（微生物学专业论文）鄱阳湖北湖细菌多样性研究.pdf

摘要 摘要 鄱阳湖位于长江中下游，江西省北部，是我国第一大淡水湖，它是一过水 性、吞吐型湖泊。该湖北湖主湖区老爷庙水域位于鄱阳湖盆地北部，为鄱 阳湖入长江的咽喉要处，是江西省内河水运通往长江、长江水运进入江西的必 经之道。该水域生态环境复杂，是研究鄱阳湖微生物多样性的理想场所。 本论文首次通过16 sr d n a r f l p ( 16 sr d n ar e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 的分子生物学方法直接从鄱阳湖老爷庙水域的贫水期水样和丰水 期水样中提取总d n a ，通过p c r 扩增两个水样的1 6 sr d n a ，构建了1 6 sr d n a 文库，并且利用h a ei i i 和h i n fi 限制性内切酶对阳性克隆进行了r f l p 分析。 酶切结果进一步通过b i o t o o l s 软件( b i o l o g i c a lt o o l b o xv e r s i o n0 1 0 ) 和a n a l y t i c r a r e f a c t i o n ( v e r s i o n1 3 ) 分析，而后对每个分类单元的克隆子都进行了测序分 析，将序列提交到国际分子生物学数据库( g e n b a n k ) 进行b l a s t 相似性比较，用 m e g a ( v e r s i o n4 0 ) 软件构建系统发育树进行系统发育分析，结果表明： 1 从鄱阳湖老爷庙水域贫水期环境水样p y s 1 的1 6 sr d n a 文库中随即挑选 了9 6 个克隆，通过菌落p c r 技术筛选出了9 2 个阳性克隆，其中共5 5 个o t u s 。 在测序得到的这5 5 个克隆的1 6 sr d n a 序列中，2 条为嵌合序列。经过系统学 分析，5 3 条非嵌合序列分属于以下六大细菌类群：a l p h a - p r o t e o b a c t e r i a ( 1 1 ) 、 b e t a - p r o t e o b a c t e r i a ( 6 3 ) 、g a m m a - p r o t e o b a c t e r i a ( 9 8 ) 、e p s i l o n - p r o t e o b a c t e r i a ( 1 1 ) 、a c t i n o b a c t e r i a ( 5 4 ) 、b a c t e r o i d e t e s ( 6 5 ) 。另外，还有8 条序列 ( 1 0 9 ) 未确定所属类群( u n c l a s s i f i e d ) 。 2 从郡阳湖老爷庙水域丰水期环境水样p y s 2 的1 6 sr d n a 文库中随即挑选 了9 6 个克隆，通过菌落p c r 技术筛选出了8 8 个阳性克隆，共得到了4 4 个o t u s ， 在测序得到的这4 4 个克隆的1 6 sr d n a 序列中，无嵌合序列。经过系统学分析， 4 4 条非嵌合序列分属于以下八大细菌类群中：a l p h a - p r o t e o b a c t e r i a ( 4 5 ) 、 b e t a - p r o t e o b a c t e r i a ( 11 4 ) 、b a c t e r o i d e t e s ( 2 5 ) 、g a m m a - p r o t e o b a c t e r i a ( 2 8 4 0 o ) 、 a c t i n o b a c t e r i a ( 1 4 8 ) 、c h l o r o b i ( 4 5 ) 、p l a n c t o m y c e t e s ( 2 3 ) 、v e r r u c o m i c r o b i a ( 1 4 ) 。另外，还有7 条序列( 7 9 5 ) 未确定所属类群( u n c l a s s i f i e d ) 。 3 综合比较分析鄱阳湖老爷庙水域环境水样和其它淡水湖泊的细菌多样 性，发现p r o t e o b a c t e r i a 类群的细菌在淡水湖泊中广为存在，并且以 摘要 f l - p r o t e o b a c t e r i a 为主要类群。表明p r o t e o b a c t e r i a 是不同环境淡水湖泊的广适 类群。 4 综合比较分析了p y s 1 和p y s 2 两个1 6 sr d n a 文库的b l a s t 相似性比较 结果，发现老爷庙水域的丰水期水样的细菌群落多样性明显比贫水期水样更为 丰富。 5 b l a s t 结果和系统发育学分析表明：鄱阳湖水环境细菌群落受到了人类活 动的影响。 总之，基于1 6 sr d n a 序列的非培养技术结合统计学分析研究，结果表明鄱 阳湖水环境中具有丰富的细菌资源，值得进一步深入研究，为进一步认识鄱阳 湖微生物群落结构和功能提供客观的依据。 