（基础兽医学专业论文）渔用微生物絮凝剂产生菌筛选及特性研究.pdf

摘要 微生物絮凝剂( b i o f l o c c u l a n t s ) 是一类由微生物产生并分泌到细胞外具有絮 凝活性的生物活性物质，具有良好的絮凝沉淀性能，安全、无毒，易于生物降解。 由于其克服了无机和有机絮凝剂在使用安全和环境污染方面的问题，所以研究和开 发微生物絮凝剂具有重要的现实意义和广阔的应用前景。 本实验采用常规的分离、纯化方法，从雅安市生活污水沟的活性污泥和四川农 业大学水产养殖基地养殖池淤泥等处分离筛选出9 株产絮凝剂的菌株，复筛得到l 株 絮凝活性较高的微生物絮凝剂产生菌，经初步鉴定为不活跃大肠杆菌，定名 ( e s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew e ) 。以e s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2 为研究对象，研究了培 养条件和培养基成份及其用量对该菌产微生物絮凝剂的影响，同时对其所产微生物 絮凝剂的絮凝特性以及处理水产养殖水体进行了研究 实验表明，培养基的成份及培养条件对菌株e s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2 产絮凝 剂具有重大影响。通过正交实验和单因子实验发现，淀粉是菌株e s c h e r i c h i ac o l i i n a c t i v ew 2 产絮凝剂的良好碳源；脲和硝酸钠有利于絮凝剂的产生；培养基中加入 酵母膏和牛肉浸膏反而不利于絮凝剂的产生；培养基的初始p h 值对菌株w 2 产絮凝 剂的影响最大；根据正交实验和单因素实验结果确定产絮凝剂优化培养基组成为：淀 粉2 5 9 l ，脲1 5 9 l , k 2 h p 0 l0 5 9 l ，f e s o _ 10 o l g l ，m g s 0 40 5 9 l ， na c 1 0 5 9 l 。适宜的培养条件是：p h 值7 0 ，温度为2 8 ，摇床转速1 2 0 r m i n ，培养时 间7 2 h 。 对西c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2 所产絮凝剂的絮凝特性实验发现，w 2 絮凝活性由 细菌细胞表面物质产生，絮凝物质主要存在于细菌表面。本实验中二价阳离子对絮 凝都有促进作用，其中以c a ”助凝效果最好，其中最佳的投加量在0 2 - 0 3 m g l ；对 高岭土絮凝剂的最佳投加量2 n l l 几，优于文献报道值；p h 值对絮凝剂的絮凝活性影 响很大，在p h 4 0 7 o b 寸絮凝活性基本不变，超过7 0 时絮凝活性迅速下降。另外对 e s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2 所产的微生物絮凝剂进行急性毒性实验表明，该菌体絮凝 剂对鱼类和小白鼠没有毒性，是一种安全无害的絮凝剂。 ，劭酤c h e r i c h i ac o i li n a c t i v ew 2 所产絮凝剂絮凝处理水产养殖水体的研究表明，该 微生物絮凝剂在较短时间水体的透明度得到很大的改善，c o d c r 值降低为原来的一 半，因此，在水产养殖水体水处理中显示出其良好的应用前景。 关键词：水产养殖；微生物絮凝剂；絮凝特性：水质改良 a b s t r a c t b i o f l o c c u l a n t s ，h a v i n gg o o df l o c c u l a t i n ga c t i v i t y , a r et h em e t a b o l i cp r o d u c t so ft h e m i c r o o r g a n i s m , w h i c ha r es a f e , n o n t o x i ca n dc a nb eb i o d e g r a d e de a s i l y s i n c et h e y o v e r c o m et h es h o r t c o m i n g so fs e c u r i t ya n dp o l l u t i o no ft h ei n o r g a n i cf l o c c u l a n t sa n d o r g a n i cf l o c c u l a n t s ，r e s e a r c ha n de x p l o i t a t i o no f b i o f l o c c u l a n t sh a v ei m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e a n dw i d ep r o s p e c ti na p p l i c a t i o n b yc o n v e n t i o n a ls e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d st h r o u g ht h i sr e s e a r c h , 9s t