（食品科学专业论文）家禽四环素蓄积性毒性试验及残留HPLC检测研究.pdf

摘要 叫环素在国内外兽医i 临床上广泛用作猪、牛、 添加入饲料预防疾病的发生。由于长期广泛应用， 断提高。又由于大剂量滥用，使畜禽组织中残留量 极大危害。国内外早己报道可引起“二重感染”，引 毒害还可造成致畸、致癌。 鸡、鸭等动物的抗菌药，也常 细简产生抗药性，使用剂量不 不断增高，被人们食用后带来 起四环素牙，胎儿死亡。长期 本研究设计以4 周龄鸡和1 5 日龄的鸭作1 个月四环素蓄积性毒性试验，采用 单因次三水平试验设计，对试验动物分为四个处理，0 组( 对照组) 、试验i 组( 低 剂量) 、1 1 组( 中剂量) 和1 1 1 组( 高剂量) ，按照设计剂量分别给低、中、高剂量 组每只鸡口服投药l o o m g ( k g d ) 、2 0 0 m g ( k g d ) 、1 0 0 0 m g ( k g d ) ，对照组不投 药。系统研究试验动物口服四环素不同剂量后所表现的生产性能、生前症状、剖 检变化、组织学切片、血液生化指标和组织四环素残留的h p l c 检测。为生产上及 时检出四环素超标的畜禽产品和早期防止四环素残留超标提供科学依据。 鸡蓄积性毒性试验结果：生前症状：投药后，第3 d 起试验组鸡陆续出现精 神沉郁、食欲减退、嗜睡。食欲减半或废绝，羽毛蓬松，跛行或者卧地不起，部 分鸡出现关节肿大，变形，眼半闭或全闭，鸡冠和面部苍白，排稀便。剖检变 化：及时剖检自然死亡鸡和投药1 个月宰杀试验鸡，肝。肾明显肿大，为对照组肝 肾大小的1 2 倍。肝边缘钝圆，有出血点和坏死灶，肾肿大，有红色的出血点。 心包积液，肿大。组织切片检查：肝以肝细胞胞变性坏死为主要特征，细胞索 排列紊乱。心肌肿大，间隙增宽。小肠绒毛脱落坏死，绒毛下方有炎性细胞。 血液生化指标：反应肝脏、肾脏和心脏损害程度的血液生化指标都升高。检测早 期癌变生化指标甲胎抗原( a f p ) 和癌胚抗原( c e a ) 均为阴性。h p l c 检测鸡组 织中残留：肌肉0 组、i 、1 i 、i i i 组分别为未检出、0 1 4 、0 3 9 、1 3 3 ( m g k g ) 。 鸡肝脏：0 组、j 、1 i 、i i i 组分别为未检出、o 2 5 、0 4 7 、1 6 3 ( r n g k g ) 。说明i 、 i i 、i i i 三个组肌肉、肝脏的残留量均超过n y 5 0 3 4 2 0 0 5 标准。 鸭蓄积性毒性试验结果表明，上述各项试验与鸡蓄积性毒性试验完全平行。 不过鸭生前症状比鸡轻微，未发生死亡。剖检变化仍以肝明显肿大，呈黄褐色， 点状出血为主要表现。组织学切片以肝、肾变性坏死为特征。血液生化指标以肝、 肾、心损害为主。h p l c 检测组织中四环素的残留，i 、】i 、i 】i 组肌肉和肝脏都高， l 均超过y 5 0 3 4 2 0 0 1 标准。 本研究的创新性：本试验创造性地通过鸡四q ：条蓄积性毒性试验系统地铆f 究 了动物，上前症状、剖检变化、组织学切片、血液生化指标、h p l c 检测组织中的残 留。同时又以肉鸭作重复试验，肉鸭试验结果与鸡一致。上述各项结果比较科学 完整地反映了四环素的毒性、吸收、分布和贱留检测。本研究内容少见报道，具 有先进性和创新性，有重要的生产价值和现实意义。 关键词：四环素高效液相色谱血液生化指标毒性残留 i l s t u d yo nt e t r a c y c l i n ea c c u m u l a t i v et o x i c i t yt e s ta n dd e t e c t i o no f t e t r a c y c l i n er e s i d u e si nt i s s u eo f c h i c k e na n dd u c kb yh p l c g ux u e d o n g ( m a j o r ：f o o ds c i e n c e ) d i r e c t e db yc h e ny i z ip r o f e s s e r t e t r a c y c l i n ew a sw i d e l yu s e da sa n t i b a c t e r i a lt op i g s ，c a t t l e ，c h i c k e n s ，d u c k sa n d o t h e ra n i m a l si nt h ed o m e s t i ca n di n t e r n a t i o n a l a n di to f t e nu s e da sa d d i t i v ea d dt of e e d t op r e v e n td i s e a s e s b e c