甜樱桃自交亲和基因sfb4’的分子鉴定（原版论文） .pdf

首都师范大学 硕士学位论文 甜樱桃自交亲和基因sfb4的分子鉴定 姓名：朱墨 申请学位级别：硕士 专业：植物学 指导教师：张开春 20050501 首都师范大学硕士学位论文 英文缩略表 缩写符号 b y kb c dna d nt p d 声 li t d c t p d gt p d t t y s i s c gs i s s i hv p a g e p cr as - p c r s p i 2 s c r s r k s f 日 s l f b ac e1 e 2 e3 英文名中文名 b a s e p a i r碱基 对 k i l o b a s e千碱基 c o m p l e m e n t a ry d n a互补d n a d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e脱 氧 核 糖 核 昔 酸 三 磷酸 d e o x y a d e n o s i n e t r ip h o s p h a t e脱 氧 腺昔 三 磷酸 d e o x y c t y i d i n e t r i p h o s p b a t e脱氧胞 昔三 磷酸 d e o x y g u a n o s in e 吻h o s p h a t e脱 氧鸟 昔三 磷 酸 d e o x y th m id in e t r ip h o s p h a t e脱 氧胸 昔 三磷 酸 s e l f - i n c o m p a t ib i l i t y自 交不亲和 s e l f - c o m p a t i b i li t y自 交亲和 g a m e to p h y t ic s e lf - i n c o m p a t i b ili t y配子 体自 交 不 亲和 s p o r o p h y t ic s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y抱子 体自 交不亲和 h y p e r i a b l e r e g i o n高 变区 p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酞胺凝胶电 泳 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n聚合酶链式反应 a l le l e s p e c i fi c p o l y m e r a s e c h a in r e a c t io n等 位 特异 聚合 酶 链式 反 应 s - lo c u s p r o te i n - 1 1 5- 基因 座蛋白 一 1 1 s - l o c u s c y s t e i n e - r i c h p r o t e i n s- 基因 座富 含组 氨酸的蛋白 s - l o c u s r e c e p t o r k i n a s e s-基因座受体激酶 s h a p l o t y p e - s p e c i f i c f - b o x p r o t e i n g e n e s - l o c u s f - b o x g e n e b a c t e r i a a r t i fi -p t u b i q u i t i n - a c t i v a t i o n g e n z y m e u b i q u i t in - c o 川 u g a t i n g e n z y m e u b i q u i t i n l i g a s e s - 单元型特异f - b o x 蛋白基因 5-基因座f - b o x 基因 细菌人工染色体 泛素活化酶 泛素结合酶 泛素连接酶 甜樱桃自 交亲和荃因s f b 4 ， 的分子鉴定 摘要 自 交不亲和是显花植物预防近亲繁殖和保持遗传变异的一种重要机制， 这一 机制在植物界中 普遍存在。由于自 交不亲和是植物生殖过程中的一个重要现象， 因此它已成为果树及其它植物研究的热点。与其它自 交不亲和的蔷薇科果树相 似， 甜樱桃显示以s - r n a s e 为基础的配子体自 交不亲和。甜樱桃的s 4 ， 单元型是 由自 交不亲和的s 4 单元型经x射线辐射而产生的 花粉部分突变的自 交亲和型突 变体。一直以来用分子生物学方法无法区别自 交不亲和的s 4 单元型和自 交亲和 的s 4 单元型，直到最近发现s f b ( s - 单元型特异f - b o x 蛋白基因)是配子体自 交不亲和花粉决定子基因。 本研究鉴别了自 交亲和的s 4 单元型的s f b 4 ， 基因. 用b l a s t 程序比 较 s f b 4 基因和s f b 4 基因时发现: s f b 4 基因中有4 个碱基的 缺失，并且这4 个缺失碱基是m a。利用由s f b 4 ， 中的 mm缺失而产生的 s f b 4 和s f b 4 ， 基因之间的序列多态性设计了一对特异扩增s f b 4 ， 基因的引物， 从 而产生了特异鉴别s 4 ， 单元型的s f b 4 ， 基因 特异分子标记。 