关键词：鄱阳湖；老爷庙水域；细菌；多样性；i 强l p ；1 6 sr d n a i i a b s t r a c t a b s t r a c t l a k ep o y a n gi so n eo ft h el a r g e s tf r e s h w a t e rl a k e si n c h i n a i ti sl o c a t e di nt h e m i d d l ea n dl o w e rr e a c h e so ft h ec h a n g j i a n gr i v e ra r e aw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co f w a t e rc a r r y i n ga n ds w a l l o w i n g t h em a i nl a k ea r e ao fn o r t hl a k ep o y a n g _ m i l o r d t e m p l ew a t e ra r e aw h i c hl o c a t e di nt h en o r t ho ft h ep o y a n gl a k eb a s i ni sat h r o a t t h o r o u g h f a r eo ft h ew a t e ro fp o y a n gf l o w i n gi n t ot h ec h a n g j i a n gr i v e r ，a n di ti sa l s o as t r a t e g i cp a s s a g eo ft h ew a t e rt r a n s p o r t a t i o nb e t w e e nt h el a k ep o y a n ga n d c h a n g j i a n gr i v e r ，w h i c hi sa ni d e as i t ef o rt h er e s e a r c ho fm i c r o b i o d i v e s i t ) ，b e c a u s e i t sc o m p l e xe c o l o g i c a le n v i r o n m e n t i nt h i ss t u d y , b a c t e r i a lc o m m u n i t i e si nt h em i l o r dt e m p l ew a t e ra r e ao fl a k e p o y a n gw e r ea n a l y z e df i r s t l yb yu s i n gm e t h o d so fr f l p ( r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e a n a l y s i s ) a n d16 sr r n as e q u e n c ea n a l y s i s t 0 t a ld n a o fs a m p l e so fd r ys e a s o na n d w e ts e a s o ni nt h i sa r e aw a se x t r a c t e db ym o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d 16 sr d n ag e n e s o fb a c t e r i af r o mt h et w os a m p l e sw e r ea m p l i f i e db yp c rt oc o n s t r u c t16 sr d n a g e n e l i b r a r i e s ，a n dt h et w ol i b r a r i e sw e r es u b j e c t e dt or f l pa n a l y s i sw h i c hr e s u l t i n g5 5 a n d4 4d i f f e r e n tr f l pt y p e s ，a n dt h es t a t i s t i c a la n a l y s i sw a sc o n d u c t e db yt h e s o f t w a r eb i o t o o l s ( b i o l o g i c a lt o o l b o xv e r s i o n0 1o ) a n da n a l y t i cr a r e f a c t i o n ( v e r s i o n1 3 ) a l lo ft h ec l o n e so ft h eo t u sa r es e q u e n c e df o rf u r t h e ra n a l y s i s s e q u e n c e so ft h e16 sr d n aw e r es u b m i t t e dt ot h ei n t e n a t i o n a lm o l e c u l a rd a t ab