a u s eo f e x t e n s i v ea p p l i c a t i o nf o ral o n gt i m e ，i te n g e n d e r e d d r u g r e s i s t a n tb a c t e r i a ，t h eu s eo fd o s er i s i n gu n c e a s i n g l y a l s o ，b e c a u s eo fh i g h d o s e a b u s ef o ral o n gt i m e ，i na n i m a lt i s s u et e t r a c y c l i n er e s i d u e sr i s e d w h e np e o p l ee a t e d t h e s ef o o d ，i tc o u l db r i n gg r e a t l yh a r mt oh e a l t h i ta l r e a d yb o t ha th o m ea n da b r o a d r e p o s e dt h a ti tc o u l dt r i g g e r ”d o u b l ei n f e c t i o n ”，t e t r a c y c l i n et e e t h ，f o e m s d e a t h i ta l s o c o u l db et e r a t o g e n i ca n dc a r c i n o g e n i cf o ral o n gt i m eu s e t h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt o4 - w e e k o l dc h i c k e n sa n d15 - d a y o l dd u c k sf o ra n a c c u m u l a t i o no ft e t r a c y c l i n et o x i c i t ye x p e r i m e n t a t i o n t h i st e s ta d a p t e ds i n g l el e v e lt h r e e d i m e n s i o n a l d e s i g n ，t h e t e s ta n i m a l sw e r ed i v i d e di n t of o u rt r e a t m e n t ，g r o u p 0 ( c o m p a r i s o ng r o u p ) ，g r o u pi ( 1 0 wd o s e ) ，g r o u pi i ( m i d d i n gd o s e ) a n dg r o u pi i i ( h i 曲 d o s e ) a c c o r d i n gt ot h ed e s i g n ，舀v 抽ge a c hd o s eg r o u pe a c hc h i c k e na n dd u c ko r a l d o s a g el o o m g ( k g d 1 ，2 0 0 m g ( k g d ) ，1 0 0 0 m g ( k g d ) t h i se x p e r i m e n t a t i o nt e s t e d a n i m a l so fd i f f e r e n t d o s e so f o r a l t e t r a c y c l i n ep e r f o r m a n c e ，p r o d u c t i o n p e r f o r m a n c e ，c l i n i c a ls y m p t o m sa f t e ra n i m a lt a k eo r a l l yd i f f e r e n td o s a g eo ft r a c y c l i n e ， c u to p e na n de x a m i n ec h a n g i n g ，h i s t o l o g ys l i c e s ，t h eb i o c h e m i c a li n d e xo f b l o o dp l a s m a a n dm e a s u r i n g ，t e t r a c y c l i n er e m a i n si n t i s s u ew i t ht h em o d e r nm o s ta d v a n c e d i n s t r u m e n th i i g h - e f f