s f b 4 基因特异分子标 记可以直接在琼脂糖上区分s 4 和s 4 ， 单元型， 所以这种标记可以快速应用于樱桃 分子辅助育种工程中。 因此， 本研究给樱桃育种提供了一种简单实用的分子标记。 关键词:甜樱桃，自 交不亲和，单元型， s - 单元型特异f - b o x 蛋白 基因 首都师范大学硕士学位论文 ab s t r a c t s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ( s i ) i s a w i d e s p r e a d m e c h a n i s m i n fl o w e r i n g p l a n t s , w h i c h p r e v e n t s s e l f - f e rt i l i z a t i o n a n d p r o m o t e s o u t c r o s s i n g . s w e e t c h e r ry ( p r u n u s a v i u m l .) d i s p l a y s t h e s - r n a s e - b a s e d g a m e t o p h y t i c s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ( g s i ) s i m i l a r t o o t h e r s e l f - i n c o m p a t i b l e f r u i t t r e e s p e c i e s o f t h e f a m i l y r o s a ce a e . i n s w e e t c h e r ry , t h e s 4 h a p l o t y p e c h a r a c t e r i z e d b y a s e l f - i n c o m p a t ib i li t y d e f e c t in p o l l e n i s s e l f - c o m p a t i b l e , a n d i s d e r i v e d f r o m s e l f - i n c o m p a t i b l e s 4 h a p l o t y p e b y x - r a y m u t a g e n e s i s . t h e r e h a v e b e e n n o m o l e c u l a r m e t h o d s t o d i ff e r e n t i a t e b e t w e e n s e l f - i n c o m p a t i b l e s 4 h a p l o t y p e a n d s e l f - c o m p a t i b l e s 4 h a p l o t y p e , u n t i l r e c e n t l y s f b s ( s - h a p l o t y p e s p e c i fi c f - b o x p r o t e i n g e n e ) w e r e f o u n d t o a s s o c i a t e w i t h p o ll e n d e t e r m i n a n t o f g s i . t h i s r e p o rt i d e n t i fi e d t h e s f b 4 o f t h e s e l f - c o m p a t i b l e s 4 h a p l o t y p e . t h e a l i g n m e n t o f t h e s e q u e n ces o f s f b 4 a n d s f b 4 b y t h e b l as t p r o g r a m r e v e a l e d t h a t t h e r e i s a 4 b y d e l e ti o n i n s f b 4 a n d t h e 4饰 d e l e t i o n i s t tta t h e s e q u e n ce p o l y m o r p h i s m g e n e r a t e d 勿t h e t tta d e l e t i o n i n t h e s f b 4 w a s e x p l o i t e d t o d e v e l o p t h e s f b 4 g e n e - s p e c i fi c m o l e c u l a r m a r k e r s p e c i f i c f o r t h e d e t e c t i o n o f t h e s 4 h a p l o t y p e b u t n o t s 4 h a p l o t y p e . t h e s f b 4 g e n e - s p e c i fi c m o l e c u l a r m a r k e r c a n b e v i s u a l i z e d d i r e c