磁性氧化硅复合微球表面氨基的定量检测方法研究优秀毕业论文 参考文献 可复制黏贴.pdf

上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 1 - 第一章 绪论 1.1 磁性纳米微球的制备与生物应用 经过近四十年的发展， 磁性纳米材料作为一种新兴材料在生命科学， 食品， 化工，环境等领域取得了非常重要的成果。其中磁性纳米复合微球更是由于在 生物医学领域有广阔的应用前景而备受关注。 表面氨基修饰是磁性纳米微球生物应用最基本与常用的官能团， 已有大量 的偶联化学方法是基于表面氨基基团基础发展起来的。然而表面氨基的定量是 否准确是关系到偶联策略与方案的关键因素，因此其表面修饰基团的定量分析 显得尤为重要，特别是对于微量样品的微量氨基检测更有实际意义。 本章简要总结了磁性微球的研究进展，包括其定义、分类和生物应用等， 对固相载体表面氨基基团的定量检测方法进行了系统的综述，并在前人工作基 础上提出本论文的设计思路及主要研究内容。 1.1.1 磁性功能微球的定义与分类 所谓磁性复合微球是指将无机磁性纳米颗粒与有机高分子、 生物大分子以 及无机物等非磁性材料以一定的结构相复合，并通过化学反应对微球进行功能 化修饰，从而得到能够满足实际应用需要且对外磁场具有高响应性，便于用外 磁场进行操控和分离的复合微球1。 对于磁性微球，有不同的分类方法对其进行分类： 按照微球的结构进行分类可将其分成三类（如图 1- 1） ：一是以磁性材料为 核，非磁性材料为壳的核壳式结构（a） ，二是以非磁性材料为核，磁性材料为 壳的核壳式结构（b） ，三是内外层皆为非磁性材料，中间层为磁性材料的夹心 式结构（c） 。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 2 - abc 图 1- 1 磁性复合微球的结构分类示意 fig.1- 1 classification of polymer microspheres 按照其包覆/基质材料来分类可将磁性复合微球分成三类：以聚苯乙烯磁 性微球为代表的高分子复合微球，以氧化硅磁性微球为代表的无机磁微球以及 以葡聚糖或脂质体包被磁性颗粒为代表的大分子复合磁性微球。表 1- 1 列出了 不同包覆材料的磁性复合微球。 表 1- 1 磁性复合微球不同包覆材料 table 1- 1 classification of coated materials 高分子材料 无机材料 大分子材料 聚苯乙烯 2 , 3 ，聚乙二醇 4 ， 聚乙烯醇 5 二氧化硅 6 ，金 7 葡聚糖，壳聚糖 8 聚乙烯亚胺 9 ，聚丙烯酸 1 0 脂质体，磷脂 1 1 1.1.2 磁性微球的生物学应用 磁性纳米微球在生物医学领域的应用可以概括地分为体外应用和体内应 用。磁性微球在体外应用方面，主要是用于细胞、蛋白质、dna/rna、细菌及 病毒等的分离、纯化、富集以及分析检测等的载体或者信号标记物。在体内应 用方面，磁性微球除了可用来实现药物的靶向给药外，还可以用来辅助疾病的 诊断和治疗。下面将简要描述一下主要的应用方向。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 3 - 1.1.2.1 磁性微球在生物分离中的应用 1.1.2.1.1 细胞分离 细胞磁免疫分离方法是细胞生物学研究中的重要方法之一，大量的磁免疫 分离都是基于磁性微球表面的抗体与细胞抗原之间的相互作用来实现细胞的快 速分离的1。 1.1.2.1.2 核酸的提取 核酸（dna和 rna）的分离与提取是生物技术中的一项艰巨而繁重的任 务。近年来，采用氧化硅磁珠吸附法来分离 dna/rna的报道日趋增多。其基 本原理是核酸分子与磁微球表面的硅羟基相互作用形成复合物，再在磁场的作 用下与提取试剂联合作用实现核酸分子的提取。在提取过程中，主要经历了三 步过程，即结合（binding） ，洗涤（washing） ，洗脱（elution） 。整个提取过程 如图 1- 2 所示。通过优化结合条件，dna可从复杂基质中被吸附到磁珠上，外 加磁场使被吸附 dna与未被吸附的分子分离，纯化的 dna被洗脱后，则可进 行下游应用如 pcr 扩增，dna序列分析等。在氧化硅磁珠的基础上，不少学 者引入了其他官能团，获得了带羧基、氨基等的磁性微球12, 13并将其用于了核 酸的提取，也获得了良好的效果。 图 1- 2 核酸提取过程 fig.1- 2 magnetic separation of dna 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 4 - 1.1.2.2 磁性微球在临床诊断和治疗中的应用 1.1.2.2.1 靶向给药 靶向给药，也可称为可控药物释放。通常磁靶向给药系统由表面修饰过的 磁性纳米微球和药物组成，药物通过物理吸附、包埋、化学键合等方式结合在 磁性纳米颗粒上， 磁性纳米微球药物载体可以在梯度外磁场的作用下运动导向， 将药物运送到人体预定的病变部位进行控制释放，这样即可以减少毒副作用， 不杀死正常细胞，又可降低药物用量，大大提高了药物效率，被形象地称为“生 物导弹” 。磁靶向给药的典型过程如图 1- 3 所示。 