i c i e n tl i q u i dp h a s ec h r o m a t o g r a p h ( h p l c ) i tc o u l do f f e ra s c i e n t i f i cb a s i sf o r t h ep r o d u c t i o no f t i m e l yd e t e c t i o no ft e t r a c y c l i n es u b s t a n d a r da n i m a l p r o d u c t sa n dp r e v e n t i o ne a r l yt e t r a c y c l i n er e s i d u e se x c e e d i n g c h i c k e na c c u m u l a t i n gt o x i c i t yt e s tr e s u l t s ： s y m p t o m sb e f o r ed e a t h ：a f t e rt a k i n g t e t r a c y c l i n e ，c h i c k e n si nt h et e s tg r o u ph a da p p e a r e dp o o ri ns p i r i ts u c c e s s i v e l y , t h e a p p e t i t ed e c r e a s i n g ，a d d i c t e dt os l e e p i n g ，f l u f l yf e a t h e r s ，t h ea p p e t i t ei sr e d u c e db yh a l f o ra b o l i s h e dd e f i n i t e l y , d o e sn o tg e tu pl y i n g ，e y e sh a l f - c l o s e do rc l o s ea l l ，c o c k s c o m b a n df a c ep a l e ，w a t e r ys h i t 匡) a n a t o m yc h a n g e s ：c u to p e na n de x a m i n et h en a t u r a ld e a t h i l l c h i c k e na n dc h i c k e ni no n em o n t ht i m l y 1 i v e ra n dk i d n e yo b v i o u s l yi n t u m e s c e d t h e s i z ew a sa sb i gi - 2t i m e sa sc o m p a r i s o ng r o u pl i v e r t h el i v e rm a r g i n a lw a so b t u s e ， t h e r ew e r eh e m o r r h a g i ca n dn e c r o t i cl e s i o n s ，k i d n e yi n t u m e s c e d ，b l e e d i n gr e d p e r i c a r d i a le f f u s i o na n ds w e l l i n g b i o p s y ：r e g a r dl i v e rc h a n g en e c r o s i sa sm a i n c h a r a c t e r i s t i c ，l i v e rl i t t l e l e a fc e l la r r a n g ev e r ym u c hd i s o r d e r l y c a r d i a cm u s c l e b e c a m ee n l a r g e m e n t ，t h eg a pw i d e n e d s m a l li n t e s t i n ef l o s sb e c a m es h e d d i n gn e c r o s i s a n db e h i n df l o s st h e r ew e r ef l o c ki n f l a m m a t o r yc e l l s p l a s m ab i o c h e m i c a li n d e x ： r e a c t i o nl i v e r ，k i d n e ya n dh e a r td a m a g e di nt h eb l o o db i o c h e m i c a li n d i c a t o r