r a i n so f b i o f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s m sw e r es c r e e n e do u tf r o ma c t i v a t e ds l u d g eo fa s e w a g ec h a n n e li ny a a na n dt h ep o n do fs ic h u a na g u l r i c u l t u r eu n i v e r s i t ya q u i c u l t u r e b a s ea n d5 0o n as t r a i nw i t hh i g hf l o c c u l a t i n ga c t i v i t yw a so b t a i n e da f t e rr e s c r e e n i n g , w h i c hw a si d e n t i f i e da se s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v e a n dw a sn a m e de s c h e r i c h i ac o l i i n a c t i v ew 2 , t a k i n gt h ee s c h e r i c h i ac e l li n a c t i v ew 2a st h ei n v e s t i g a t e do b j e c t ，t h ee f f e c t o ft h ec u l t u r a lc o n d i t i o n sa n dt h em e d i u mc o m p o s i t i o na n dc a t e g o r yo nb i o f l o e c u l a n t p r o d u c t i o nw a ss t u d i e d ，a n dt h ef l o c c u l a t i n gc h a r a c t e r i s t i ca n dt r e a t m e n tw i t ha q u i c u t u r e - w a t e rw a sa l s os t u d i e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e d i u mc o m p o s i t i o na n dc u l t u r a lc o n d i t i o n s h a ds i g n i f i c a n te f f e c to nb i o f l o c c u l a n tp r o d u c t i o n a f t e ro r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t ，i t w a sf o u n dt h a t ：a m y l u mw a st h eb e n e f i c i a lc a r b o ns o u r c et o e s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2 ，a n du r e aa n dn a n 0 3w a st h eb e n e f i c i a ln i t r o g e ns o u r c et o e s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2 ；m e d i u mw i t hy e a s te x t r a c to rb e e fe x t r a c tw a sd i s b e n e f i c i a l f o rt h ep r o d u c t i o no fb i o f l o c c u l a n t ；t h ei n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u mh a dt h em a x i m u n e f f e c t t h eo p t i m i u mc o m p o n e n tp r o p o r t i o no fm e d i u mo b t a i n e da c c o r d i n gt ot h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tw a s ：a m y l u m2 5 9 l , u r e a1 5 9 l ， k 2 h p 0 4o 5 9 l ，f e s 0 4o 0 1 9 以m g s 0 4o 5 9 l ，n a c lo 5 班。