a n k ( g e n b a n k ) f o rs i m i l a r i t ya n dw e r ec o n s t r u c t e da sp h y l o g e n e t i ct r e e sf o r t h ea n a l y s i s o fp h y l o g e n yb ym e g a ( v e r s i o n4 o ) t h em a i nc o n c l u s i o n sw e r ep r e s e n t e da s f o l l o w ： 1 at o t a lo f9 6r e c o m b i n a n tc l o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df r o mt h eb a c t e r i a l 16 sr d n al i b r a r yo ft h es a m p l eo fp y s - 1 t h e nw es c r e e n e d9 2p o s i t i v ec l o n e sb y t h ec o l o n yp c r 硼kr r n ai n s e r t sw e r es u b j e c t e dt or f l pa n a l y s i sw h i c hr e s u l t i n g 5 5d i f f e r e n tr f l pt y p e s e a c hu n i q u er f l pt y p ew a sp a r t i a l l ys e q u e n c e d i nt h e5 5 s e q u e n e so b t a i n e d ，2c h i m e r i cs e q u e n c e sw e r ei d e n t i f i e d a n de x c l u d e df r o m s u b s e q u e n ta n a l y s e s p h y l o g e n e t i ca n a l y s e sp l a c e dt h e5 3s e q u e n c e si nt h ef o l l o w i n g s i xg r o u p so ft h ed o m a i nb a c t e r i a ：a l p h a - p r o t e o b a c t e r i a ( 1 1 ) 、b e t a - p r o t e o b a c t e r i a i i i a b s t r a c t ( 6 3 ) 、g a m m a - p r o t e o b a c t e r i a ( 9 8 ) 、e p s i l o n - p r o t e o b a c t e r i a ( 1 1 ) 、 a c t i n o b a c t e r i a ( 5 4 ) 、b a c t e r o i d e t e s ( 6 5 ) i na d d i t i o n t h e r ea r ee i g h ts e q u e n c e ( 10 9 ) b e l o n gt ot h eu n c l a s s i f i e d 2 at o t a lo f9 6r e c o m b i n a n tc l o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df r o mt h eb a c t e r i a l 16 sr d n a l i b r a r yo ft h es a m p l eo fp y s - 2 t h e nw es c r e e n e d8 8p o s i t i v ec l o n e sb y t h ec o l o n yp c r t h er r n ai n s e r t sw e r es u b j e c t e dt or f l p a n a l y s i sw h i c hr e s u l t i n g 4 4d i f f e r e n tr f l pt y p e s e a c hu n i q u er f l pt y p ew a sp a r t i a l l ys e q u e n c e d i nt h e4 4 s e q u e n e so b t a i n e dn o n ec h i m e r i cs e q u e n c e sw e r ei d e n t i f i e d p h y l o g e n e t i ca n a l y s e s p l a c e dt h e4 4s e q u e n c e si nt h ef o l l o w i n ge i g h tg r o u p so ft h ed o m a i nb a c t e r i a ： a l p