si n c r e a s e d e a r l yd e t e c t i o no fc a n c e ra n db i o c h e m i c a li n d i c a t o r so faf e t a la n t i g e n ( a f p ) a n d c a r c i n oe m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) w e r en e g a t i v e o d e t e c t i o no fc h i c k e nt i s s u e r e s i d u e s ：m u s c l eg r o u p0 ，i ，i i ，i i ii e s p e c t i v e l yn d ，0 14 ，0 3 9 1 3 3 ( m g k g ) c h i c k e n l i v e r ：g r o u p 0 ，i ，i ia n d1 1 1r e s p e c t i v e l yn d ，0 2 5 ，0 4 7 ，1 6 3 ( m g k g ) n o t e dt h a tg r o u pi ， i i ，i i im u s c l ea n dl i v e rt e t r a c y c l i n er e s i d u e sv o l u m ee x c e e dn y 5 0 3 4 2 0 0 5s t a n d a r d s d u c k sa c c u m u l a t i n gt o x i c i t yi st e s t e d t e t r a c y c l i n er e s i d u e sr e p e a t e de x p e r i m e n t s ： s y m p t o m sb e f o r ed e a t hd u c k sw e r e m o r em i l dt h a nc h i c k e n s a n dr i oo n ed e a t l l a f t e r d i s s e c t i o n ，if o u n dt h a tl i v e rs i g n i f i c a n t l ye n l a r g e d ，y e l l o w i s h b r o w n ，s o m ef o r m sb l e e d i no r d e rt om a i n l yb e h a v e h i s t o l o g i c a ls l i c e si nt h el i v e r ，k i d n e yn e c r o s i s p l a s m a b i o c h e m i c a li n d i c a t o r sn o t e dt h a tt h el i v e r ，k i d n e y ，h e a r td a m a g e dm a i n l y h p l c d e t e c t i o no fr e s i d u e so ft e t r a c y c l i n e ，i ，i i ，i l lm u s c l ea n dl i v e rw e r eh i g h ，e x c e e d n y 5 0 3 4 2 0 0 1s t a n d a r d s t h ei n n o v a t i o n ：t h i st e s tc r e a t i v e l yd i dc h i c k e nt e t r a c y c l i n ea c c u m u l a t i o nt o x i c i t y t e s t s t u d i e dt h ea n i m a l s s y m p t o m sb e f o r ed e a t h ，c u to p e na n de x a m i n ec h a n g i n g ， h i s t o l o g i c a ls l i c e d ，p l a s m ab i o c h e m i c a li n d e xa n dh p l cd e t e c t i o no fr e s i d u e si nt i s s u e s w h i l et a k em e a td u c ka sr e p e a t e de x p e r i m e n t s ，t h em e a td u c k 。