t h eo p t i m i n nc u l t u r a l c o n d i t i o n sw e r e p h7 0 ，2 8 ，1 2 0 r m i n ，c u l t u r e df o r7 2h o u r si nf l a k e s t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n to nt h ef l o c c u l a t i n gc h a r a c t e r i s t i co ft h eb i o f l o e c u l a n t p r o d u c e db ye s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2s h o w e dt h a tt h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo ft h e b i o f l o c c u l a n tw a sd u et ot h es u r f a c ep r o d u c t so fw 2 d i v a l e n tp o s i t i v ei o n sc o u l dp r o m o t e t h ef l o c c u l a t i n ge f f e c t 。i nw h i c hc a 2 + h a dt h eb e s te f f e c t s t h eb e s td o s a g eo fc a 2 + w a s0 2 - o 3 m g l a n df o rg a o l i nb i o f l o e c u l a n tw a s2 0 m l 1 t h ep hf a c t o ra p p a r e n t l yi n f l u e n c e dt h e f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y , o n c et h ep ho ff l o e c u l a n ts y s t e mw a s4 0 - 7 0 ，t h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t y m a i n t a i n e d ，a n do n c et h ep hw a su pt o7 0 ，f l o c c u l a t i n ga c t i v i t yd e g r a d e dr a p i d l y ；t h e r e s u l t so ft h eo c u t ot o x i c i t yt e s t i n go nt h em u sm u s c u l u sa l b u sa n dc a r pw i t ht h e b i o f l o e e u l a n tp r o d u c e dw i t hs t r a i nw 2s h o w e dt h a tt h i sb i o f l o e c u l a n tw a s s a f e t h er e s u l t so ft h e f l o c c u l a t i n ge x p e r i m e n to ne f f l u e n to fa q u a c u l t u r ew i t ht h e b i o f l o c c u l a n tp r o d u c e db ye s c h e r i c h i ac o l ii n a c t i v ew 2i n d i c a t e dt h a tb i o f l o c c u l a n th a d e x c e l l e n te f f e c to nt h ew a t e r - e l a r i t yo fa q u a c u l t u r ea n dc o u l dr o l l l o v ei n d i s c e r p f i b l e c o d e r , a n ds h o w e de x c e l l e n te f f e c to nt h et r e a t m e n to f a q u i c u l t u r ew a t e r k e y w o r d s ：a q u a c u l t u r e ；b i o f l o c c u l a n t ；f l o c c u l a t i n gc h a r a c t e r i s t i c s ；w a t e r - i m p r o v i n g 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 臻待支易么厶妇 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： ， 荡j 彳 导师虢、l 啦勰l e 丌1 加 钿如么 年 年 以如 涉 切 3 一 前言 近年来，随着我国水产养殖业的飞速发展，我国的水产养殖业逐渐向高密度集约化 的模式发展，养殖密度不断加大，致使养殖水体自身污染问题越来越突出“1 同时，随 着我国工业和城市的飞速发展，工业排污和生活污水大量排入河流、湖泊或水库中，导 致养殖水体的富营养化，给水产养殖的养殖环境带来巨大的压力。