图 1- 3 靶向给药示意图14 fig.1- 3 scheme of drug targeting using magnetic nanoparticles 1.1.2.2.2 磁热疗 磁性纳米微球在交变磁场下能够通过弛豫产生大量的热量，利用这种现象 杀死肿瘤细胞的手段就称之为磁热疗。1999 年，jordan研究小组对比了多种细 胞对葡聚糖和 sio2修饰的 fe3o4的细胞内致热治疗效果的影响15。发现 sio2 修饰的 fe3o4粒子更适合于细胞内致热治疗肿瘤。 kobayashi小组开展了磁脂质 体治疗各种肿瘤的研究。作者采用阳离子脂质体修饰粒子得到阳离子型的磁脂 质体（cml） 。研究发现，cml对研究的各种肿瘤都具有较好的疗效16。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 5 - 图 1- 4 磁热疗示意图17 fig.1- 4 scheme of magnetic hyperthermia 1.1.2.2.3 磁共振成像 临床磁共振成像英文名为“ magnetic resonance imaging” ，简称 mri。磁共 振成像（mri）技术由于可以用来对生物内脏器官和软组织进行无损的快速检 测，它已经成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤的最为有效的临床诊断方法之 一。肿瘤的早期诊断（包括微小肿瘤与肿瘤转移灶）是有效地降低恶性肿瘤致 死率的关键。通常选择合适的造影剂来增强病变组织与正常组织的图像之间的 对比度以提高病变组织的清晰度。 磁共振造影剂的主要工作原理是可以有效地改变病变组织中质子的自旋 自旋弛豫时间，从而达到增强对比度的效果。早在 20 世纪 80 年代初，研究者 就开展了磁性纳米粒子作为造影剂在核磁共振成像中的应用研究，这些磁性纳 米粒子的表面一般都修饰有葡聚糖、淀粉、血清蛋白、sio2、聚乙二醇等生物 相容性分子等。根据其尺寸大小不同，一般可将它们分为超顺磁性氧化铁 （superparamagnetic iron oxides, spios）和细小超顺磁性氧化铁（ultra- small superparamagnetic iron oxides, uspios）两种。spios 可以用于各种肿瘤及其他 疾病的检测，如肝脏肿瘤、肝硬化和肝炎等。uspios由于血液半衰期较长，而 且 t1效应明显，因此可用于检测和诊断血管瘤、心肌萎缩等方面的疾病18- 21。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 6 - 1.1.2.2.4 临床免疫诊断 在免疫学研究中，利用抗体抗原特异性可逆结合原理可以测定免疫活性 组分的存在和浓度。免疫检测发展到今天，如何提高免疫检测的灵敏度，如何 能尽快得到可靠的检测结果已成为人们不断追求的目标。将磁性纳米粒子用于 免疫检测，有助于人们实现这个目标。由于磁性纳米粒子可通过表面修饰提供 足够多的表面结合位点以使其与抗体等生物分子结合，进而可实现生物组分的 识别。并且，在外加磁场的作用下能快速富集，在短期内能得到浓缩、纯净的 样品，有助于缩短检测时间，提高检测效率。thertz 等人22就是利用了这种思 想，构建了一种三明治夹心结构，利用超顺磁性纳米粒子标记的单克隆抗 tsh 表面病毒抗体来检测 tsh。他们发现，施加外加磁场可增加磁性复合物的组装 密度，进而大大提高了检测的灵敏度使之达到 0.02 pg/ml，比未加磁场的提高了 整整 100 倍，如图 1- 5 所示。 图 1- 5 纳米粒子标记的单克隆抗促甲状腺激素（tsh）表面病毒抗原对 tsh 的检测结果 a 有外磁场；c 无外磁场22 fig.1- 5 tsh assay a (open diamonds) performed without magnetic concentration and c (filled triangles) after the concentration of diluted magnetic complexes through the hgms system represented as the number of particles/m2 as a function of log (tsh number of molecules per assay) guesdon 等23以磁性聚丙烯酰胺凝胶作载体，表面结合抗兔 igg，对血清 中的抗体进行了定量测定。 沈荣森等24在磁性聚丙烯醛微球表面直接固定抗体， 用于甲状腺素、甲状腺球蛋白等放射性免疫检测分析，非特异性结合低，重复 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 7 - 性好。 1.1.2.3 其他生物学应用 除了上述提到的一些应用，磁性微球在其他生物医学领域也有很广泛的应 用，例如，基因测序、酶的固定化、组织工程、生物传感器等。由于篇幅所限， 在此不做详细的介绍。随着人们研究的深入和更多生物医学问题的提出，磁性 纳米微球在生物医学领域也将发挥更大的作用。 1.2 磁性氧化硅微球制备及表面功能基团的修饰 在对磁性纳米颗粒进行无机物修饰方面，氧化硅包覆磁性微球受到了人们 的广泛关注。