h a - p r o t e o b a c t e r i a ( 4 5 ) 、b e t a - p r o t e o b a c t e r i a ( 11 4 ) 、a c t i n o b a c t e r i a ( 1 4 8 ) 、 g a m m a - p r o t e o b a c t e r i a ( 2 8 4 * 0 ) 、b a c t e r o i d e t e s ( 2 5 ) 、c h l o r o b i ( 4 5 ) 、 p l a n c t o m y c e t e s ( 2 3 ) 、v e r r u c o m i c r o b i a ( 1 4 ) i na d d i t i o n ，t h e r ea r es e v e n s e q u e n c e ( 7 9 5 ) b e l o n gt ot h eu n c l a s s i f i e d 3 b yc o m p a r i n gt h em i c r o b i a ld i v e r s i t yo ft h es a m p l e sf r o mm i l o r dt e m p l e w a t e ra r e aa n do t h e rf r e s h w a t e rl a k e s ，w ef o u n dt h ep r o t e o b a c t e r i ai sw i d l y e x i s t i n g i nf r e s h w a t e rl a k e s ，a n dt h ed o m a i ng r o u pi sb p r o t e o b a c t e r i a t h er e s u l ts h o w st h a t f l - p r o t e o b a c t e r i ai saw i d l ye x s i t i n gg r o u pi nd i f f e r e n t se n v i r o n m e n tl a k e s 4 b yc o m p a r i n gt h er e s u l t so ft h eb l a s tf o rt h ep y s 一1a n dp y s - 216 sr d n a l i b r a r y s ，w ef o u n dt h a tt h em i c r o b i a ld i v e r s i t yi nw e ts e a s o n ss a m p l ei sm o r e a b u n d a n tt h a nd r ys e a s o ns a m p l e 5 t h er e s u l t so fb l a s ta n dt h ea n a l y s i so fp h y l o g e n ys h o wt h a t ：t h eb a c t e r i a c o m m u n i t yi nl a k ep o y a n gi si n f l u e n c e db yh u m a n a c t i v i t i e s i ns u m ，r e s u l t sf r o mc u l t u r e i n d e p e n d e n tm e t h o db a s e do n16 sr d n a s e q u e n c e s w i t hs t a t i s t i c a la l a n a l y s i ss h o wt h a tt h e r ea r ea b u n d a n t p r o k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m si n t h el a k ep o y a n g ，e s p e c i a l l yi nb a c t e r i ad o m a i n ，w h i c ha r ew o r t ho ff u r t h e rs t u d ya n d s u p p l yw i t ha no b je c t i v ev i e wi n t ot h es t r u c t u r ea n dd i v e r s i t yo fm i c r o o r g a n i s m si n t h el a k ep o y a n g k e yw o r d l a k ep o y a n g ；m i l o r dt e m p l ew a t e ra r e a ；b a c t e r i a ；d i v e r s i t y ；r f l p ；16 s r d n a w 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌丕堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名c 手写碴垄砖 签字日期：口9 1 年f 月户日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌盔堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名蔓茧世至导师签名：渺 签字日期：弋年月r 日 签字日期：。