st e s tr e s u l tk e e p st h e s a m ew i t hc h i c k e n t h e s er e s u l t s r e f l e c tt h es c i e n t i f i ci n t e g r i t yo f t h et e t r a c y c l i n e t o x i c i t y ，a b s o r p t i o n ，d i s t r i b u t i o n ，d e g r a d a t i o na n d r e s i d u e st e s t i n g t h er e s e a r c hc o n t e n t w e r er a r e l yr e p o r t e d i tw a sa d v a n c e da n di n n o v a t i v e i th a di m p o r t a n tp r o d u c t i o nv a l u e a n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e k e y w o r d s ：t e t r a c y c l i n e ；h p l c ；b i o c h e m i c a li n d i c a t o r s ；t o x i c i t y ；r e s i d u e s 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位沦文是我个人在导师指导f 进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢毒固睾御) 年6 月汐日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 叩年莎月2 汐日 加7 年名只z 日每燹 哆 厂 毒传 l 文献综述 新中国成立以来，我目的家禽养炳业取得了长足的进步，特别是改革丌放以 后，我国的家禽养泊更是迅速发展。养殖技术不断提高，养埴规模不断扩大，产 量快速提高，经济效益和社会效益显著。2 0 0 4 年我国禽肉总产量仅次于美国，居 全球第二位l l i 。2 0 0 6 年，我国家禽锎养量15 0 多亿只，禽蛋产量全球第一。然而 随着养殖的集约化和规模化，家禽疫病的发生也越加频繁。由于养殖人员对科学 知识的缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用抗生素、不合理使用抗生素的现 象在当前畜牧业中普遍存在。这不仅对人体健康造成直接危害，对家禽养殖业发 展造成极大危害，而且还造成了家禽肉食品中的药物残留1 2 - 3 1 。是否有效控制抗生 素的使用已经成为严重制约我国家禽产品出口，养殖业健康发展的瓶颈。四环素 类药物为家禽养殖业上使用最多的一类药物，四环素的残留研究已经成为目前的 研究热点。 四环素属于四环素类抗生素。抗生素是指由微生物在代谢过程中所产生的化 学物质，或用其他方法取得的同样物质中，具有能以极小的浓度抑制他种微生物 的生长，甚至杀灭他种微生物或具有抑制肿瘤细胞的分裂、增殖等性能的有机物 质4 】【5 1 。兽药残留足指动物产品的任何可食部分所含兽药母体化合物及其代谢物， 以及与兽药有关的杂质。兽药残留既包括原药和药物在动物体内的代谢产物和兽 药生产中所伴生的杂质。养殖环节用药不当是产生兽药残留的最主要原因【6 l 。 1 9 7 5 年，前苏联及东欧国家就曾建议禁止在兽药添加剂中使用四环素、土霉 素、青霉素，现已禁止将医用抗生素作为饲料添加剂；1 9 7 6 年日本开始执行饲 料安全法，禁止将四环素、土霉素、链霉素作为饲料添加剂：2 0 0 0 年欧盟委员 会( e c ) 修订兽药法时，对土霉素、四环素及青霉素规定为有限使用药物。目前， 瑞典和丹麦己禁止在饲料中添加四环素类抗生素| 7 1 】。 我国兽药管理条例中明确规定，凡用于动物疾病，促进动物生长的品种 必需经农业部批准。2 0 0 2 年农业部颁布了关于动物性食品中兽药最高残留限量 的通知0 0 ，规定了1 0 0 多种兽药的使用品种及在靶组织中最大残留限量。2 0 0 1 年7 月3 日还发布了饲料药物添加剂使用规范，2 0 0 3 年( 2 6 5 ) 号公告中明文 规定，不得使用不符合兽药标签和说明书管理办法规定的兽药产品，不得使 用食品动物禁用的兽药及其他化合物清单【l l 】所列2 1 类药物及未经农业部批准 的兽药，不得使用进口明令禁用的兽药。 