氧化硅具有良好的生物相容性、在生理条件下不降解的特性以及 硅羟基的易于修饰性25, 26。制备氧化硅包覆的磁性复合微球的传统方法大都通 过 st? ber 过程， 它是用溶胶- 凝胶法将四乙氧基硅烷等前驱体水解和缩合原位生 成氧化硅。其他制备方法还有硅酸溶液沉淀法和微乳液法等26。 由 1.1.2 节可见，磁性复合微球要在生物医学领域应用时，必须和蛋白质、 酶、核酸、抗体、药物等生物分子发生相互作用，这种作用常常通过分子表面 特有的功能基团来实现。而要使磁性微球表面具有特有的功能基团，表面修饰 是一种主要的途径。氧化硅表面的进一步修饰是利用硅羟基作为反应的位点， 修饰分子可直接与硅羟基反应，也可先用硅烷偶联剂对氧化硅表面进行修饰， 在此基础上也可进行进一步的修饰。修饰的功能基团主要有氨基、羧基、环氧 基、羟基、酰胺基、醛基等。 在这些表面功能团中较为常用的表面基团是羧基和氨基，他们具有以下优 点：1）经过长时间储存，这两种功能基团仍然非常稳定；2）目前已对生物配 体和这两种基团偶联的化学方法进行了广泛的研究，每种基团均有多种较为成 熟的偶联方法可供选择。 对于微球表面氨基修饰研究，文献报道最多的是先用硅烷偶联剂与硅羟基 反应。典型的硅烷偶联剂其分子结构可用 y (ch2)n si x3表示，其中 x 表示 烷氧基或卤素，它通过与硅羟基的水解反应使硅烷偶联剂连接到氧化硅表面。 y 表示氨基、羧基、巯基等功能基团，它既可用于连接生物分子，也可作为进 一步修饰的活性反应位点25。早在上个世纪末，moon等人27就研究了 4 种胺 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 8 - 化试剂对氧化硅表面的修饰，其结构如图 1- 6 所示。结果显示，3 号试剂所得的 包覆层最为均一。文献还指出，3 号试剂形成亚胺结构后能完全水解再生，使 材料的性能保持稳定。 图 1- 6 一些常用的硅烷偶联剂27 fig.1- 6 some commonly used silane coupling agents 1.3 固相载体表面氨基基团的定量检测方法 表面氨基修饰是微球生物应用最基本与常用的官能团，已有大量的偶联化 学方法是基于表面氨基基团基础发展起来的。然而表面氨基的定量是否准确是 关系到偶联策略与方案的关键因素，因此其表面修饰基团的定量分析显得尤为 重要，特别是对于微量样品表面微量氨基的定量检测更有实际意义。 目前，人们在磁性微球的定性表征方面有非常丰富的表征手段，主要的方 法有 sem、tem、tg、ir、xrd 等。对其表面氨基功能基团的定量分析方面 也有不少报道。主要有滴定法、显色法、荧光法等，下面逐一进行论述。 1.3.1 滴定法 对于固相载体表面的功能基团， 滴定法是一种广泛应用且简便快速的方法， 其基本原理是通过酸与固相载体表面的氨基发生化学反应，溶液中 ph 发生变 化，利用指示剂在某一固定条件（如某一 ph 范围）时变色来指示终点，或者 是通过测量两个电极的电位差，根据电位差的突然变化来确定滴定终点。其原 理如图 1- 7 所示： 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 9 - nh2nh2nh2 3hcl+ nh3+nh3+nh3+ + 3cl- 图 1- 7 滴定法原理图 fig.1- 7 scheme of titration 当达到滴定终点时，利用消耗盐酸溶液的体积等数据通过公式计算得到固 相载体表面的氨基密度。李德亮28等人用盐酸乙醇标准溶液滴定 ?- 3 氨丙基三 乙氧基硅烷（aptes）偶联剂及其修饰的二氧化硅纳米颗粒表面氨基，他们选 用乙醇作为盐酸标准液的溶剂，有效的避免了氧化硅颗粒表面氨基硅烷的水解 反应，并且使指示剂的显色变化达到最明显。与此同时，通过比较甲基橙、甲 基红、溴酚兰、溴甲酚绿、百里酚兰、溴甲酚绿- 甲基红等多种指示剂，最终选 定了百里酚兰作为指示剂。从他们对于样品的测试结果来看，样品表面的氨基 密度检测到的数量级范围在 10- 1- 10mmol/g之间。takeshi yamauchi29等人也用 滴定法，选择了盐酸水溶液作为标准溶液滴定表面接枝有超支化聚合物 pamam 的氧化硅纳米颗粒，以苯酚作为指示剂。他们样品的表面的氨基密度 检测到的数量级与李德亮课题组得到的是相同的。由于这两个课题组所使用的 固相载体均为纳米氧化硅颗粒，这是一种比表面积比较大的材料，因此，材料 表面通过硅烷偶联剂接枝氨基，偶联数目就会相当可观，而且 takeshi yamauchi 课题组接枝的氨基为枝化聚合物，表面氨基的数目理论值是按照每代产物呈倍 增长。由于以上诸原因，对于固相载体表面氨基密度比较高的材料，此方法是 可行的，但是当表面氨基密度很低时，此种方法的可行性就会受到一定限制。 除此以外，检测方法的专一性也是一个很重要的问题，如果用此种方法进行滴 定，酸不仅会与伯胺发生反应，而且会与仲胺，叔胺也发生反应，这就不能满 足只是检测伯胺的特异性的需要。另外，如果固相载体表面接有其他酸性或者 碱性的功能基团，同样会严重影响滴定结果。 除了用指示剂来进行酸碱滴定氨基外，黄炜东等人30用电导滴定的方法检 测了氨基聚苯乙烯微球。他们加入过量的盐酸与聚苯乙烯微球表面的氨基反应 形成盐酸盐，随后用 naoh 溶液对混合液进行滴定。