t l y o n a n a g a r o s e g e l , s o i t c a n b e i m m e d i a t e l y a p p li e d t o a m a r k e r - a s s i s t a n t c h e r r y b r e e d i n g p r o g r a m . t h u s , t h i s w o r k p r o v i d e s a s i m p l e a n d p r a c t i c a l m o l e c u l a r m a r k e r f o r c h e rr y b r e e d i n g . k e y w o r d s : p r u n u s a v i u m l , s e l f - i n c o m p a ti b i l i t y , h a p l o t y p e , s h a p l o t y p e - s p e c i fi c f - b o x p r o t e i n g e n e 甜樱桃自 交亲和基因s f b 4 ， 的分子鉴定 1 引言 植物自 交不亲和的研究是当前国际植物分子生物学研究的热点之一， 其中茄 科型配子体自 交不亲和的 研究更是引人注意。 从在茄科中分离到与配子体自 交不 亲和相关的花柱糖蛋白 开始到后来在玄参科、 蔷薇科和茄科植物中发现了 花粉决 定子基因( s l f / s f b ) ， 人们对茄科型配子体自 交不亲和机理有了更为深刻的认识。 加深对果树自 交不亲和的研究不仅有助于更好的 认识这一特殊生命现象， 也有助 于在果树育种和生产上加以 控制与利用这一机制。 在此本文主要对茄科型配子体 自 交不亲和分子与生理机制的 研究进展作一简要综述。 1 . 1自 交不亲和性 ( s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s d 大多数显花植物都产生既包括雄性生殖器官( 雄蕊) 又包括雌性生殖器官( 雌 蕊) 的完全花， 而且雄蕊和雌蕊彼此相邻; 因此如果没有受精前识别花粉的机制， 那么同一朵花的雄蕊和雌蕊将有一个很强的趋势进行自 交受精。 长期的自 交或近 交将导致后代的适应性降低， 因此雌雄同株的植物采取了各种各样的繁殖策略来 避 免自 交 和 近 交， 其中 包 括自 交 不 亲 和 机 制( s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s i ) .自 交不亲和机制防止自 交， 而促进异型杂交。 通过自 交不亲和， 雌蕊可以区 分遗传 上相关的 ( 或自 身的) 和遗传上不相关的 ( 或非自 身的) 花粉。 这种自 身与非自 身的识别机制导致在柱头表面抑制自 身花粉的萌发或在花柱中抑制自 身花粉管 的生长。因此，自 交不亲和机制是一个受精前的繁殖屏障， 通过它， 不亲和的花 粉/ 花粉管被阻止，而不能传递精子细胞到子房形成双受精。 b r e a b a k e r ( 1 9 5 9 ) 调查t 7 1 个科6 0 0 个属的植物， 发现有2 5 0 个以上的属 存在自 交不亲和， 在显花植物中有1 / 3 至1 / 2 的科表现出自 交不亲和现象。 1 7 6 3 年从紫毛蕊花 ( v e r b a s c u m p h o e n i c e u m )中发现自 交不亲和现象 ( k o l r e u t e r , 1 7 6 3 ) 是有关s i 最早的 记载， 进入2 0 世纪， 孟德尔遗传理论阐明了 许多植物自 交不亲和的遗传基础， 促进了这一领域的深入研究。 血清学和同工酶分析， 使人 们加深了对自 交不亲和生化基础的了解，尤其随着近年来分子生物学方法的引 入，极大推动了人们对这一机制的深入理解。 首都师范大学硕士学位论文 1 . 2自 交不亲和的分类 根据自 交不亲和是否与花的多态性有关，si 可以 被分成同形和异形两种类 型。 在同型自 交不亲和中， 所有的个体产生相同的花，并且授粉的结果只与雄蕊 和雌蕊遗传上的相似度有关。 相比之下， 异形自 交不亲和的植物产生两种或三种 不同的花形态( 例如， 一朵花有短的花药和长的花柱或一朵花有长的花药和短的 花柱) 。为了授粉成功，花粉必须来源于遗传上不相关的个体，这种个体花药的 高度与将要被授粉的花柱的高度必须相同。 截止到目 前， 人们主要研究同形自 交 不亲和机制，并且取得了很大的进展，因此同形自交不亲和是本论文的重点。 在同形自 交不亲和 ( 后面就称为自 交不亲和) 中， 花粉和雌蕊之间进行的自 身和非自身的识别被一个或多个多态基因座控制，并且根据花粉表型的遗传控 制，又可将自 交不亲和进一步分为配子体自 交不亲和 ( g a m e t o p h y t i c s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , g s i) 与抱 子 体 自交 不 亲 和 ( s p o r o p h y t i c s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s s i ) 。 