国际组彩 也很关j j ：抗牛祟歧刚问题，早在1 9 8 6 年，联合吲粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 就在食- 5 法典委员会( c a c ) 的倡导卜- ，联合发起和组 织了食品中兽药钱留法典委员会( c c r v d f ) ，目的足控制食品中兽药残留，建立 对兽药残留的取样及分析方法，对兽药残留进行了毒理学评价，并制定了动物组 织及其产品中兽药残留的最高限量标准( m r l s ) 和休药法规1 1 2 - 1 4 i 。对抗生素的违 舰使用，滥用及使用方法不当会引起在食品中的残留超标。抗生素在食品中的残 留问题日益突出，严重影响了食品安全，人们长期摄入含有抗生素残留的食品后， 药物在体内蓄积，当浓度达到定量后，对人体产生毒性作用1 1 5 。因此，加快对 食品中抗生素残留的检测及其毒害的研究，已成为我国食品科学与安全的重要任 务。 1 1 四环素的化学结构及理化特性 1 1 1 四环素的化学结构 四环素( t e t r a c y c l i n e ，t c ) ，分子式为c 2 2 h 2 6 n 2 0 7 ，分子量4 3 0 4 5 ，属于四环 素( t e t r a c y c l i n e ，t c ) 类的一种广谱抗菌药物，具有十二氢化并四苯基本结构，只 是个别取代基与取代基的空间位置不同。四环素的结构如下f 1 6 1 ： h ，c m h 1 1 2 四环素的理化性质 化学结构中4 位的二甲氨基显碱性，c 3 ，c 5 ，c 6 ，c 1 0 ，c 1 2 ，c 1 2 a , 含有酚羟基或 烯醇基，显酸性，故为酸碱两性化合物，能在酸性或碱性溶液中溶解。在干燥条 件下比较稳定，但遇光易变色。在酸性、碱性条件下均不稳定，失去活性i l r l 。 在酸性环境下，四环素易脱水形成脱水物，反式消除生成黄色脱水物。抗菌 活性减弱或者完全消失。 四环素脱水四环素 四环素在碱性条件下，可开环生成具有内酯的异构体。由于o h 一的作用，c b 上羟基形成氧负离子，c 。：烯醇式变为酮式，c 。羰基的拉电子作用使c 。带正电荷。 2 c 的氰负离于进行分予内亲卡幺逊攻经过电子转移，c 环破裂，牛成内哺结构“。 四环素异四环素 四环素分子存在c 1 0 一酚羟基和c 1 2 一烯醇基，可与金属离子螯合，形成有色 络合物。也可与钙离子、铝离子形成黄色络合物，与铁离子形成红色络合物。四 环素的理化性质为四环素的检测和鉴定提供了理论依据1 1 9 1 。 1 2 四环素残留超标对人体的危害 人们长时间摄入四环素残留超标的食品后，四环素会在人体内慢慢蓄积，当 药物浓度达到一定量时，可以对人体产生多种急慢性中毒，导致人体多种器官的 病变。 1 2 1 发生二重感染 长期摄入四环素残留超标的食品，可使机体内感染的病原菌和寄生菌受到抑 制，不敏感或耐药菌得以滋生，非敏感菌大量生长，造成菌群失调而引起二重感 染【2 0 1 。临床上表现为鹅1 3 疮、败血症、尿路感染、霉菌性呼吸道炎、阴道炎和葡 萄球菌肠炎( 伪膜性肠炎) 等，特别在年老、幼儿、体弱，手术后或有严重疾病( 如 恶性肿瘤、糖尿病等1 患者尤易发生【2 】。 1 2 2 肝肾及肠胃反应 长时间摄入四环素残留超标的食品可引起严重的肝损害。妊娠妇女使用四环 素可引起脂肪肝，伴有胃功能不全时易发生胰腺炎1 2 2 】。可引起恶心、呕吐、腹部 不适、腹泻等症状出现并使肠内菌群失调，肠粘膜受损，影响肠道吸收。如在食 道停留时间过长，还可引起食道溃疡。肾功能减退者可发生四环素蓄积性中毒。 1 2 3 对骨和免疫系统的影响 四环素可在牙齿骨的钙质区内沉积，并长时间残留，引起牙齿黄染，俗称“四 环素牙”。牙齿黄染程度和服用四环素或者食用四环素残留超标食品的时间和剂量 成正比。长时间摄入四环素残留超标的食品可抑制白细胞吞噬细胞的能力，另外 四环素还可抑制淋巴细胞的转化，尤其在病原攻击时表现出很强的抑制能力 2 3 l 。 1 3 四环素的抗菌机理及耐药性 细菌耐药性指的是某些细菌菌株对通常能抑制其生长繁殖的某种浓度的抗菌 药物产生的耐受性一j 。对畜禽来说，经由饲料或治疗途径反复接触某种抗生素， 可使其体内的敏感菌受到抑制，耐药菌大量繁殖，耐药性不断增强，使得抗生素 失去其治疗作用。人体长期摄入含四环素的畜禽食品，样会影响体内菌群的耐 药性。但更为严重的是，如果食用了烹饪不当的含四环素的畜禽食品，有可能会 把畜禽所带的耐药菌株直接传播给人。畜禽病原菌的耐药基因也因此传递给人类 病原菌1 2 5 - 2 6 1 。 细菌耐药性的增加会使四环素疗效下降，疗程延长，复发率升高，有时还会 引起并发症。随着细菌耐药性的不断增强，传统的抗生素越来越失去效用，新药 的开发赶不上耐药性产生的速度，只会陷入恶性循环。因此，要求广大科技人员 要严格按照国家药物标准，合理使用四环素1 2 7 】。 1 4 四环素在动物机体中的吸收分布及残留 1 4 1 四环素在体内的吸收 四环素口服后吸收很不规则、不完全，吸收率为6 0 8 0 ，主要在小肠的上段 被吸收。