naoh 首先与溶液中的过 量盐酸发生中和反应， 电导率由于h+的中和而迅速减小， 当过量的hcl被naoh 完全中和时，电导率降至最小。然后 naoh 溶液再中和微球表面的盐酸盐 r nh3 cl， 这一滴定过程的电导率基本保持不变,因此出现第一个转折点。 当 naoh 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 10 - 溶液与微球表面的盐酸盐 rnh3 cl反应完成时，电导率又由于过量的 naoh 加入而迅速增大，出现第二个转折点。两个转折点间的 naoh 用量相当于滴定 了聚苯乙烯微球表面氨基的含量。其电导滴定曲线如图 1- 8 所示。此种方法得 到的结果数量级为 10- 1mmol/g。 图 1- 8 电导滴定曲线30 fig.1- 8 conductometric titration curve 1.3.2 显色法 除了滴定的方法外，还有很多显色方法用来测试固相载体表面的氨基，如 茚三酮法、itl/bca法、itl/dtnb法、spdp 法等等。 1.3.2.1 茚三酮法 茚三酮法最早是 1970 年 kaiser 等31提出，并用来进行氨基酸的定量检测。 此后被广泛用于检测氨基酸、氨以及一级和二级胺。其基本原理为在加热条件 下， 固相载体表面氨基与茚三酮反应生成蓝紫色化合物， 称为罗曼蓝(ruhemanns blue)，此蓝色生色团从固相载体表面脱落下来，溶解在溶剂中。此反应十分灵 敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，在 570nm波长下进行比色就可测定样品 中氨基的含量。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 11 - o o oh oh cooh h2nr - co2- rcho - 3h2o + ho o n o o purple 图 1- 9 茚三酮法原理 fig.1- 9 scheme of ninhydrin method tomoko mori等32分别用滴定法和茚三酮法来检测氨基修饰类单片电路式 树脂。他们以辛胺、十二胺和 3- 苯基- 1- 丙胺作为测量氨基的标准溶液，发现， 三种标准物的线性吻合的比较好（如图 1- 10） ， 且辛胺做标准曲线时相对偏差是 比较好的(2.1%)，线性归一性很好(r2=0.998)。同时，在测试低密度样品时，用 茚三酮法测到的数据与公司提供的样品数据比较一致，而滴定法几乎没有测得 数据。可见，在测试低密度氨基修饰样品时茚三酮法要优于滴定法。 图 1- 10 三种标准物的标准曲线32 fig.1- 10 different calibration curves of standard substance 此方法除了可以用上篇文献中的辛胺作为标准物外， yabin zhu 等33, 34采 用 1,6- 己二胺作为检测的标准物。虽然可以使用不同的试剂作为标准溶液，但 是不同的标准物与待测样品之间具有相异性，这样就会对测试的准确性带来影 响。因此标准物与样品的一致性较差是此方法存在的一种缺陷。 fanny d orlye 等35用 sigma- aldrich公司的 kaiser test kit 作为茚三酮试剂 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 12 - 盒检测了 aptes 修饰的三氧化二铁/氧化硅核壳颗粒表面的氨基密度。从其结 果来看（图 1- 11）所测数据的相对标准偏差过大（高达 54%） ，可见虽然此方法 较灵敏，但受实验条件如反应时间，水浴温度等影响较大。 图 1- 11 标准曲线35 fig.1- 11 calibration curve 根据这些文献的报道，虽然有一些研究茚三酮与氨基酸的反应机理的文献 36但是茚三酮与伯胺基的显色机理尚且不十分的清楚，而且易受到实验条件的 干扰，除了上文提到的一些干扰因素外，还有文献报道金属离子也会对其产生 干扰。 1.3.2.2 itl/bca 法和 itl/dtnb 法 茚三酮方法发现较早，可以应用在许多场合，但检测固相载体表面氨基的 特异性较差，易受到其他物质干扰，因此人们开始寻找新的方法。itl/bca法 和 itl/dtnb法就是在分子偶联试剂 itl（2- iminothiolane，trauts 试剂）的基 础上发展出来的两种方法。 itl/bca法和 itl/dtnb法最早是由 sotiris e. kakabakos, philemon e. tyllianakis 等37, 38在 1993 年报道出来的，这两种方法均有两步反应。itl/bca 法先是固相载体表面的伯胺基与分子试剂 itl 发生特异性反应，伯胺基转化为 巯基，在这步反应的基础上，利用巯基的还原性，将 bca工作液中的 cu2+还 原为 cu+，生成显色物质，此物质可在 562nm处产生吸光值。其原理如图 1- 12 所示。