在配子体自 交不亲和中， 花粉落在柱头上时， 花粉并不与柱头乳突细胞发生 识别， 而是一些花粉形成花粉管穿过柱头， 进入花柱，由 于花粉管是由 花粉自 身 形成的， 是配子体的， 只具一个s 基因座; 而花柱是抱子体的， 含两个s 基因座。 因此g s 工 中， 实质上是花粉自 身的一个s 基因座与花柱中的两个s 基因座互相“ 识 别” ，来决定花粉管能否继续生长。当 花粉的一个 s 基因座与花柱的 任何一个 s 基因座相同时，则这种花粉为不亲和花粉，又叫 “ 自身花粉” ， 将被花柱拒绝: 只有花粉的一个s 基因座与花柱的两个s 基因座都不相同时， 这种花粉才是亲和 花粉，又叫 “非自 身花粉” 。因此，g s i 中，不亲和花粉被抑制在花柱中。 在抱子体自 交不亲和中， 花粉落在柱头上时， 主要是花粉外壁蛋白 与柱头乳 突细胞表面蛋白相互作用。 由于外壁蛋白是花粉在成熟时由花粉囊壁的绒毡层细 胞分泌的， 其带有产生花粉的亲本的两个s 基因座， 因此实质上是产生花粉的亲 本的 两个s 基因 座与柱头乳突细胞的两个s 基因 座之间相互“ 识别” 与“ 选择” ， 从而决定亲和与否。 当s 基因座之间不呈现显隐性关系时， 产生花粉的亲本和柱 头乳突细胞的s 基因座完全不同时， 受精亲和;当有相同的s 基因座时， 就会发 生不亲和现象。 但近几年的研究表明产生花粉的亲本的两个 s 基因座之间存在显 隐性关系，例如s 1 是显性、s 2 是隐性时，外壁蛋白为s 1 s 2 的花粉在s 2 s 3 的柱 甜樱桃自 交亲和基因s f b 4 ， 的分子鉴定 头上是可以萌发的，因为在花粉外壁蛋白中s z 基因 座不表现表型。在s s i 中， 不亲和花粉在柱头乳突细胞表面受抑制。 1 . 3 三种类型的s i机制 截止到目 前，人们己 经对 4个显示 g s 工的科，茄科( s o l a n a c e a e ) , 蔷薇科 ( r o s a c e a e ) ， 玄参科( s c r o p h u l a r i a c e a e ) 和罄粟科( p a p a v e r a c e a e ) 和 1个显示 s s i 的属，芸蓝属 ( b r a s s i c a ) ，进行了 深入的分子水平研究。在这5 个科属中， 一个单独的多态基因座，叫作 s - 基因座 ( s - l o c u s ) ，控制着自 交不亲和反应， 决定着 s i反应的特异性。由于 s - 基因座中包括多个基因，因此用 “ 单元型” ( h a p l o t y p e ) 来描述s - 基因座的变体， 而“ 等位基因” 被用来描述s基因 座中 基因 的 变体( m c c u b b i n e t a l ., 2 .0 0 0 a ) . 在过去的二十年里，自 交不亲和研究己 取得了 很大进展。 在鉴定 s - 基因 座 中控制s i 反应特异性的基因的过程中，比较上述5 个科属s - 基因座中在雌蕊中 表达的基因时， 发现了在生化水平上明 显不同的三种s i 机制。 茄科， 蔷薇科和玄 参科显示相同的s i 机制 ( 称为茄科型g s i 机制) ， 婴粟科显示另一种g s 工 机制， 而芸蓝属显示s s i 机制。 在茄科型和鉴粟科型的g s i 机制中， 已 经鉴定出 控制雌 蕊特异性的基因， 分别为s r n a s e 荃因和s - 基因 ( s - g e n e ) 。随着最近鉴定出决 定花粉特异性的基因， 人们对茄科型g s i 机制有了更深入的了 解， 茄科型g s i 机 制涉及s - ma s e 降 解自 身花粉管r n a 的过程。 婴粟科型g s 工 机制涉及花粉中 信号 转导和级联放大的过程， 它包括许多已 知的信号转导组分 ( 例如， 钙离子， 磷酸 肌醉，蛋白 激酶和磷酸酶) 。在芸鉴属的s s i 机制中，己 经鉴定出控制雄性特异 性的基因 是 “ s - 基因 座富含组氨酸的蛋白( s - l o c u s c y s t e i n e - r i c h p r o t e i n , s c r ) / s - 基因座蛋白 一 1 1 ( s - l o c u s p r o t e i n - 1 1 , s p 1 1 ) , 控制雌性特异性的 基因 是s - 基因座受体激酶 ( s - l o c u s r e c e p t o r k i n a s e , s r o. 芸盆属型s s i 反应涉 及在柱头乳突细胞中的受体激酶( s r k ) 与花粉中的配体.s c r / s p 1 1 之间互相作用， 引发信号转导和信号级联放大的过程。 本论文的重点是配子体自 交不亲和中茄科型g s i 机制， 因此以下主要介绍茄 科型g s i 机制中的研究进展。 首都师范大学硕士学位论文 最初在山德氏烟草( n i c o t i a n a s a n d e r a e ) 中发现了茄科型 g s i ( e a s t a n d m a n g e l s d o r f , 1 9 2 5 ) ， 截止到目 前， 利用分子生物学方法， 在茄科的四 个属中( 番 茄属l y c o p a r s i c o n ， 烟草属n i c o t i a n a , 矮牵牛属p e t u n i a ， 茄属s o 1 a n u m ) ,蔷 薇科的三个属中 ( 苹果/ 海棠属m a l e s ，李属p r u n u s ,梨属p y r e s ) ，和玄参科的 一个属 ( 金鱼草属a n r i r r h i n u m )中 研究了 茄科型g s i 。 