1 年l 月哆日 第1 章绪论 第1 章绪论 我国是个湖泊众多的国家，现有湖泊2 7 0 0 余个，总面积达9 1 0 0 0 余平方公里， 占国土面积的0 9 5 。其中，约三分之一为淡水湖泊，主要分布在东部沿海与长 江中下游地区。这些湖泊之中蕴藏着数量惊人的生物、能源、矿产等资源。研 究表明：在湖泊生态系统中，微生物在湖泊物质循环和能量循环中起着重要的 作用，同时也是各种新型生物活性物质的潜在来源。但是随着环境的恶化，资 源的破坏性开发，自然条件的巨大变化，世界各地湖泊富营养化进程加速，水 质日趋恶化，湖泊生物资源包括湖泊微生物资源的开发与多样性研究已成为各 国关注的热点。湖泊微生物的多样性研究，有助于我们更为深入地掌握湖泊微 生物的分布特征及其在湖泊生态系统中的功能与作用，对深入开展湖泊生态环 境研究具有重要的意义。 自然界中，有9 9 的微生物是属于不可培养微生物，特别是水体微生物如 淡水微生物的可培养率为0 2 5 、海水微生物的可培养率为0 0 0 1 0 1 ，这就 导致了自然界中的绝大多数微生物仍然没有被人们所认识【l ，2 1 。但是，由于分子 生物学技术特别是环境基因组技术( 即宏基因组技术) 、生物信息学的发展，已 经极大地促进了我们对湖泊微生物遗传多样性、种群结构和湖泊微生物生态功 能的了解，本章就近年来湖泊微生物多样性的研究进展做一个简要的综述。 1 1 鄱阳湖概况 1 1 1 鄱阳湖自然概况 鄱阳湖位于长江中下游，江西省北部，是我国第一大淡水湖。鄱阳湖承纳 赣、抚、信、饶、修五河来水，调蓄后经湖口注入长江，是一过水性、吞吐型 湖泊，其南北长1 7 3 k i n ，东西平均宽约1 6 9 k m ，最宽处约7 4 k m ，最狭处约2 8 k m 湖面以松门山为界分为南( 东) 、北( 西) 两部分，南西湖面宽阔，为一主湖区， 北部湖面狭长，为湖水入江水道区。鄱阳湖流域面积1 6 2 2x1 0 4k m 2 ，占长江 流域面积的9 0 ，平均年径流量1 4 5 0 10 8 m 3 ，占长江流域的15 2 ，可见其 水量非常丰由【3 1 。 随着现代经济的迅速发展，农业技术的进步，城镇的排污量和人口不断增 第l 章绪论 加使污染鄱阳湖水体的因素日益增多，大量的营养物质( 如氮、磷等) 不断流 入湖泊，鄱阳湖水质日渐下降。鄱阳湖水质从总体看在五大淡水湖中还是比较 好的，“八五”期间水质调查，整个湖区水质均能达到国家地方水质标准i i 类 水质，仅有个别项目在不同的水期出现过超标现象。“九五 期间水质监测结 果，全湖平均有6 4 2 的断面为i i 类水，3 0 的断面为i i i 类水，超标断面为5 3 ( i v 类水) 。此外，按“中国湖泊富营养化调查规范 推荐的评分法进行评价， 鄱阳湖1 9 8 9 年富营养化评价值3 6 ，全年处于中营养状态，赣江南支入湖口富营 养化评价为5 2 ，处于富营养化状态，其他入湖河口为中营养状态，主湖区为贫 营养状态。1 9 9 8 年鄱阳湖4 - 9 月富营养化评价值为3 9 ，属中营养状态，比1 9 8 9 年富营养化程度有所增力1 ：! ；1 9 9 9 年鄱阳湖仍为4 - 9 月份富营养化评价值为3 9 ，仍 属中营养状态；2 0 0 0 年4 - 9 月份富养化评价值为4 0 ，富营养化程度增加，表明鄱 阳湖正缓慢地向富营养化趋势发展【4 5 】。故对鄱阳湖富营养化的预防治理己成当 务之急。 1 1 2 鄱阳湖水文概况 1 1 3 鄱阳湖气象概况 鄱阳湖区地处我国东部湿润季风区的中亚热带北部，气候温暖湿润，光、 热、水资源丰富，地带性植被为亚热带常绿阔叶林。夏季盛行偏南风，炎热多 雨；冬季盛行偏北风，气温低而降雨少。年平均气温1 7 6 c ，最冷月( 1 月) 平均 气温5 1 ，最热月( 7 月) 平均气温2 9 5 ，年均降水量1 4 5 0 1 5 5 0 m m ，多集中 在4 - 6 月，多年平均无霜期2 6 6 d ，平均初霜日1 1 月2 4 日，终霜日3 月4 日。 1 2 湖泊微生物多样性研究进展 1 2 1 微生物多样性的涵义 通常情况下，生物多样性是指生物物种的多样化及其变异的程度和广度， 是物种多样性，遗传多样性和生态系统多样性三个层次上的综合表述【6 j 。而微生 物多样性是所有微生物种类、种内遗传变异及其生存环境的总称，包括生活环 境的多样性、形态学上的多样性、系统进化的多样性、基因的多样性、基因型 的多样性、物种多样性以及营养和代谢类型的多样性等等【6 7 】。微生物多样性在 本质上源于遗传的多样性，即主要由碱基排列顺序的多样性和碱基数量的巨大 2 第1 章绪论 性所决定。 微生物多样性的衡量有很多标准：系统进化多样性、物种多样性、基因型 多样性和基因多样性等等。