管能抑制溶液对流，并具有良好的散热性，允许在很高的电场 下( 可达4 0 0 v c m 以上) 进行电泳，通常可在几十秒至十几分钟完成多组分分离。 3 微量进样所需体积可小到l u l ，消耗体积在1 5 0 u l 之间： 4 多模式可根据不同需要选择不同的分离模式，且只需一台仪器； 5 分析对象广从无机离子到整个细胞，具有“万能”分析功能或潜力： 6 经济实验消耗仅几个1 1 1 l 的缓冲溶液，维持费用可用人民币分来计算： 7 自动c e 是目前自动化程度最高的分析方法； 8 洁净通常使用水溶液，对人和环境无害。 基于毛细管上述特点，在近几年h p c e 受到分离科学界的极大关注，成为分 析化学领域发展最快的一种新型分离分析技术，在i 临床医药6 0 6 ”、环境监测【6 2 】 和生命科学1 6 3 删中都发挥越来越重要的作用。 但是使用毛细管也给c e 带来问题，比如：制各能力差：光路太短，非高灵敏 度检测器难以测出样品峰；凝胶、色谱填充管需要专门的灌制技术；大的侧面 ，截面积比能“放大”吸附作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰；吸附引 起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚难以定量控制电渗。 3 5 毛细管电泳的前景展望 c e 作为一种新型高效的分离技术，给现代生物医学提供了强有力的分离分 析手段。c e 的多种分离模式给样品分离提供了不同的选择机会，这对分离来源 复杂的生物样品尤为有利。随着c e 的不断发展和完善，目前，c e 的研究热点 k - 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 包括d n a 的高速测序、蛋白质的高效分离、单细胞分析、高效手性拆分等 6 5 - 6 8 】。 同时，毛细管电泳方法上的发展也是多方面的，其中建立新的分离模式和联用技 术最为突出，如集成毛细管电泳芯片( i n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e t r o p h o r e s i sc h i p s ， i c e c ) 1 6 9 - 7 1 、阵列毛细管电泳( c a e ) 以及h p c e m s 7 2 i 、h p c e n m r l 7 3 1 联用 技术等。目前c e 的研究已进入了一个重要的发展阶段，被认为是二十世纪9 0 年代分析科学最具活力的前沿研究课题。 四、糖类的毛细管电泳 糖是生物体内普遍存在的一类重要的化学物质，是植物和动物的能量来源， 在很多生命过程中起着不可或缺的作用。我国对糖类的研究目前主要集中在化学 和药理方面，对其进行分离分析的研究特别是用高效毛细管电泳技术( h p c e ) 对 其进行分离分析的研究很少，且主要集中在9 0 年代初期。与糖的其它分析测定 技术相比【7 4 - 7 8 ，高效毛细管电泳( h p c e ) i t t 于其分离效率高，分析速度快、样品 用量小、灵敏度高的特点吸引了越来越多的注意。糖类化合物一直是分析化学界 公认的难分离的一类物质7 9 1 。主要因为多数糖类解离程度十分微弱，且具有较 强的亲水性，致使利用样品淌度差异的毛细管区带电泳和利用样品疏水性差异的 胶束毛细管电动色谱都难以直接解决糖的分离问题。其次多数糖类通常不含有发 色或荧光基团，使分离后的检测有一定困难【肋1 ，因此糖的分析测定始终是一个 具有挑战性的课题，但这并不妨碍h p c e 作为一种强有力的分新技术在糖分析中 的应用。近年来，随着毛细管电泳技术的不断完善，各种新的糖衍生化方法和检 测技术的出现，使毛细管电泳在糖分析中的运用越来越广泛。 