拒绝自 身花粉出 现在花 粉管在花柱中伸长生长的阶段， 拒绝的时间与花粉管生长从比 较慢的 ( 自 养的) 生长阶段过渡到加速 ( 异型分裂) 生长阶段的时间相吻合. 人们推测花粉管生长 速率增加是由于花柱组织逐渐增加的向花粉管提供营养。 经典的遗传分析显示花粉和雌蕊在s i 中可以 独立变异，分别导致花粉部分 或雌蕊部分的自 交亲和突变体。 这一发现明确的表示独立的不同基因分别控制着 花粉和雌蕊的 s i功能。最近对雌蕊一 或花粉一 特异性自交亲和突变体的研究 ( t h o m p s o n e t a l . ，1 9 9 1 : s a s s a e t a l . ， 1 9 9 7 ; g o l z e t a l . ， 1 9 9 9 ) 和茄科植物 的转化试验( l e e e t a l . ， 1 9 9 4 ; m u r f e t t e t a l . ， 1 9 9 4 ; d o d d s e t a l . ， 1 9 9 9 ) 都 表明雌蕊和花粉的s i 表型是由不同基因控制的，分别命名为雌蕊决定子基因和 花粉决定子基因。 因此只有分别鉴定出雌蕊决定子荃因 和花粉决定子基因， 才能 更好的理解它们之间到底是如何特异性的作用，从而产生自 交不亲和反应的。 1 . 4 茄科型g s 工 机制中雌蕊决定子的鉴定 人们推测雌蕊决定子应具备以 下特征: ( 1 ) 雌蕊决定子必须展示等位基因 特 异性序列多态性; ( 2 ) 必须特异地在雌蕊中 表达。 首先在花烟草( n i c o t i a n a a l a t a ) 中鉴定出在分子量和等电点上都显示等位基因特异性多态的雌蕊特异性蛋白 ( b r e d e m e i j e r a n d b l a s s , 1 9 8 1 ) ， 将这 种蛋白 的c d n a 进行克隆 测序并 推断出 相 应的第一个这样的蛋白 序列( a n d e r s o n e t a l . , 1 9 8 6 ) 。 这些蛋白最初被命名为 s - 等位基因相关蛋白( s - a l l e l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n s ) 或s - 蛋白( s - p r o t e i n s ) , 相应的基因被命名为雌蕊s 基因( p i s t i l s - g e n e ) 。 用相似的方法从茄科的 其它 种中( a i e t a l . , 1 9 9 0 ; c l a r k e t a l . , 1 9 9 0 ) 和蔷薇科的几个种中( s a s s a e t a l . , 1 9 9 3 ; i s h i m i z u e t a l . , 1 9 9 6 ) 也鉴定出了s - 蛋白并分离了它的c d n a 序列。 比较茄科 s-蛋白的序列揭示:茄科 s-蛋白包括 5个保守区和 2个高变区 甜樱桃自 交亲和基因s f b 4 ， 的分子鉴定 ( i o e r g e r e t a l . , 1 9 9 1 ; t s a i e t a l . , 1 9 9 2 ) 。 由 于 存 在明 显 的 保守 区 ， 因 此 可以使用 p c r方法克隆 s-蛋白的基因组和 c d n a片断，利用这种方法 x u e e t a l . ( 1 9 9 6 ) 克隆了西班牙金鱼草 ( a n t i r r h i n u m h i s p a n i c u m ) 中的 s - 蛋白同源 物的c d n a 序列，并且发现西班牙金鱼草展示与茄科和蔷薇科相同的g s i 机制。 m c c l u r e e t a l . , 1 9 8 9 ) ，这一发现引发随 后在体外培养中确定s - 蛋白 有r n a s e 活性( m c c l u r e e t a l . , 1 9 8 9 ; s i n g h e t a l . , 1 9 9 1 ) 。 现已 发现r n a s e t 2 的两个区域 ( 每个都包括一个有催化性的组氨酸) 存 在于所有的s - 蛋白中， 并且相当于i o e r g e r e t a l . ( 1 9 9 1 )鉴定的茄科s - 蛋白5 个保守区中的两个保守区。 因此， s - 蛋白 被重新命名为s - r n a s e ， 而相应的基因 被重新命名为s rn a s e 基因。在体外培养过程中，s - r n a s e 没有显示具有任何底 物特异性( s i n g h e t a l . ，1 9 9 1 ) 。 通过转基因试验，人们了解了 s - r n a s e在 s i反应中的作用( l e e e t a l . , 1 9 9 4 ; m u r f e t t e t a l . ，1 9 9 4 ) 。