富营养化水体有机 物含量高，悬浮颗粒多，藻类大量繁殖，导致水体溶解氧、透明度降低，水质恶化，最 终导致养殖鱼类体质下降，抗病力降低，鱼类疾病的暴发和流行，给水产养殖带来巨大 的危害。在生产实践中改善这类水体的一个重要方法之一就是把水体的悬浮颗粒和死亡 或药物杀死的藻类絮凝沉淀而起到改良水质的目的。目前，用于絮凝沉淀的水产药物主 要有铝盐( 硫酸铝( 明矾) 、聚合氯化铝( p a e ) 等) 、铁盐( 氯化铁、聚合硫酸铁( p f s ) 等) ，以及聚丙烯酰胺( p a m ) 。但是，这些絮凝剂在使用中常常会产生负面影响，如 铝盐可造成老年人的铝性骨病及痴呆症，聚丙烯酰胺单体具有神经毒性和“三致”毒 性，会对人类的健康产生了极大的威胁啪。因此，限制了这些絮凝剂广泛应用，研究和 开发安全、无害、絮凝活性高的新型絮凝剂势在必行，对人类健康和水质改良都具有非 常重要的现实意义。 微生物絮凝剂( b i o f l o c c u l a n t s ) 正是这样的一类絮凝剂，它是微生物产生的高分子 物质，具有高效、安全、无残留、无二次污染和价格低的特点，克服了无机絮凝剂、有 机絮凝剂对人体有害和对环境产生二次污染的缺点，已广泛应用于环保，食品、废水水 处理等行业，成为目前絮凝技术的研究热点“1 。 1 微生物絮凝剂的研究现状 微生物絮凝现象首先是l o u i sp a s t e u r 在酵母中观察到，发现酵母能把发酵液中的 细菌聚集成团而絮凝沉淀，两年后类似的现象亦在细菌中发现“1 ，但当时并未引起重 视，直到1 9 3 5 年，美国科学家b u t t e r f i e l d 从活性污泥中筛选到第一株微生物絮凝剂 产生菌( 简称絮凝菌) 嘲，之后，许多学者才开始研究微生物的胞外产物与絮凝现象的 关系，并分离筛选到大量的絮凝微生物，包括细菌、放线菌、霉菌、酵母等。 1 9 7 6 年，j n a k n m u r a 等“1 筛选出1 9 种絮凝微生物，霉菌8 种，酵母1 种，细菌5 种， 放线菌5 种，其中以酱油曲霉( a s p e r g i l l u ss o j a e ) a j 7 0 0 2 的絮凝效果最好，其絮凝剂 的主要成分为蛋白质和己糖胺，且具有良好的耐热性。1 9 8 5 年，h t a k a g i 等。1 研究了拟 青霉属( p a e c i l o m y c e ss p ) 微生物产生的絮凝剂，并研制出p f l 0 1 絮凝剂，分子量约 为3 0 万，主要成分为半乳糖胺，对枯草杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、活性污泥、纤维素 粉、羧甲基纤维素、活性炭、硅藻土、氧化铝等均有良好的絮凝效果。1 9 8 6 年， r k u r a n e 等伽从自然界分离到红平红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) ，其产生的絮 凝剂n o c - 1 被世界公认的最好的微生物絮凝剂，该絮凝剂对大肠杆菌、酵母、泥浆水、 河水、粉煤灰水、活性碳水、膨胀污泥、纸浆废水均有良好的絮凝和脱色效果，是目前 研究最为深入的微生物絮凝剂，包括对菌种的筛选、发酵条件的优化、分离纯化、分子 结构以及替代培养基方面进行了系统研究，并取得一定的成果。在此之后的研究中，比 较有代表性的是1 9 9 7 年s u b h 等“”人发现的d p - 1 5 2 絮凝剂，因其是首次发现杆状细菌也 能产生絮凝剂。 我国对微生物絮凝剂的研究起步较晚，但近年来发展迅速，取得很大的进展邓德 丰“”从废水中分离得到c - 6 2 细菌。王镇等“”选出的4 株菌其絮凝活性均优于k u r a n e 报道 的斤e r y t h r o p o i s 。刘紫鹃等“”从活性污泥中分离到一株巨大芽孢杆菌( b a c i l l u s m e g a t r i u ma - 2 5 3 。邓述波等“”分离到硅酸盐芽孢杆菌新变种，其产生的絮凝剂m f b a - 9 絮 凝效率高达9 9 2 ，且用量仅为一般微生物絮凝剂的1 1 0 1 1 0 0 ，对淀粉厂黄浆废水处 理的效果优于目前广泛使用的聚合氯化铝( p a c ) 和聚丙烯酰胺( p a m ) 絮凝剂。宫小燕 等“”从土壤中筛选一株多粘芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x ab y - 2 s ) ，能有效去除水 中溶解性有机染料。陈欢等“”分离到一株纤维堆囊菌( s o r a n g i u mc e l l u l o s u n ：n u s 7 0 0 3 ，并对其化学组成和结构进行了分析，从而为阐明絮凝机理，改造和修饰絮凝剂、 提高絮凝活性提供理论依据。马放等“”在微生物絮凝剂的实际应用上做了进一步开发研 究，首次提出复合型微生物絮凝剂。 目前，美国、日本、英国等国有多种微生物絮凝剂产品面市，但是微生物絮凝剂 的开发还主要停留在实验室研究阶段，未见大规模的工业应用，还有待研究者的继续努 力。 2 微生物絮凝剂的种类 根据微生物絮凝剂的来源方式的不同，微生物絮凝剂主要有：从微生物细胞提取的 絮凝剂、微生物细胞代谢产生的絮凝剂、直接利用微生物细胞的絮凝剂和利用克隆技术 所获得的絮凝剂。 ( 1 ) 直接利用微生物细胞的絮凝剂很多微生物的细胞本身就具有絮凝活性，它们 大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中，据报道有细菌、放线菌、真菌、藻类，主要 有：a s p o r g i l l u ss o j i 、a s p e r g i l t u so c 舷a c e u s ，a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s ， a l c a l j g e n e sc u p i d u s 等“”t a k a g i h 等“”研究p a e c i o m y c e s 产生的絮凝剂的性质发 现：被蒸馏水冲洗后的菌体与发酵液的上清液具有同等的絮凝活性，对枯草杆菌、大肠 杆菌、啤酒酵母、活性炭、硅藻土、氧化铝等具有良好的絮凝效果。 ( 2 ) 利用微生物细胞壁提取物的絮凝荆微生物细胞是天然有机高分子絮凝剂的重 要来源，酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和乙酰葡萄糖胺等成分均可作为絮凝 剂。丝状真菌细胞壁多糖除葡聚糖、甘露聚糖外，还有几丁质。几丁质是n 一乙酰一胪氨 基葡萄糖以b 一1 、4 一糖苷键连成的不分支的链状结构，它经过碱水解可产生带正电性的 脱乙酰几丁质( 壳聚糖) ，壳聚糖含有活性氨基和羟基，对许多微生物菌体及其它带负 电的粒子有较强的絮凝能力，因而近年在水质改良中备受青睐。 ( 3 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂微生物分泌到细胞外的代谢产物主要是细 菌荚膜和粘液质，除水分外，其主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合 物。日本科学家rk u r a n e 等乜1 分离到的红平红球菌，其产生的n o c - 1 絮凝荆主要成分 就是细菌分泌到胞外的蛋白质 ( 4 ) 利用克隆技术所获得的絮凝剂这类絮凝剂是利用基因工程技术和现代分子生 物学技术，把高效絮凝基因转移到便于生物转化的细菌中，如光合细菌，亚硝化杆菌， 构造具有高效絮凝性的生物降解菌株，这在处理富营养化水体和水产养殖水体具有重大 的意义美国在这方面已做出富有成效的工作，研制出一些高絮凝活性菌株，与其它微 生物一起制成微生物活液，用以快速消除下水道淤塞、水体富营养化和污泥膨胀等现象 瞄】 3 微生物絮凝剂的特- 陛 微生物絮凝剂在研究和使用中与传统絮凝剂相比较实证了其具有高效、安全、无二 次污染和价格低的特点，在絮凝沉淀方面具有独特的优势。 ( 1 ) 高效性在同等用量下，微生物絮凝剂比铁盐、铝盐和聚丙酰胺等对废水中 悬浮颗粒和胶体的絮凝颗粒大，而且沉淀速度较快，处理效率明显高于传统絮凝剂。杨 开和康建雄等踟将生产的微生物絮凝剂“酱鲁兰”应用于城市污水处理时与聚铝絮凝剂 相比，聚铝絮凝剂的最佳投加量为同期“普鲁兰”投加量的2 5 倍。 ( 2 ) 安全无毒性微生物絮凝剂属于天然有机高分子絮凝剂，它安全无毒，这已 被许多实验证明，如微生物絮凝剂m b f a - 9 的急毒试验结果表明：小白鼠一次性吞食 l g k g 的该絮凝剂后，体态、饮食、运行等均无异常反应“o ；给小鼠、豚鼠注射 尼e r y t h r o p d i s 的细胞及培养液，均不致病。】。 ( 3 ) 无二次污染微生物产生的絮凝剂成分复杂多样，且随菌种的不同而不同； 到目前为止，已报道的微生物产生的絮凝物质为糖蛋白、粘多糖、纤维素、d n a 等高分 子物质0 4 。“施踟，其分子量多在l0 5 以上，具有生化降解性，即能够自行降解，因而 不会带来二次污染。 ( 4 ) 价格较低微生物絮凝剂为微生物菌体或有机高分子，是微生物发酵产生 的，化学絮凝剂是人工合成的，从生产所用原材料、生产工艺和能源消耗等方面考虑， 微生物絮凝剂也是经济的，这一点已为国内外普遍认同。另外，微生物絮凝剂处理技术 总费用低于化学絮凝处理技术的处理费用，前者约为后者的2 3 。 4 微生物絮凝剂的絮凝机理 微生物絮凝剂是由具有絮凝活性的微生物产生的带有电荷的生物大分子物质，因种 类不一样，所以絮凝剂的性质也不同，絮凝作用的机理也不尽相同，但是，对水体中的 悬浮颗粒和胶体的絮凝有相似之处，主要通过吸附桥联作用、电荷中和作用、化学反应 和卷扫作用使水体中的颗粒和胶体物质絮凝沉淀，从而起到改良水质的目的。 吸附桥联作用是目前普遍被接受的一种理论。该机理认为絮凝剂大分子借助离子 键、氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒，在絮凝剂生物大分子浓度较低时，吸附 在某个微粒表面上的生物分子长链可能同时吸附在另一个微粒的表面上，通过架桥方式 将两个或更多的微粒联在一起从而导致絮凝。