在物种多样性水平之上，微生物多样性通常是根据 具体环境中的某一类群微生物的进化距离来量化在物种多样性水平之下，微生 物多样性则是由物种的遗传参数如基因多样性和基因型多样性来衡量；在物种 水平上，微生物的多样性是由物种多样性来衡量【8 1 。 1 2 2 湖泊微生物多样性研究 湖泊是指由地表的洼地蓄水而成的水域湖泊有大有小，面积大的为湖或泊， 小的为池塘，还有些天然或人工湖泊是作为蓄水、灌溉、发电之用的为水库湖 泊是重要的淡水系统，不仅有丰富的水生植物，还有大量的鱼虾等水产，这里 又是许多动植物的栖息场所，是自然界中重要的生态系之一。 湖泊的生境类型各不相同：有的富营养，有的贫营养，有的含盐量高，有 的海拔高等等。正是由于湖泊生境类型的各不相同，使得湖泊微生物的多样性 非常丰富。近年来，随着分子生物学技术的应用，湖泊微生物多样性逐渐地被 人们所认识。众多学者做了单个或多个湖泊的微生物多样性的研究【2 3 2 4 1 ，大大的 推动了湖泊微生物多样性研究的发展。这些成果对研究微生物在湖泊生态循环 中的作用和开发湖泊微生物资源具有导向作用。 1 2 2 1 古细菌域 古细菌一直被认为只能生存于极端生境( 高盐、高温、厌氧等) 之中【9 】。随 着生物技术，特别是分子生物学技术的发展，人们开始认识到古细菌同样也存 在于非极端环境之中。它们在湖泊浮游生物中占有相当大的比重，在湖泊生态 系统的生物地化循环中具有举足轻重的作用。 大量研究表明，古细菌在不同的湖泊中的数量和种类分布极不平衡。首先， 湖泊水体中，古细菌的数量较多，是湖泊浮游生物的主要的细胞组成，而在湖 泊沉积物中( 极端环境除外) ，古细菌仅约占沉积物原核生物的1 i l0 1 其次，不 同类型的湖泊中湖泊古细菌类群会出现不同的分布，如a i j a za h m a dw 砌等【1 1 】 构建了印度l o n a rc r a t e r 湖古细菌的1 6 sr d n a 文库，发现该湖的古细菌主要属于 c r e n a r c h a e o t a ( 泉古菌门) 中的s u l f o l o b u s ( 硫化叶菌属) 和e u r y a r c h a e o t a ( 广 古菌门) 中的m e t h a n o c a l c u l u s ( 甲烷烁菌属) ；j u l i ai k s c h w a r z 等【l o 】报导在以色 列一个富营养湖泊k i n n e r e t 湖内，古细菌主要属于m e t h a n o m i c r o b i a l e s ( 甲烷微菌 3 第1 章绪论 目) 和m e t h a n o s a r c i n a l e s ( 甲烷八叠球菌目) 等等。由上可以看出，湖泊中大多 数的古细菌都属于e u r y a r c h a e o t a 和c r e n a r c h a e o t a ，但是在目或属的水平上，在 不同的湖泊中微生物的种类却各不相同，说明了在湖泊生态系统中，古细菌的 种类分布是不平衡的。此外，同一类群的古细菌在许多不同的湖泊中也都能够 鉴定得到。如从上述以色y i j k i n n e r e t 湖中鉴定得到的m e t h a n o s a e t a c e a e ( 甲烷毛菌 属，属于m e t h a n o s a r c i n a l e s ) 和m e t h a n o m i c r o b i a l e s 在其它的富营养和中等营养的 湖泊_ b i w a 湖( 位于日本) 、l a k es o y a n g 湖( 位于韩国) 、l a k ed a g o w 湖( 位 于德国) 中也存在，而且在瑞士的r o t s e e 湖中，m e t h a n o s a e t a c e a e 克隆的数量更 是占该湖古细菌克隆的9 1 t 1 2 】。进一步说明了m e t h a n o s a e t a c e a e 和 m e t h a n o m i c r o b i a l e s 这两类古细菌在湖泊生态系统中是广泛存在的。 湖水以及湖泊沉积物中的新属种古细菌不断地被发现。以前人们一直认为 绝大多数的古细菌都属于c r e n a r c h a e o t a 和e u r y a r c h a e o t a ，但是随着许多新属种 的古细菌从各种环境中鉴定出来，人们对于古细菌分类的认识也发生了根本的 改变。如：k o r a r c h a e o t a ( 初古菌门) 因为一直未得到纯培养而不受重视。但t h o m a s a a u c h t u n g 等【1 3 】发现在美国国家黄石公园的热泉、河流、湖泊、土壤等环境中 k o r a r c h a e o t a 的多样性非常丰富，表明k o r a r c h a e o t a 在古生菌中也占有重要的地 位。另外在湖泊中也分离鉴定得到了其它的新属种的古细菌，其中，产甲烷古 菌与硫酸盐还原古菌在湖泊的碳循环和硫循环中起着重要的作用【l 4 1 。 