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 13 - (a) (b) 图 1- 12 itl/bca法反应原理图39 fig.1- 12 scheme of itl/bca method itl/dtnb法第一步反应与 itl/bca法一致， 第二步反应在巯基的存在下， 无色的 dtnb与巯基反应转变成黄色的 5- 巯基- 2- 硝基苯甲酸，并在 412 nm 处 具有最大吸收峰。dtnb检测巯基的原理如图 1- 13 所示： s- s sno2o2n - ooccoo- - sno2 coo- ssno2 coo- + + nh2 s nh2+cl- + nh hs nh2+cl- itl 图 1- 13 itl./dtnb 法反应原理图 fig.1- 13 scheme of itl/dtnb method 此两种方法报道以后被一些文献继续进行后续应用研究。mahsa ghasemi 等39用 itl/bca法检测聚乙烯膜表面氨基，从结果可知，itl/bca法可测到 的氨基密度为 1.4+0.3 molecules/nm2， 可见此方法对于材料表面微量氨基的检测 灵敏度是极高的。 当然这两种方法依然存在问题，比如 itl与氨基反应以及 dtnb与巯基反 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 14 - 应的副反应问题，以及两步反应效率的问题等等40- 44。 1.3.2.3 spdp法 3- (2- 吡啶二巯基)丙酸 n- 羟基琥珀酰亚胺酯（spdp）法反应原理如图 1- 14 所示，spdp 分子与氨基发生反应，之后用二硫苏糖醇(dtt)溶液与 spdp 改性 后的样品反应，切割下吡啶- 2- 硫醇，此物质溶解在上清液中，在 343nm下有较 强的吸收。 图 1- 14 spdp 法反应原理图39 fig.1- 14 scheme of spdp method spdp 偶联分子有spdp、 lc- spdp 和sulfo- lc- spdp 有三种不同的形态 （如 图 1- 15）所示。lc- spdp 和 sulfo- lc- spdp 分别对原始的 spdp 分子进行了稳 定性修饰以及亲水性修饰。wei wang 和 mark. w. vaughn等45，f. sauzedde 等 46使用最原始的 spdp 进行检测，vinod singh等47用稳定性修饰的 lc- spdp 进行检测，而 takahito nakagawa 等48，mahsa ghasemi 等39，brandon yoza 等 13选择了稳定性及亲水性更好的 sulfo- lc- spdp 与固相载体表面氨基进行反 应，他们能测到的氨基密度分别为 23.1+0.7 molecules/nm2，1.2+0.6 molecules/nm2和 0.84 molecules/nm2，且 mahsa ghasemi 报道此方法的检测限能 够达到 0.2molecules/nm2，由此可知此方法的灵敏度足够高，能够测到极低密度 的氨基密度。虽然此方法优势明显，但是与上面所述两种方法相似，反应后的 生色团同样会出现副反应的问题49。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 15 - 图 1- 15 spdp 三种结构50 fig.1- 15 three structure of spdp 1.3.2.4 其他显色方法 除了以上介绍的茚三酮法、itl/bca法、itl/dtnb法和 spdp 法以外， 用来定量检测固相载体表面氨基的显色法还有 nbz 法，bpb法等39。 1.3.3 荧光法 荧光法用来检测固相载体表面氨基主要分为两种，一种是固相载体表面氨 基与某种试剂反应生成荧光产物，另外一种是用荧光标记物标记表面氨基，达 到定量检测的目的，下面分别进行论述。 1.3.3.1 荧光胺法 荧光胺法最早是由 m. weigele 等51, 52报道出来的。他合成53了荧光胺（如 图 1- 16 所示） ，发现这种物质与伯胺基反应的原理与上文提到的茚三酮/苯乙醛 与伯胺基反应原理相似，但反应产物却为荧光物质。与茚三酮方法相比，由于 荧光胺自身相当稳定，可以克服茚三酮的氧化而引起的检测过程中副反应的发 生。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 16 - 图 1- 16 荧光胺制备过程51 fig1- 16 the preparation process of fluorescamine 荧光胺本身并不呈荧光，但其与伯胺基反应生成具有荧光的物质，此物质 在 390nm 可以被激发，在 470nm 处有发射波。其原理如图 1- 17 所示。 图 1- 17 荧光胺与伯胺反应原理 fig1- 17 scheme of reaction between fluorescamine and primary amino group 荧光胺法有许多优点，首先是的灵敏度较高，hanna ritter 等54用此法对氨 基修饰的介孔硅 mcm- 41 进行测试，得到样品表面的氨基密度为 0.79 molecules/nm2；其次，此方法反应迅速，在 ph8.0- 9.0 条件下，半毫秒内反应即 可完成；第三，荧光团的线性和稳定性较好，反应产生的荧光与样品氨基的浓 度成比例关系, 且荧光团能稳定几小时；最后，反应条件不苛刻，可以在室温 下，水相介质中进行。 