转基因试验显示:将一个外源的新的s - r n a s e 等 位基因引入到转基因植物中就足够使这个转基因植物拒绝与被引入的 s rn a s e 基因有相同基因型的花粉。 相反，用反义r n a 的方法抑制内源s r n a s 基因表 达可以使这个转基因植物不能拒绝与受抑制的内 源等位基因 有相同 基因型的花 粉。 为了理解 sr n a s e介导的自我拒绝反应的生化机理，有必要知道是否 s - r n a s e的 r n a s e活性对于拒绝自身花粉是必须的。利用位点指导诱变 ( s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s ) 方法用一个天冬酞胺密码子置换掉膨大矮牵牛 ( p e t u n i a i n f l a t e ) s 3 riv a s e 的两个有催化活性的组氮酸残基中的一个的密码 子， 使得这种转基因植物虽然产生s 3 r n a s e ， 但s 3 rn a s e 没有r n a s e 活性，因 此这种转基因植物不能拒绝s 3 花粉( h u a n g e t a l . ，1 9 9 4 ) 。与这个试验结果相 首都师范大学硕士学位论文 一致的发现是: 一个l y c o p e r s i c o n p e r u v i a n a w 的自 交亲和品种产生了 一个没有 催化活性的5 3 - r n a s e( 这种5 3 - r n a s e 的一个有催化活性的组氨酸残基被精氨酸 置换掉7) ( k o w y a m a e t a l . , 1 9 9 4 ; r o y o e t a l . , 1 9 9 4 ) 。从以上两个试验结 果可以 看出s - r n a s e 的r n a s e 活性对于拒绝自 身花粉是必需的， 因此人们推测在 自 我花粉管中s - r n a s e 通过降解自 身花粉管的r n a 来抑制花粉管生长。 m c c l u r e 等(1 9 9 0 )得到了与这个推测相一致的试验结果:他们显示花粉管r r n a 被降解 只发生在自 我授粉后，但在杂交授粉后不发生。 确定了s-r n a s e 的ba s e 活性对于拒绝自 身花粉是必需的后， 人们开始研究 s - r n a s e 中决定s 等位基因特异性的区域。因为s-r n a s e 是糖蛋白， 而糖蛋白 在 n - 连接的聚糖数目 和位置上都有变化， 所以s-r n a s e 具有s 等位基因特异性可能 是由 于在碳水化合物部分的变化所致或是由于蛋白主链上发生变化所致。 用转基 因的方法制造了一个非糖基化的 膨大矮牵牛的 s 3 - ba s e( 用天冬氨酸来置换唯 一的n 一 糖基化位点上的天冬酞胺残基) ， 试验发现:非糖基化的 s 3 - r n a s e具有 与野生型的s 3 - ba s e 一样的ba s e 活性，可以 象野生型的s 3 - ba s e 一样拒绝 s3花粉( k a r u n a n a n d a a e t a l . ，1 9 9 4 ) 。因此，s-r n a s e 具有s 等位基因 特异性 不是由于碳水化合物的变化，而是由于蛋白质主链中的变化。 s - r n a s e的一个显著特点是具有高度的等位基因序列多态性，因此在 s - r n a s e 的蛋白 质中分布着大量的变化位点; 然而， 最高变的位点集中在两个区 域。最初在比 较茄科的 .- ba s e时，鉴定出了这两个高变区，分别叫作 h v a和 h v b ( i o e r g e r e t a l . ，1 9 9 1 ; t s a i e t a l . ，1 9 9 2 ) 。随后发现h v a 和h v b 这两个 区 域 也 是 金 鱼 草s - r n a s e 的 高 变 区( x u e e t a l . ， 1 9 9 6 ) ， 并 且 蔷 薇 科 - r n a s e 中 存在一个与h v a 区 相对应的 高 度变异区 域r h v ( i s h i m i z u e t a l . ， 1 9 9 8 ; m a t t o n e t a l . ， 1 9 9 7 ) 。茄科和蔷薇科s-r n a s e 的晶体结构显示: h v a , h v b 和r h v 区都 暴 露 在 蛋白 质 表 面， 并 可以 接 近 溶 剂( i d a e t a l . , 2 0 0 1 ; m a t s u u r a e t a l . , 2 0 0 1 ) o 人们利用结构域交换实验 ( d o m a i n - s w a p p i n g e x p e r i m e n t s ) 来确定h v a , h v b 和 - r n a s e 的其它区域在决定s 等位基因特异性中 所起的 作用( k a o a n d m c c u b b i n , 1 9 9 6 ; m a t t o n e t a l . ，1 9 9 7 ; z u r e k e t a l . ，1 9 9 7 ) 。