1 2 2 2 细菌域 目前在美国国家菌种保藏中心( a t c c ) 保藏的从湖泊中分离得到的主要细 菌类群大多数都属于p r o t e o b a c t e r i a ( 朊细菌门) ，它包括了a 、p - ，弘、参、 e - p r o t e o b a c t e r i a ( q 、b 、丫、6 、朊细菌纲) ，b a c t e r o i d e t e s ( 拟杆菌门) ， c y a n o b a c t e r i a ( 蓝细菌门) ，a c t i n o b a c t e r i a ( 放线菌门) ， v e r r u c o m i c r o b i a ( 疣 微菌门) ， c h l o r o b i ( 绿菌门) ，p l a n c t o m y c e t e s ( 浮霉菌门) ，f i r m i c u t e s ( 厚壁菌 门) 等等【1 5 】。z w a r t ，g ( 2 0 0 2 ) 等研究了北美，亚洲，欧洲等不同湖泊和河流的 细菌多样性，主要的湖泊微生物有以下几类：仅，伊，) ，一、口、e - p r o t e o b a c t e r i a ， b a c t e r o i d e t e s ， c y a n o b a c t e r i a ，a c t i n o b a c t e r i a ， v e r r u c o m i c r o b i a ，c h l o r o b i ， 它们之中的大多数目前都不可培养【1 6 】，z w a r t ，g 等得到的实验结果很好的证明 了以上结论。 湖泊细菌多样性随着湖泊盐度的变化而变化。q i n g l o n gl w u 等【1 7 】报道盐度 是影响细菌群落结构多样性的一个重要因素，他们发现例如不同p r o t e o b a c t e r i a 4 第1 章绪论 的相对丰度会随着盐度的变化而发生剧烈的演替，而且只有少数种类的湖泊细 菌能适应大范围的盐度变化。h o n g c h e nj i a i l g 等【1 8 】研究中国西北的c h a k a 湖发现 高盐度的湖水中鉴定的克隆大部分都属于b a c t e r o i d e t e s ，低盐度的湖水底泥中鉴 定的克隆大部分属于低革兰氏阳性菌。这就说明了盐度是影响湖泊细菌群落多 样性的一个重要因素，不同盐度环境中的湖泊细菌类群会发生很大的变化，而 且某一特定细菌类群的丰度在很大程度上也会受到盐度的影响，而且只有少数 种类的细菌能够在不同盐度的湖泊环境中找到。 在碱性湖泊中，细菌的群落结构也有其特有的多样性分布。例如p u r i f i c a c i o n l o 。p e z g a r c i a 等【l9 】研究了碱性v a n 湖，结果显示大多数的细菌都属于低g + c 革 兰氏阳性菌f i r m i c u t e s ，且它的多样性最为丰富。其它的类型包括反，p - ，y - p r o t e o b a c t e r i a ， c y t o p h a g a - f l e x i b a c t e r b a c t e r o i d e s ，c y a n o b a c t e r i a 、 a c t i n o b a c t e r i a 。其中，饺、p - 、产p r o t e o b a c t e r i a 的序列与已经鉴定的能降解有机 化合物的细菌同源性很高，而高g + c 革兰氏阳性菌a c t i n o b a c t e r i a 的序列与能够 降解烃类物质的嗜碱性菌动性球菌属( p l a n o c o c c u s ) 和芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 的同源性非常高。实际上，在碱性湖泊中都能找到革兰氏阳性菌。y a n h em a 等 【2 0 】研究了中国内蒙古的碱性b a e r 湖，克隆中大部分都属于革兰氏阴性菌，其中 a 、伊、产、$ - p r o t e o b a c t e r i a 所占的比重分别为2 4 、3 l 、3 3 、2 。而革兰 氏阳性菌在文库中所占的比例却很小。这说明了在不同的碱性湖泊中，细菌群 落的微生物多样性也各不相同；而且在碱性湖泊中，存在着大量的能够降解有 机化合物的细菌，他们的存在可能同湖泊环境的化学平衡息息相关。 湖泊的深度同样也会对细菌的微生物多样性产生影响。在不同的深度，湖 泊细菌的微生物多样性的分布也不相同。s h a h e e nb h u m a y o u n 等 2 l 】研究了不同 深度的湖泊微生物多样性。他们发现文库中的细菌类型大多都属于a p r o t e o b a c t e r i a ( 占6 ) 、扎一o t e o b a c t e r i a ( 占1 0 ) 、c f b ( 占1 9 ) 、高g + c 革 兰氏阳性菌a c t i n o b a c t e r i a ( 占2 5 ) 、低g + c 革兰氏阳性菌b a c i l l u s 和c l o s t r i d i u m ( 占1 9 ) ，还有一部分属于伊、j - p r o t e o b a c t e r i a 和圪u c o m i c r o b i a l e s 。