l e v y 等以吸附等温线和z e t a 电位的测 定表明环圈项圈藻p c c 一6 7 2 0 所产絮凝剂对膨润土絮凝过程确以“桥联”机制为基础， 用电镜照片显示，正是聚合细菌之间的胞外聚合物搭桥相连才使细胞丧失了胶体的稳定 4 性而紧密地聚合而沉淀下来一般来说，微生物絮凝剂的分子量越大对架桥越有利，絮凝 效率高，但因为架桥过程中也发生链段问的重叠，从而产生一定的排斥作用，若分子量 过高，则这种排斥作用会削弱架桥作用，使絮凝效果变差；另一方面，若生物分子絮凝荆 的带电符号与微粒相反则絮凝剂的离解程度就大，电荷密度越高，分予越易扩展，越有 利于架桥。邓述波等蚓利用吸附架桥理论解释了微生物絮凝剂m b f a - 9 的絮凝机理，认 为微生物絮凝_ i f b a - 9 是一种极性大分子，与水中的颗粒之间存在范德华力，在范德华 力克服静电斥力使姬f a - 9 分子与颗粒相互靠近，随着距离的缩短，絮凝剂m b f a - 9 的分 子中含有的一o h 、- - 0 0 0 h 、- - c 0 0 - - 等基团与颗粒表面的i ，o h - 等以氢键方式发生吸 附，此时，氢键成为主要的吸附力。 电中和学说认为水中的胶体带有一定的负电荷，当带有一定正电荷的链状生物大分 子絮凝剂或其水解产物靠近胶粒表面或被吸附到胶粒表面上时，中和胶粒表面上的一部 分负电荷，减少静电斥力，从而使胶粒间能发生碰撞而凝聚。许多实验中加入金属离子或 调节p h 值即可影响其絮凝效果，这主要通过影响其带电性而起作用汹1 。 化学反应机理认为生物大分子中某些活性基团与被絮凝物质相应的基团发生了化学 变化，聚集成较大分子而沉淀下来，通过对生物大分子改性处理，使其添加或丧失某些活 性基团，絮凝活性将大受影响。有些学者认为这些絮凝剂絮凝活性大部分依赖于活性 基团，温度影响絮凝效果，主要是通过影响其化学基因的活性来影响其化学反应的汹 卷扫作用机理认为当微生物絮凝剂投加量一定且形成小粒絮凝体时，在重力作用下 迅速网捕，卷扫水中胶粒，而产生沉淀分离。这种沉淀作用基本上是一种机械作用，所 需絮凝剂量与原水杂质含量成反比。原水胶体杂质含量少时，所需絮凝剂量大，反之亦 然。 以上这些理论能解释大部分絮凝作用，此外，还有其它一些絮凝机理一如 b u t t e l f i e l d 的粘质说、荚膜学说以及g r a b t r e e 菌体外纤维素纤维丝学等b 甜，也可解释 部分絮凝现象。到目前为止都还没有完全搞清楚，从微生物絮凝剂性质的多样性以及表 现出絮凝范围的广谱性可以断定，絮凝机理肯定是多样的。 5 影响微生物絮凝剂产生的因素 5 絮凝剂的产生受到许多因素的影响，主要是絮凝基因和环境因素。其中絮凝基因的 遗传因素是首要的，但同时环境条件如培养基的组成和浓度、p h 值、培养温度、通气 量等也有重要影响，影响程度因絮凝性生物的不同而有差异。 ( 1 ) 基因因素 微生物产生絮凝剂是受基因控制的，d u b e l 的试验结果证明了这一点。絮凝菌的 基因控制是一个复杂的过程，涉及定位基因及抑制基因的相互作用、定位基因的表达、 絮凝剂的合成和分泌等。目前人们只对某些细菌、酵母菌中与絮凝有关的基因及产物， 絮凝剂微生物细胞壁的成分、结构进行了研究，以期揭开微生物絮凝剂的机制。目前从 酿酒酵母中至少发现了f l 0 1 、f l 0 2 、f l 0 3 、f l 0 4 等1 4 个絮凝基因，其中f l 0 1 、f l 0 5 、 f l 0 8 絮凝基因分子克隆已获得成功嗽蚓f l o i 、f l 0 5 絮凝基因均在1 号染色体上，而 f l 0 8 絮凝基因在8 号染色体上f l 0 1 絮凝基因位于l 号染色体上d n a 片段3 7 咖处，具有显 性表达絮凝性的功能。用含有f l 0 1 的质粒去转化无絮凝性的受体细胞，能使被转化的细 胞产生絮凝性特征凡具有絮凝性的酵母细胞中均含有分子质量为3 7 0 0 0 u 的蛋白质多 肽，凡含有f l 0 1 基因具有絮凝性的细胞中都能分离到1 2 1 个氨基酸、分子质量为1 2 9 0 0 u 的多肽，而非絮凝性的细胞中均无这两种多肽。但是有3 7 0 0 0 u 和1 2 9 0 0 u 多肽的细胞未必 均具有絮凝性，因为絮凝性的表达还受到多种环境因素的影响。 s a i t o 等人的研究表明，絮凝微生物与絮凝菌之间有一定关系。他们用蛋白酶k 处理 絮凝微生物细胞壁，从细胞壁上切下一个使絮凝微生物细胞对悬浮细胞絮凝起主要作用 的蛋白质，但该蛋白如何在菌体内形成，怎样在细胞壁上定位以及它与菌分泌出胞外的 絮凝剂分子在形成机制上有何相似之处尚不清楚汹1 。 k a k k a 等”1 人发现絮凝能力是微生物非必要的，从絮凝菌中得到的非絮凝突变子在 生长程度、形态、生理上与絮凝亲本均相同。h e n r y “”报道了一株由质粒控制絮凝性状 的细菌，质粒消除后絮凝能力丧失，细菌生长良好。王镇等“”报道了其所筛选的四种絮 凝剂产生菌均不含质粒，因而认为产生絮凝性的性状不是由质粒控制的。 日本的研究结果表明，微生物絮凝物的破坏对微生物的生长有一定的促进作用，这 可能是因为游离细胞与培养液中培养物接触面积增加的缘。故这种现象说明，微生物絮 凝物的形成对于微生物的生命活动并不是必需的，絮凝剂真正的意义并不在于使微生物 6 产生絮凝，而是在于构成微生物的多糖荚膜，微生物的絮凝特性也许只是一种伴生性状 f 聱】 ( 2 ) 环境因素 培养基的成分对微生物絮凝剂产出的培养条件的研究结果表明啪哪! 。