当使用s o l a n u m c h a c o e n s e 的两个s-r n a s e , s 1 1 - r n a s e 和5 1 3 - r n a s e(它们有9 2 % 的 氨基酸序列相似性， 只有十个氨基酸不同) 构建嵌合s xn a s e 基因时， 发现h v a 和h v b 区在一起就足 甜樱桃自 交亲和墓因s f b 4 ， 的分子鉴定 够赋予嵌合s - r n a s e 新的等位基因特异性( m a t t o n e t a l . ，1 9 9 7 ) 。也就是说， 当s 1 1 - r n a s e 的r v a 和h v b 氨基酸被改变成s 1 3 - r n a s e 的h v a 和h v b 氨基酸时， 产生嵌合.r n a s e 的转基因植物将拒绝s 1 3 花粉， 而不拒绝5 1 1 花粉。 总之， h v a 和h v b 最有可能是s - r n a s e 中决定s 等位基因特异性的区域。 从上述的试验结果可以总结出:茄科、蔷薇科和玄参科 s-基因座中的雌蕊 决定子基因就是s r n a s e 基因， 其产物s-r n a s e 由 花柱组织分泌， 并且充当一种 细胞毒素降解不亲和花粉管的r n a 。 因此茄科型g s i 机制又可称为以s-r n a s e 为 基础的g s i . 1 . 5 茄科型g s i 机制的花粉决定子 1 . 5 . 1 茄科型g s i 机制中花粉决定子的鉴定 在所有上述确定s rn a s e 基因功能的转基因实验中， 对s rn a s e 基因的操作 只影响雌蕊的s i 功能， 而不影响花粉的s i 功能， 这一结果与认为.s r n a s e 基因 不控制花粉 s i特异性的观点相一致。s a s s a e t a l . ( 1 9 9 7 ) 显示日 本梨( p y r e s s e r o t i r n a , j a p a n e s e p e a r ) 的一个自 交亲和品种中缺失了s 4 rn a s e 基因， 但这一 缺失只影响雌蕊的s i 功能， 不影响花粉的s i 功能。 当茄科型g s i 的雌蕊决定子 被确定后，人们开始鉴定控制雄性特异性的花粉决定子。 人们推测花粉决定子应具备以下特征: ( 1 )与雌蕊决定子一s r n a s e 基因紧 密连锁; ( 2 ) 显示高水平的s 单元型特异性序列多态性; ( 3 ) 特异在花粉中表达。 因此鉴定花粉决定子的一个方法就是: 寻找花粉中 表达的基因， 而且这个荃因还 展现s 单元型 特异性限 制片断长度多 态性。 利用r n a 区别显示( r n a d i f f e r e n t i a l d i s p l a y ) 和减法杂交 ( s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a i t i o n )的方法己 经在花烟草和 膨大 矮 牵牛中 鉴定了 大量符合这样条件的 基因( d o w d e t a l . , 2 0 0 0 ; l i e t a l . , 2 0 0 0 ; m c c u b b i n e t a l . ， 2 0 0 0 b ) ， 然后用重组分析检验这些基因是否与s r n a s e 基因紧密连锁。由于茄科植物 s-基因座处于亚着丝粒附近( e n t a n i e t a l . , 1 9 9 9 ) ， 所以s-基因座的重组被抑制，因此需要使用大量植株来精确估计这些基 因与s - r n a s e 基因的连锁程度。结果发现膨大矮牵牛的9 个花粉表达基因( w a n g 首都师范大学硕士学位论文 e t a l . ， 2 0 0 3 ) 和花烟草的1 个花粉表达基因( l i e t a l . ，2 0 0 0 ) 与s r n a s e 基因 连锁。 比 较上述这些基因的等位基因 序列相似性发现: 所有这些基因推断的 氨基 酸序列都展示非常低的等位基因序列多态性。 对膨大矮牵牛的s 2 - 基因座区域进 行染色体步移 ( c h r o m o s o m e w a l k i n g )分析，结果显示与s rn a s e 基因紧密连锁 的9 个基因被定位在s r n a s e 基因至少约1 8 0 k b 上游或至少约7 0 0 k b 的下游， 有 的 基因与s r n a s e 基因 之间的距离甚至达到4 m b ( k a o a n d t s u k a m o t o , 2 0 0 4 ) . 因 此， 用这种方法所鉴定的花粉表达基因 没有一个可能是花粉决定子基因， 而这 些基因之所以具有等位序列多态性只是由于它们与高度多态的 s-基因座紧密连 锁。 另外一种鉴定花粉决定子的方法是: 由于花粉决定子应该与s rn a s e 基因紧 密连锁， 因此可以通过对包括s - r n a s e 基因的s-基因座进行测序， 鉴定s - r n a s e 基因附近的基因，来寻找花粉决定子。l a i e t a 1 . ( 2 0 0 2 ) 对西班牙金鱼草包括 s 2 - r n a s e 基因的一个 6 3 k b的区域进行测序，结果鉴定出了除 s 2 - r n a s e 基因以 外的1 0 个开放读码框( o p e n r e a d i n g f r a m e s , o r f s ) ， 其中4 个编码逆转录转 座子， 在剩下6 的o r f s 中只有一个表达于花药 ( 绒粘层和花粉)中。 