研究结 果说明了下层水样( 缺氧环境) 的细菌的微生物多样性比上层水样( 有氧环境) 更为丰富。a a i k ed ew e v e r 等【2 2 】得到了相似的结论。由此可以看出，湖泊细菌的 微生物多样性随着湖泊深度的变化会发生显著的变化，一般来说，下层水样的 细菌微生物多样性更为丰富，这可能是由于湖底的特定环境( 如缺氧、低温等) 所造成的【1 4 】。 5 第1 章绪论 随着湖泊营养类型的不同，湖泊细菌类群的微生物多样性也不尽相同。 h i d e y u k it a m a k i 等【2 3 】发现富营养湖泊中主要细菌是p r o t e o b a c t e r i a ( 4 7 ) ，且在 p r o t e o b a c t e r i a 中，参、伊、弘尸厂o t e o b a c t e r i a 分别占2 3 2 、1 2 5 、9 8 。而n i t r o s p i r a 则占全部克隆的1 3 4 。文库中其它的已鉴定的克隆还有a c i d o b a c t e r i a 、 c h l o r o f l e x i 、 b a c t e r o i d e t e s 、c h l o r o b i 等等。另外，季节的变化会很大程度上对 富营养湖泊、腐殖质湖泊和贫营养湖泊中细菌群落的微生物多样性产生影响。 a c y a n n a r e l l 等1 2 4 1 运用a r i s a 分别对不同季节的富营养湖泊m e n d o t a 、腐殖质湖 泊c r y s t a lb o g 和贫营养湖泊c r y s t a l 进行了研究。他们发现随着季节的变化，三个 湖泊细菌群落的微生物多样性也会发生变化。在春秋两季，湖泊细菌的群落组 成相对比较稳定，但是在夏季却会发生较大的变化，变化的特点就是细菌微生 物多样性的减少。 而淡水湖泊中的细菌群落的多样性分布也有其自身的特点，a l l g a i e r , m 等研 究了德国北部的四个淡水湖泊( l a k es t e c h l i n 、l a k eg r o s s ef u c h s k u h l e 、l a k e b r e i t e rl u z i n 、a n dl a k et i e f w a r e n ) ，他们发现了a ，伊、y - p r o t e o b a c t e r i a 、 a c t i n o b a c t e r i a ，b a c t e r o i d e t e s ，c y a n o b a c t e r i a ，v e r r u c o m i c r o b i a ，p l a n c t o m y c e t e s 在这四个湖泊中都出现了，而且其中以p r o t e o b a c t e r i a 、a c t i n o b a c t e r i a 、 b a c t e r o i d e t e s 为主要的细菌类群，而且通过与以色列k i n n e r e t 等若干个湖泊中的 细菌群落结构比较，发现了几乎在所有的湖泊中出现了a c t i n o b a c t e r i a ，因此他们 认为a c t i n o b a c t e r i a 是淡水湖泊中一种普遍存在的细菌类群。但是，在k v a nd e r g u c h t 等的研究中，他们发现了荷兰境内两个相邻的淡水湖泊中，各种类群的细 菌出现的比例不同。在b l a n k a a r t 湖中，f l - p r o t e o b a c t e r i a 是优势类群而 a c t i n o b a c t e r i a 所占的比例比较少，而相反的，在v i s v i j v e r 湖中，a c t i n o b a c t e r i a 却 成为了优势类群。以上研究都这说明了不同的淡水湖泊中的细菌群落结构是大 致相同的，但是，同一细菌类群在不同的淡水湖泊之中所占的比例存在着差异。 由上可以看出，湖泊细菌的多样性是非常丰富的，而且随着湖泊生境类型 的不同，他们的群落组成也各不相同。它们的变化虽然没有统一的规律，但是 通过对已报道文献的对比总结，还是能够粗略的了解到不同环境下的湖泊细菌 类群的分布。 1 2 2 3 真核生物域 超微真核藻类( p i c o e u k a r y o t e s ) 是地球上数量最多的真核生物，在海洋和 湖泊环境中的密度更是高达1 0 2 1 0 4 个细胞m l t 2 5 1 。它是环境生态系统的微生物 6 第1 章绪论 食物链中必不可少的重要组成部分，在环境地球化学循环中也扮演着重要作用。 但是，目前有关真核微生物多样性的研究多是集中于海洋环境中，湖泊环境中 的真核微生物多样性研究报道较少。 t a k i s h i t ak 等1 2 6 l 对日本n a m a k o i k e 湖的真核微生物多样性研究，发现大多 数的克隆都属于已知的真核微生物类群，如c e r c o z o a (