1.3.3.2 荧光标记法 荧光标记法最早是由whitesides55报道出来， 用于检测聚乙烯膜表面的羧基。 由于荧光分光光度计的高灵敏性，易操作性，可以适用于很多功能基团（如羧基、 氨基、羟基等）的定量检测。yangjun xing 和 eric borguet56等采用三种荧光标 记物检测氨基功能基团密度达到了 109 molecules/cm2。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 17 - 图 1- 18 荧光标记物56 fig.1- 18 fluorescence labeling of surface species amir h. nashat57等用fitc 和fse两种荧光标记物标记固相载体表面的氨 基（如图 1- 19） ，通过标准曲线得到表面氨基密度为 8.1 1010 和 2.5 1010molecules /cm2，这些报道均远远低于其他一些方法（如 ir、xps）的检测 限，因此这种方法也能够满足氨基基团低密度材料的要求。 图 1- 19 荧光标记物57 fig1- 19 fluorescein probes 荧光法虽然有诸多优点，但是荧光物质会发生荧光猝灭现象，这可能会成 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 18 - 为潜在影响此方法应用的缺陷。 1.3.4 其他方法 除了以上方法外，还有一些方法可以用来定量表征固相载体表面的氨基功 能基团，如元素分析法、 xps、ir、 fnmr58等。这其中，元素分析法操作简便， 使用也较普遍，gang shen等59，guoxin zhang等60，mathieu etienne 等61分 别用元素分析法定量表征了接枝有 aptes 的氧化硅颗粒， 氨基修饰的免疫磁性 纳米颗粒和氨基功能化的硅凝胶（aps） 。虽然此种方法能够比较准确的给出材 料中氮元素含量，但它本身不是针对固相载体表面的氨基检测的方法，且测试 的是材料总氮量， 因此我们无法得知氮元素在材料中是以什么化学状态存在的， 例如 guoxin zhang所使用的氨基硅烷为 n- (2- 氨乙基)- 3- 氨丙基三甲氧基硅烷 (aeaps)，如下图所示。 sich2 och3 och3 h3coch2ch2nhch2nh2 可见这种氨基硅烷除了有端基的氨基外，还有一个仲胺基，这样用元素分 析法测得的氮元素含量就不能准确表示全部伯胺基的量。 ir、xps 法检测表面功能基团的检测限一般在 1012 groups/cm2内，如果密 度再低，则这两种方法就不再合适。另外 ir、xps 和元素分析法有个共同的缺 点即我们无法得知氮元素在材料中是以什么化学状态存在的，且 xps 法需要在 高真空的条件下才能工作，操作条件较苛刻，因此这两种方法也不是简单的定 量检测方法。 1.4 本文的研究目标、意义和主要内容 1.4.1 本文的研究目标及意义 磁性氧化硅复合微球由于其良好的生物相容性及表面易实施功能化等优良 特性越来越引起人们的注意。而磁性氧化硅微球表面修饰的功能基团数目又是 其在核酸提取，临床免疫检测等应用上的关键因素。 上海交通大学硕士论文 第一章 绪论 - 19 - 目前人们在磁性纳米微球的制备技术、化学物理修饰、形态表征及应用等 方面取得了巨大进展。尽管在磁性纳米微球的定性表征方面发展了许多成熟的 技术，如 tem、sem、raman等，然而对其表面功能基团的定量分析却大大滞 后。 综上，固相载体表面氨基的测试方法较多，但大都针对某一特定方法进行 研究，各种定量检测结果之间也缺乏比较，另外这些检测方法更是很少应用到 磁性微球表面氨基的定量检测。在这个背景下，本工作的研究目的与意义是： 在前人工作的基础上，以本实验室自制的氨基氧化硅磁性微球为检测对象，建 立两种不同的磁性微球表面少（微）量氨基基团的定量检测方法。比较不同方 法之间的相关关系，为磁性微球进一步应用于生物应用提供理论依据与实验数 据。 1.4.2 本文研究的主要内容 本文首先建立了基于磁性氧化硅微球表面氨基的荧光胺定量检测方法。研 究了磁性微球的最终检测方式、检测体系中 ph 值、伯胺与荧光胺反应时间、 磁性微球加入量对最终检测结果的影响。计算得到了荧光胺检测方法的最低检 出限，线性范围以及批间批内误差。 其次，建立了基于磁性氧化硅复合微球表面氨基的 itl/bca定量检测方 法，研究了反应温度、反应时间、itl 浓度等因素对于实验结果的影响，研究 了氧化硅、fe3o4颗粒、itl 试剂、dtt清洗液等干扰物对微球表面氨基检测的 影响。对已构建的 itl/bca法的批间、批内误差、最低检出限、线性检测范围 进行评价。 最后，在研究的 itl/bca方法的基础上，提出差量法检测磁性微球表面氨 基的新方法，克服了 itl/bca法中磁球本身等因素的干扰，并将结果与 itl/bca法得到的结果进行了比较与分析。 上海交通大学硕士论文 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 - 20 - 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 2.1 引言 引言 荧光胺(fluorescamine)的商品名为弗路兰(fluram)，其化学名为 4-苯基螺 -呋喃-2(3h),1-酞酰-3,3-二酮。