絮凝剂 的产生和碳源有较大的关系。产生n o c l 的红平红球菌以葡萄糖、果糖、山梨糖醇等 水溶性碳源较好，而非水溶性碳源如橄榄油则活性下降m 】。r e r t h r o p o l i s 以及 a l c a l i g e n e s 培养中采用不同的碳源产絮凝剂不同n 蚓，而且对生长最适合的碳源并不一 定就是对絮凝剂分泌最有利的碳源。n a k a m u r a 等对a s o j a e 的培养基的研究表明； 当培养基中加入过量的葡萄糖会抑制其絮凝物质的合成，这是由于葡萄糖分解所造成的 p h 下降所致。同样原因，其它糖类对于a s o j a e 的絮凝剂合成也有类似的作用张通等 人1 用正交设计实验对从土壤中分离到的两株絮凝剂产生菌的产絮培养基研究发现单糖 尤其是葡萄糖对产絮凝剂影响最大，果糖缺少时也不利于絮凝剂的产生。 在氮源中，尿素和硫酸铵对微生物絮凝剂的产生和细菌的繁殖最为有利嘲。用硝酸 铵和氯化铵也可促进增长，但絮凝活性只相当于用尿素的6 0 - 7 0 碳氮比对于絮凝 剂的合成也有影响，在c n 为0 6 - 1 1 4 时，动胶菌属( z o o g o l e as p ) 的絮凝活性较 高，大于或小于此值活性便迅速下降。在有机氮源中，酵母浸液和酪蛋白质氨基酸最为 有效。 在培养基中加入微量生长因子，如酪蛋白氨基酸、蛋白胨、酵母膏、丙氨酸和谷氨 酸等，可以促进絮凝剂的产生。一些有机酸，包括2 一葡糖酮酸、5 一葡糖酮酸和葡糖酸 等可以较好地促进动胶杆菌合成絮凝剂，其中2 - - 葡糖酮酸的效果最好m 1 。 无机盐的添加对絮凝剂的产生也有一定的影响，这种影响作用因絮凝剂产生菌的不 同而差异显著。f e ”、c a 2 + 添加极大地抑制了菌株s 一4 k 的絮凝活性。c a “、m n ”、b a “能够 促进f l a v o b a c t r i u ms p 合成絮凝剂，但m g ”却不利于合成。c a “能促进p a e c i l o m y c e s s p 、s a c c e r e v i s i a e c 、k c r y o c r e s c e n s 的生长和絮凝剂的合成。高浓度m 9 2 + 对微生物絮 凝剂的合成不利，f e “、c u 2 + 抑制微生物生长。培养基中的其它物质，如e d t a 、苹果 酸、柠檬酸、多聚赖氨酸、小牛血清蛋白等对微生物絮凝剂的形成也有不同的影响。这 些物质影响微生物絮凝活性表现的原因主要有两个方面，一是通过调节絮凝基因的表 7 达，二是对微生物产生的絮凝剂进行了物理或化学修饰嘲。 温度和p h 值培养温度对絮凝剂的合成也有一定影响。对r e r y t h r o p o l i s 的研 究表明，在3 0 时，絮凝剂产量要高于2 5 c 和3 7 c 时的产量。温度升高时，微生物 生长加快，但絮凝活性却降低，可见，温度的升高并不有利于絮凝剂的合成。初始p h 值最好控制在6 0 - 9 5 内，过高或过低均不利于絮凝剂的合成。 通气量絮凝剂产生菌的发酵培养基的体积尽管不影响培养液中微生物的总 量，但会影响絮凝物质的产生呻1 。此外，通气量对絮凝剂的合成也有影响，培养初期， 为满足微生物生长的需求，促进絮凝剂的产生，需大量通气；培养后期，可适当减小通 气量，以防止菌体絮凝成较大絮凝体而使活性降低蜘。 其它因素h t a k a g i 嘲在研究其它微生物对絮凝剂产生菌p a e c i l o m y c e ss p 1 1 的影响时，发现一些细菌的存在会诱导和刺激絮凝剂的产生。k u r a n e 呻1 报道分离一组混 合菌株能产生一种高效絮凝剂h p r - 3 ，混合菌株由4 个种组成，单个菌株均不能产生絮 凝剂，只有4 个菌株混合培养才能有效地产生絮凝剂。 6 影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素 微生物絮凝剂絮凝能力受到诸多因素的影响，包括絮凝剂的结构、絮凝剂的投加 量、温度、絮凝体系的p h 值以及重金属离子等因素。 ( 1 ) 絮凝剂的分子结构、相对分子量一般来说，有线性结构的大分子絮凝剂的 絮凝效果较好，如果分子结构是交联或支链结构，其絮凝效果就差微生物絮凝剂相对 分子量的大小对絮凝剂的絮凝活性至关重要，相对分子量大，吸附位点多，携带的电荷 就多，中和能力也强，架桥作用和卷扫作用明显。目前已分离纯化的微生物絮凝剂都是 多聚糖和蛋白质之类的生物大分子，分子量大都在万级至十万级，也有极少数达百万级 愧“絮凝剂所带基团对絮凝剂的性质起着很大作用，不同的基团，其极性、亲水性、 电荷的性质及电荷的中和能力对胶体颗粒的吸附和反应都不相同。一些特殊基团由于在 絮凝剂中充当颗粒物质的吸附部位或维持一定的空间结构，对絮凝活性有很大的影 响用高锰酸钾处理a s p 絮凝剂的己糖胺多聚物部分，使其氧化而释放出氧，活性就消 失乜1 ，这可能是由于絮凝剂失去了活性氨基所导致。 ( 2 ) 絮凝剂的投加剂量一般对絮凝剂都有一个最佳投加剂量，过多或过少絮凝 效果均会下降。据分析，最佳值大约在固体颗粒表面吸附大分子化合物达到饱和时的一 半吸附量，因为此时大分子在固体颗粒上架桥机率最大 ( 3 ) 温度温度对微生物絮凝剂的活性有一定的影响，适当提高温度可促进絮 凝，使絮凝效率提高。