4 1 糖的衍生化技术 1 9 8 9 年h o n d a 等3 9 】报道了还原糖的毛细管测定法。他们的工作为糖的分析 测定领域的研究开辟了新的道路。他们巧妙地利用硼酸与糖类化合物反应。糖中 相邻的两个羟基与硼酸中的硼配位，失去两分子水，从而形成带电复合物，然后 用2 一氨吡啶来衍生还原性糖，紫外检测，同时测定了1 2 种糖，检出限为1 0 p m o ， 这就是柱前衍生的一种方法。这种方法的目的主要是通过化学反应使糖类化合物 带上固有电荷，以改善通常呈中性的糖类分子的电迁移性能。此外，由于具有同 一还原端的不同寡糖具有唯一的紫外或荧光响应值，从而给糖类的定量分析带来 方便8 1 1 。 k 卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法的研究 为了能够灵敏地检测糖，需选择合适的衍生化试剂进行标记。除上述方法之 外，还有许多衍生化反应可使糖带上合适的基团并提高其检出限至f m o l a m o l 级。这些方法大都基于还原氨基化反应，也就是分子的还原端与带电的发色或荧 光基团的伯胺反应成为希夫氏碱，再利用硼氰氢化钠( n a b h 3 c n ) 还原成仲胺， 常用的紫外衍生试剂有：叶萘胺f 8 2 】、对肼基苯磺酸及3 - 甲基1 一苯基_ 5 - 吡唑啉 酮( p m p ) 【洲，还有几种衍生试剂既有紫外吸收，又能产生荧光，如2 一氨基吡 啶和6 氨基喹啉【8 5 】、7 - 氨基萘一l ，3 - 二磺酸( a n d s ) 【s 6 】、3 一( 4 - 羧基苯甲酰基) 一2 一 喹啉羧基醛( c b q c a ) i s 7 1 、3 一甲基一卜苯基一2 一吡唑啉酮( p m p ) 8 8 1 、芴甲氧羰基肼 ( f m o c h y d r a z i n e ) 和芴甲氧羰基氯( f m o c c 1 ) 及a n t s ( 8 氨基萘基1 ，3 ，6 一 三磺酸) 1 9 0 - 9 4 1 。其中a n t s 是一个典型的代表，它除了可以起到在糖分子中引 入发色和荧光基团的作用之外，还能使之带上固有电荷，这样使分离速度和分离 效率得以加速或提高。车云发等【舛】即采用该法为糖分子提供了生色基团和3 个 负电荷，使原来为中性的糖分子能在各种p h 值的缓冲溶液中，在电场力的作用 下，产生电迁移，从而通过h p c e 分析，u v 检测，建立了一种高效分离分析寡糖 的方法，他们所得到的葡聚寡糖电泳梯度图为寡糖链长度的分析或寡糖结构性质 的比较提供了一个标准的尺度。此外，车发云等【9 5 】还用a m a c 胺化还原1 1 种常 见的还原单糖，然后利用h p c e 同时分析这些单糖的& m a c 衍生物，对糖结构影响 衍生物电迁移率的内在因素作了分析。m e c h r e f 等瞰l 报道了一种专门分析酸性寡 糖的方法，用7 一氨基一1 ，3 一二萘磺酸衍生，u v 或荧光检测，对衍生糖检出限在 f m o l 级。c h i e s a l 9 刀用氨基萘磺酸衍生麦芽寡糖和甘露寡糖。g u t t m a n 9 8 1 报道了这 一技术在分析寡糖中各种因素对测定结果的影响。 4 2 糖类物质c e 分析的检测 4 2 1 缓冲溶液 缓冲溶液的p h 值及组成对糖的分离起十分重要的作用。很多不可分离的糖通 过改变缓冲溶液的p h 值及组成可以获得很好的分离。s o g a | 9 9 等利用此性质建立 了一种用毛细管电泳问接紫外检测法检测食物样品中糖类物质的简单且重现性 良好的方法。并且在电化学检测中常用氢氧化钠溶液作缓冲溶液。丁祥欢【1 0 0 】等 用毛细管电泳一电化学检测法研究了不同浓度的n a 0 h 溶液中各种单糖的分离情 况，并用此法分析了牛膝多糖的单糖组份。朱叔韬【】叭】利用铜电极在n a 0 h 缓冲液