荧光胺本身及其水解产物不显荧光，但能在温 和的条件下与含有伯氨基的化合物(包括蛋白质、肽、氨基酸及其他各种多肽) 分别生成类似的稳定、低背景具有强烈荧光性的化合物62-66。用于氨基酸、蛋 白质和蛋白水解酶的定量检测，也用于蛋白测序分析中。通常生成的荧光产物 的最大激发波长为 390nm，最大发射波长为 475nm。 虽然荧光胺在生物实验中应用较为广泛。但是，关于其用于固相载体表面 伯胺基测试的文章并不多见， hanna ritter 等54人用荧光胺检测氨基修饰的介孔 氧化硅 mcm-41，得到样品表面的氨基密度为 0.79 molecules/nm2。然而将该方 法用于磁性微球表面氨基的检测尚未见报道，因此上述方法是否适用于磁性纳 米氧化硅颗粒就成为我们研究的重点。 本文建立了基于磁性微球表面氨基的荧光胺定量检测方法。以氨基修饰的 氧化硅磁性微球为模式固相载体，将荧光胺法运用于氧化硅磁性微球表面氨基 的定量检测，研究了反应体系 ph 值、反应时间、磁球干扰等影响检测反应的 因素，并对已构建的荧光胺检测方法的批间、批内误差、最低检出限、线性检 测范围进行评价。 2.2 实验部分 实验部分 2.2.1 实验材料 实验材料 实验中使用的试剂来源和规格如表 2-1 所示 上海交通大学硕士论文 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 - 21 - 表 2-1 试剂来源及规格 table2-1 source and parameters of reagents 编号 试剂名称 规格 生产厂家 1 氯化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公 司 2 磷酸氢二钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公 司 3 磷酸氢二钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公 司 4 磷酸二氢钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公 司 5 氢氧化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公 司 6 丙酮 分析纯 国药集团化学试剂有限公 司 7 三乙氧基氨基丙基硅烷(aptes) 分析纯fluka09324 8 荧光胺(fluorescamine) fluka47614 9 氧化硅磁球 1000nm上海奥润微纳公司 10 表面氨基改性磁性氧化硅复合微 球 1000nm自制 2.2.2 实验仪器 实验仪器 实验中使用的仪器如表 2-2 所示 表 2-2 实验中所用仪器 table2-2 the information of equipment 编号 仪器名称 型号 生产厂家 1 荧光分光光度计 ls55 美国 perkin elmer 公司 2 磁分离架 上海奥润微纳公司 3 ph 计 pb-10 sartorius 梅特勒公司 4 超声波清洗机 usc-202 上海波龙电子设备有限公司 5 元素分析仪 pe 2400 ii 美国 perkin elmer 公司 6 zeta 电位仪 zetasizer 2000 马尔文仪器有限公司 7 红外光谱仪 equinox 55 德国 bruker 公司 8 透射电子显微镜 jem100cx 型 日本 jeol 公司 上海交通大学硕士论文 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 - 22 - 2.2.3 实验方法 2.2.3.1 磁性氧化硅微球表面氨基定性表征 本章所使用的氨基修饰氧化硅磁球是由本实验室自行制备的67。称量 250mg 氧化硅磁球于三口 250ml 三口烧瓶中，分散于 50ml 甲苯中，110水浴 回流 30min 去除磁球表面的吸附水分子。然后，加入 80 laptes 试剂，在 110 水浴下反应 6 小时。反应结束后在外磁场的帮助下，用甲苯洗涤氨基修饰磁 球四遍，去除多余的甲苯，在 120真空烘箱中真空干燥 12 小时，得到粉末状 的氨基修饰氧化硅磁球。取三组不同时间制备的氨基磁球，编号分别为 a p i、 ap ii 和 ap iii。 2.2.3.1.1 样品微观形貌 采用透射电子显微镜 （tem，transmission electron microscope， jem100cx 型，日本 jeol公司）观察氨基修饰氧化硅/fe3o4复合微球的微观形貌，电镜 的加速电压为 200kv。 将 10mg 氨基修饰氧化硅/fe3o4复合微球分散于 1ml去离子水中，用微量 移液器取 20 l的氨基修饰氧化硅/fe3o4复合微球分散液，滴于 300 目的碳支持 膜铜网上，表面加盖培养皿，自然晾干后待测。 2.2.3.1.2 zeta 电位 采用 zeta 电位表征磁性氧化硅微球表面电学性能。