食物会影响四环素的吸收，含钙、镁、铝或者铁丰富的食物会降低四环 素的吸收。胃肠道内的钙、镁、铝、铁、锌、锰等多价金属离子，都能与四环素 形成难溶的螯合物，而使药物吸收减少，因此，不宜与含有多价金属离子的药物 或饲料、乳制品共服。内服后约2 4 h 血液浓度达到峰值，四环素在血液中的半衰 期约为8 小时1 2 8 1 。 1 4 2 四环素在体内的分布 四环素被吸收后，在体内分布广泛，并能沉积于牙和骨组织中，他们与血液 蛋白的结合率为2 0 3 0 ，因此四环素容易渗入胸腔、腹腔、胎儿循环及乳汁中， 但不易透过血脑屏障，脑脊液中的药物浓度一般仅为血药浓度的1 1 0 。四环素主 要以原形经。肾小球过滤排出，故尿药浓度较高，有利于治疗尿路感染。 1 4 3 四环素在体内的残留 四环素在体内主要存在于胆、脾，尤其易沉积于骨骼和牙齿；四环素经口服 排泄量较少，在2 0 3 0 。可在肝内浓缩，经胆汁分泌，胆汁的药物浓度约为 4 m 中的1 0 2 0 倍。有 h 当一部分可h f l l h i 排入肠道，并雨被吸收利用，形成“i i - t ：l 白 循环”，从而延长药物在体内的持续酐t i n jj 3 0 1 。 1 5 四环素残留的分析方法比较和选择 四环素族抗生素残留的测定方法有微生物抑制法、色谱和免疫法等，并朝着 快速、简便、多残留分析方法的方向发展。分析策略包括样品处理、筛选方法、 确证方法3 部分，样品处理操作简便、能去杂或富集残留物、回收率高；筛选法应快 速、简便、特异性强；确证法应定性和定量准确。微生物抑制和免疫法多用于常规 筛选，而色谱法用于鉴定和定量”。 1 5 1 微生抑制法 微生物抑制法是测定四环素族抗生素残留的经典方法，原理是抗生素抑制微 生物生长，其抑菌圈的大小与抗生素的浓度正相关，操作相对简单，费用低，适 用批量样品快速筛选，但常缺乏专一性和精确度，且受到其它抗生素的干扰d j | 。 四环素残留的微生物检测法包括标准纸片法、管碟法、涂抹法( s w a bt e s to n p r e m i s e s ，s t o p ) 、快速抗菌筛选法( f a s ta n t i b i e r o b i a ls c r e e nt e s t ，f a s d 、四板试验 法( f o u r p l a t et e s t ，f p d 等1 3 4 1 。国外许多公司已将微生物抑制法试剂盒商品化1 3 5 ， 如美国的b a c i l l us t e a r o t h e rm o p h l a s d i s ka s s a y ( b s d a ) ，c h a r m & r e c e p t o ra s s a y 。 1 ，5 2 色谱法 色谱法包括高效液相色谱法( h p l c ) 、薄层层析法( t l c ) 、纸层析法( p c ) 等。食 品中四环素族抗生素的测定方法主要用液相色谱法，在多残留抗生素分析方面， h p l c 更显优势。h p l c 分析方法是主要的色谱法，可以准确的定性、定量，样品的 净化处理采用c 1 8 、硅胶、硅酸镁等固相柱提取，与一般溶剂提取净化法比，可使 检测限降低约1 0 倍，若用亲和层析柱特异性提取和富集，检测限降低约1 0 0 倍。p e n a ， a 等用荧光h p l c 检测了5 7 个蜂蜜样本中的四环素残留，检测限为4 9 5 0 m g k g 3 6 】。 s c z e s n y , s 等用h p l c 和微生物法检测了鸡蛋中的四环素及其分解物，结果表明 h p l c 能够检测出2 0 4 0 0 m g k g 的四环素残留，和微生物法相比，能更好的检测出 四环素残留 3 7 1 。k u h n e ，m 等研究了肉和骨中的四环素残留经1 0 0 ，4 小时的热 处理后用h p l c 检测，发现四环素残留降低了5 0 9 6 3 8 】。 近年来高效液相色谱法( h p l c ) 在四环素残留分析中的应用请见表l ： 表j南徽液州色谱法台| 四蚪袁歧衙分析一p 的应川 t a b l ei t h ea p p l i c a t i o no fh p l ca n a l y s i si nl e i r a c y c l i n er e s i d u e s 猪肉罐 头 牛奶 畜禽肉 蜂蜜 肌肉 牛奶 牛奶 草酸乙腈 脱脂，酸化离心， 金属催化亲和层析 柱净化 高氯酸沉淀蛋白质、 超声波提取 酸提取 金属催化亲和层析 柱净化 1 0 三氯乙酸超声提 取，离心，过滤 有机溶剂沉淀 p o y o sjl - - 1 0c 杠，流动相：0 5 m g k g 乙腈一水 p l r p s 反相柱，流动相： o m m 1 5 8 0 n g m l 草酸乙 腈一甲醇( 7 0 + 2 2 + 8 ) ，u v 检测器 3 5 5 n m ， c 1 8 往，流动相：0 5 2 n g g 0 o l m o l l 磷酸二氢钠 ( p h 2 5 ) ：乙腈 ( 6 5 ：3 5 ) u v 检测波长2 6 8 n m 或 3 5 5 n m h y p e r s i m 0 0 5n l o c g 8 ，( 3 p m 。