这个基因 定位在s 2 r n a s e 基因下游约9 k b 处， 编码一个包括f - b o x 序列的蛋白， 被命名 为s-基因座f - b o x 基因 ( a . h i s p a n i c u m s - l o c u s f - b o x g e n e , aaa.从基因 型为s i s 5 的品种中分离了一个编码as l f - s 2 同源物的c d n a 片断，从这个片断 所推断的氨基酸序列与a h s l f - s 2的氨基酸序列有 9 7 . 9 % 的相似性。但从这个研 究中还不能判断a h s l f - s 2 和它的同 源物 ( 命名为a mu- s 2 l ) 是否为等位基因。 z h o u 等 ( 2 0 0 3 )从金鱼草中鉴定了4 个a h s l f 等位基因 ( 以 双 s 4 和s 5 ) ， 但 这4 个as l f 等位基因的氨基酸序列有高于9 7 % 的序列相似性， 而且结果显示这 次试验所鉴定的a h s l f - s 基因就是l a i e t a l . ( 2 0 0 2 ) 报道的a h s l f - s 2 l 基因。 u s h i j i m a e t a 1 . ( 2 0 0 3 ) 和 e n t a n i e t a l . ( 2 0 0 3 ) 也分别试图 通过对扁桃 ( p r u n u s d u l c i s a l m o n d ) 和梅( p r u n u s m u m e , j a p a n i e s e a p r i c o t ) 的s- 基因 座进 行测序来鉴定花粉决定子。 一个扁桃的约7 0 k b 的 染色体区( 其包括s c- ma s e 基 因) 被认为是s- 基因座的功能区( u s h i j i m a e t a l . ，2 0 0 1 ) ，理由 是: 第一， 基 因组d n a 印记分析 ( g e n o m i c d n a b l o t a n a l y s i s ) 显示这个区 域的 序列在不同 s-单元型之间是高度变异的，而这个区域的侧冀序列在不同 5-单元型之间是高 甜樱桃自 交亲和基因s f b 4 的分子鉴定 度相似的; 第二， 一个在这个区域有染色体缺失的自 交亲和突变体在花粉和雌蕊 功能上都是有缺陷的。 对这个约7 0 k b 的区域测序， 结果显示: 在这个约7 0 k b 的 区域除了.s r n a s e 基因外， 还存在 1 0 个o r f s o 就像在金鱼草的s 2 - 基因座中一 样， 一些o r f s 编码逆转录转座子。在剩下的o r f s 中，只有两个表达于花粉中， 有趣的是， 这两个o r f 都编码f - b o x 蛋白。 其中一个f - b o x 基因， 叫作s 单元型 特异f - b o x 基因 ( s - h a p l o t y p e - s p e c i f i c f - b o x g e n e , s f h)，展示t与s - r n a s e 基因 相似的高水平的 等位基因 序列多态性。 s a , s b , s c和s d 单元型s f b 等位基因 之间的氨基酸序列相似性从6 8 . 4 % 到7 6 . 4 % ，这4 个 s 单元型s-r n a s e 基因之间 的氨基酸相似性从5 5 . 6 5 到7 7 . 1 % ( y a m a n e e t a l . ， 2 0 0 3 a ) 。另一个f - b o x 基因， 叫 作s- 基因 座f - b o x 基因 ( p . d u l c i s s-l o c u s f - b o x g e n e , p d s l f ) ， s c 和s d 单元型s l f 等位基因的 氨基酸序列有9 5 . 1 % 的相似性。s f b 是花粉决定子的一个 很好的候选者，因为 ( 1 )它与s - r n a s e 基因物理的连锁，在研究过的4 个s 单 元型中，s f b定位在距 s-r n a s e 基因 3 0 k b以内的位置上;( 2 )它特异的表达于 花粉中; ( 3 ) 它显示一个高水平的 等位基因序列多态性。 相比 之下， p d s l f 尽管 物理地与s-r n a s e 基因连锁， 但它不仅在花粉中表达还在花柱中 表达， 而且有低 水平的等位基因序列多态性， 因此不太可能是花粉决定子。 应该注意的是: p d s l f 被如此命名是为了强调 p d s l f显示了与在金鱼草中鉴定的 a h s l f ( l a i e t a l . , 2 0 0 2 )有近似的低水平的等位基因序列多态性， 而不是为了暗示p d s l f 是a b s l f 的同 聚物 ( o r t h o l o g ) 。实际上，s f b 和p d s l f 的 氨基酸序列与a b s l f 的 只有小 于2 5 % 的相似性。 e n t a n i e t a l . ( 2 0 0 3 ) 在梅的一个包括s 7 - r n