取出少量自制的氨基修 饰氧化硅磁微球粉末分散于去离子水中，立即测定样品的 zeta 电位- ph 曲线， 获得样品的等电点，从而反映磁性微球电动现象，进而间接反映微球表面功能 基团携带电荷的状况。 2.2.3.1.3 元素分析 采用元素分析仪表征磁性氧化硅微球中氮元素的含量。对每一个产物进行 至少两次的平行测试，直至两次测试结果相差在 2%以下，结果取两次测试的平 上海交通大学硕士论文 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 - 23 - 均值。 2.2.3.2 标准溶液的配制与标准曲线的测试 将 aptes 溶解在 0.02m 的 naoh 溶液中，配制成浓度为 0.01m 的 aptes 溶液。 取 400l 0.01m 的 aptes 溶液于 5ml 容量瓶中， 加 0.02m 的 naoh 定容， 以待测氧化硅磁性微球最终所含的氨基密度为标准进行折算，将上述 aptes 溶液再配制成浓度为 0.4mmol/g的标准溶液。 再将 0.4mmol/g标准溶液用 0.02m naoh 倍比稀释为 0.3、0.2、0.1、0.05mmol/g的标准溶液。再取 4 l 不同浓度 的 aptes 标准溶液加入到 116l（0.2m、ph=8.0）的磷酸缓冲液中，然后加入 40 l分散于丙酮中的荧光胺（0.3g/l）溶液，避光反应 20min 后，用 ls55 荧光 分光光度计进行荧光测试。 2.2.3.3 缓冲溶液 ph 值对氨基定量检测的影响 改变体系中磷酸盐缓冲液的 ph 值分别为 7.4、8.4、8.7 和 9.0，其余步骤按 照 2.2.3.2 对 0.4mmol/g的标准溶液进行氨基检测。 2.2.3.4 伯胺与荧光胺反应时间对氨基定量检测的影响 改变标准液与荧光胺避光反应的时间分别为 20min、40min 和 60min，其余 步骤按照 2.2.3.2 对 0.4mmol/g的标准溶液进行氨基检测。 2.2.3.5 仪器检测过程中磁性微球的加入量对氨基定量检测的影响 按照 2.2.3.2 对 0.4mmol/g的标准溶液进行荧光胺检测，并另外取相同量的 标准溶液加入 10mg 未修饰氨基的磁性氧化硅微球作为参照进行荧光检测。 2.2.3.6 氨基改性的氧化硅磁性微球的检测 分别称取 10mg 样品放入 5ml容量瓶中，加入 0.02m naoh溶液定容，超 声 30min，反应 60h后在磁分离架上进行固液分离。取 4l磁分离后的上清液， 加入到 116 l的 pbs （0.2m ph=8.0） 中， 然后加入 40l荧光胺， 避光反应 20min。 上海交通大学硕士论文 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 - 24 - 用荧光分光光度计进行荧光测试。 2.2.3.7 荧光测定 固定 ls55 荧光分光光度计的测试光程为 1cm， 采用 100l石英皿对 aptes 标准溶液进行荧光测试，全波段扫描激发波长后确定最大激发波长为 388nm， 发射波长范围设定为 400- 600nm，进行发射波扫描，以确定发射波长（激发狭 缝为 8nm，发射狭缝为 10nm） 。 图 2- 1 荧光分光光度计示意图 fig.2- 1 scheme of fluorescence spectrometer 2.3 结果与讨论 2.3.1 表面氨基定性研究 eto eto sieto fe3o4 oh oh oh + o o o sife3o4 nh2 nh2 3c2h5oh fe3o4silica fe3o4silica- nh2 图 2- 2 氧化硅磁性微球表面氨基修饰过程 figure2- 2 reaction mechanism of magnetic microsphere and aminosilane 上海交通大学硕士论文 第二章 建立基于荧光胺的微球表面氨基检测方法 - 25 - 本实验中所用氨基氧化硅磁性微球是以三乙氧基氨基丙基硅烷(aptes)作 为有机硅前驱体， 对氧化硅表面进行修饰。 由于 aptes 分子中含有一个伯胺基， 因此可以在氧化硅表面赋予氨基基团，反应原理如图 2- 2 所示。本文通过 zeta 电位表征的方法来定性表征磁性复合微球表面的修饰基团。 2.3.1.1 样品微观形貌 本章所用的氨基修饰纳米氧化硅磁球的 tem 照片如图 2- 3 所示， 其平均直 径约为 1000 纳米，从（b）图中可以看到有 20nm 氧化硅壳层包覆在磁球上。 微球内部深黑色球形物为由众多粒径 10nm 的超顺磁性 fe3o4颗粒聚集组装而 成，微球中磁性物质含量为 70 wt%以上。在此基础上用 aptes 进行接枝得到 氨基修饰磁性微球。 (a) （b） 图 2- 3 1000 纳米氧化硅磁性微球的 tem 照片， （b）为（a）的放大图，其中可以看到有氧 化硅壳层包被在磁性微球表面 fig.2- 3 tem images of silica coated magnetic nanospheres with an average diameter of 1000nm. (b) is a further enlargement of (a), in which the silica shell coating onto t