但温度对某些微生物絮凝剂的活性有较大影响，主要是因为这些 絮凝剂的蛋白质成分在高温时变性，丧失部分絮凝能力m “1 ，而由多聚糖构成的絮凝剂 就不受温度的影响曙町。尼e r t h r o p o i s 产生的絮凝剂在1 0 0 的水温中加热1 5 分钟后， 其絮凝活性下降5 0 2 1 e ( 4 ) p i t 值由于p h 值影响胶体颗粒表面电荷和微生物絮凝剂的性质、数量，从 而影响他们之间的靠近和吸附行为嘲不同絮凝剂对p h 的变化敏感程度不同。同一种 絮凝剂对不同的被絮凝物有不同的最适p h 值。s - 4 9 培养基中得到的絮凝物质，在p h = 3 0 时，其絮凝效果最佳，过高或过低都会使絮凝效果下降m ( 5 ) 金属离子有些微生物产生的絮凝剂中含有金属离子啪】，金属离子可以加强 微生物絮凝剂的桥联作用和中和作用，对微生物絮凝荆的絮凝活性有重要意义，甚至是 必需的条件啪1 。即使对于不含有金属离子的微生物絮凝剂，添加一些金属离子也能够提 高絮凝活性枷。容易受金属阳离子影响的多数是蛋白质( 多肽) 型的微生物絮凝剂。 7 微生物絮凝剂在水质改善中的应用 由于微生物絮凝剂具有絮凝范围广、絮凝活性高、安全无害、不污染环境等特点， 而且，大多不受离子强度、p h 值及温度的影响，目前广泛应用于畜产废水、工业废 水、建材废水处理、城市生活污水处理、富营养化水体等水质改良与净化中。 ( 1 ) 畜产废水处理畜产废水是含生物耗氧量较高的难处理有机废水，采用合成 有机絮凝剂虽然有较好的效果，但存在二次污染。r k x u r a n e 等研究表明：用由 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 产生的絮凝剂n o c l 处理畜产废水，加c a 处理1 0m i n ，上 清液即接近透明，t o c ( 有机物总碳) 、o d w 等指标均有显著降低，废水的t o c 由处理前 的8 2 0 0 i g l 变为2 9 8 0 m g l ，去除率达6 3 7 ；0 d 由处理前的1 5 7 变为0 8 6 ，浊度去 除率达9 4 5 。 ( 2 ) 工业废水处理在工业废水中采用活性污泥处理，形成的活性污泥容易发生 膨胀，从而影响处理效率，若添加微生物絮凝剂，会取得良好效果夏元东等采用微 生物絮凝剂和粉煤灰过滤相结合的预处理工艺，其综合的效果可以将高浓度制药废水中 的化学耗氧量去除8 0 ，基本脱色澄清，且可以将对生化处理有抑制作用的抗生素效 价予以降低。刘晖等咖1 以微生物絮凝剂处理淀粉工业废水，淀粉废水的浊度去除率高达 9 6 4 。 ( 3 ) 建材废水处理悬浮物质高的废水，用微生物絮凝剂处理有速度快、浊度去 除率高的特点张晓辉等从某水质净化厂的活性污泥中分离筛选出的三株絮凝剂产生 菌对高岭土和透辉石加工废水的絮凝效果好，浊度去处率高。黄晓武等“”分别研究了絮 凝剂产生菌h h e p 7 ，h h e - p 8 ，也p 2 1 ，h h e - p 2 4 ，h h e - a 2 6 所产絮凝剂对高浊度 建材废水的絮凝效果，结果表明：浊度去除率均在9 2 以上 ( 4 ) 给水处理供给水是一类有机物含量低、浊度较小、污染度低的水质，其水 质的好坏直接关系到人类的健康，所以其处理非常重要。董军芳等嘲微用生物絮凝剂处 理自来水4 h ，可使自来水原水的0 d 值降至0 0 3 以下，达到饮用水的标准。用微生物 絮凝剂处理自来水原水，4 h 后可使0 d 值降为0 0 2 8 ，浊度降为0 1 ，把处理后的 水样拿到泉州市第三水厂化验室进行分析( 共2 5 项) ，其结果达到国家饮用水的标准。 利用含有糖醛酸、中性糖和氨基糖的多糖絮凝剂处理河水，相比于海藻酸钠，明胶絮凝 剂，絮团大、沉降快、上清液浊度低，而且处理后c o d e r 值最小在水产养殖中，鱼类 的生活水体与供给水的水体比较接近，所以，微生物絮凝剂在水产养殖中用于水质改良 在理论上和应用上都具有一定的基础。 ( 5 ) 城市生活污水处理城市生活污水是河流、湖泊是重大的污染源之一，给人 类的饮水和养殖带来了巨大的威胁。但是，现在很多城市都建立相关的污水处理厂，并 利用从城市污水及工业废水中分离选育出的高效多功能混合菌群，包括具有絮凝作用的 芽胞杆菌( 同时有降解污染物的功能) 细菌、酵母等对城市污水处理效果表明，当细胞浓 度达2 0 m g m l 时只需通气2 0 m i n 就能完全去除污水中5 8 0 6 4m g l c o d e r 和3 7 6 2 6 m g l b o d 6 ” ( 6 ) 富营养化水处理由于现代高密度集约化养殖模式或工农业排污的原因，湖 1 0 水或水库水经常会发生季节性的藻类繁殖现象，这给常规的净水工艺和水产养殖带来许 多困难。藻类的去除方法很多，如离心、重力过滤、絮凝法等，其中利用聚合硫酸铝作 为絮凝剂去除藻类的方法被认为是有效的化学方法之一嵋时，但存在二次污染。余莉萍嘲 等采用微生物絮凝剂m b f - - 2 5 和无机絮凝剂复合使用的方法，对含藻微污染水进行处 理，明显降低了无机絮凝剂的使用量，减轻了无机絮凝剂对环境的二次污染。这为水产 养殖中处理富营养化水体提供了一个很好的思路和方法。 8 微生物絮