1 5 0 x0 5 m l o 4 0 0 n g g 4 2 d ) 柱，流动相： 几磷酸：乙腈，梯度， u v 检测波f 3 5 7 n m p r po l y m e r i c 柱，流动相：0 o l m o l l 草酸：乙腈，梯度，荧光检 测器 r p 一4 g p ( 1 5 0 m m x4 6 mm 。i d ) 柱，流动相： 0 0 2m o l l 草磷，二极管阵列检 测器，3 5 4 n m 。 n u c l e o s i lr p - c 1 8 ( 2 5 0m i n x 4 6 m m ，j ，d ，5p m ，p o r es i z e ，1 0 0 ( a ) ) 为色谱柱，0 0 5t o o l l 1 磷酸二 1 0 2 0 0 m g k g 4 3 b o m g m l 4 4 0 0 0 2 0 0 0 8 4 5 p g m l - 1 6 们 钉 乳制品有机溶荆沉淀 畜禽肉乙腈+ 草酸 猪肝高氯酸沉淀，离心 鱼肉有机酸沉淀 鸡蛋 肌肉 水产品 有机溶剂沉淀 e d t a 一柠檬酸 氯铘( p h25 ) 一l i t , j ( 3 0 ：7 0 v ： v ) 为流动柑流速i2m l m i n ， 十 湍2 5 c c 1 8 特分离测定，流动相为乙 腈磷酸_ 二氢钠，流速0 5 m l m i n ，梯度洗脱，紫外检测 波长3 5 5n m 。 流动相：乙腈：超纯水( 硫酸 调至p h 21 ) 梯度洗脱8 2 ：1 8 ：流 速：1 5m l m i n ；柱温：2 5 ；检 测波长：3 5 5n l l ；进样量：j 0u l 。 色谱o d s c 1 8 ( 5 岬) 4 6 m m x 】5c m ，检测波长3 5 5n m ， 柱温为室温，流速为0 8 m l m i n ，进样量为1 0 皿。，流 动相为乙晴00 1m o l l 磷酸二 氢钠溶液【用3 0 ( v n ) 硝酸溶 液调节p h 至2 7 ，3 5 ：6 5 ( v v ) 色谱o d s - c 1 8 柱，进样量1 0 u l ， 紫外检测器，检测波长：3 5 5 n m 色谱o d s - c 18 柱。二极管阵列 检测器，3 5 5 n m 。 色谱柱：w a l e l c 1 8 柱，荧光检 测器，流动相：咪唑缓冲液+ 甲醇，柱温：4 0 c 。检测波跃： 3 8 0 n m 2 0 o , g & g 4 6 0 2 m g k g 4 7 0 2 u m l 4 8 5 0 m g & g 4 9 0 0 2 m g k g 5 1 1 5 3 免疫法 免疫分析法无论作为兽药残留分析的检测手段，还是样品净化，都能使分析 过程特别是前处理简化。酶联免疫分析( e l i s a ) 、放射性免疫分析( r i a ) 、固相免 7 疫传感器等作为相对独立的分析方法，在快速筛选检测方嘶7 i f 刿显的优势。由于 e l i s a 具有操作简便、炙敏度高、专一性强、适用于批量样品的分析的特点，已广 泛用于牛奶、动物组织、蜂蜜等动物类食品中四环素类抗生素残留的检测”1 四 环素残留的主要分析方法为微生物法和高效液相色谱法，免疫法报道尚不多见”“。 刘智宏等用e l s a 检测方法对牛奶和鸡肉中四环素进行检测，检测限为7 p l ( 斗k g ) 左右。在牛奶和鸡肉中，牛奶的临界值为3 9 5p g ，l ，鸡肉的临界值为3 5 3 g 瓜9 1 5 6 】。安清聪等采用间接竞争e l l s a 检测猪肉及内脏组织中土霉素、四环素、 金霉素的残留量，在5 0 3 0 0 p 班g 浓度范围内，标准添加样品回收率8 1 - 3 1 2 2 4 ，变异系数2 7 1 1 1 【绷。秦燕等研究确立了动物肌肉中四环素族药物多残 留分析的基质固相萃取净化酶联免疫分析方法，交叉反应分析表明其对每千克动 物肌肉中四环素、土霉素和金霉素的检出限分别为8 、8 。5 和7 0 烬，回收率为8 0 】1 0 1 5 引。z h a l l g , y 等研究了用多克隆抗体e l i s a ；去检测牛奶中四环素残留，回收 率为7 4 1 1 6 ，检出限为2 5 p g 【5 9 】。另外e l i s a 还可运用于蜂蜜、水、畜禽产品、水 产品、牛奶等的检验i ”。 1 5 4 电泳法 陈d 豹等用毛细管电泳法成功地对蜂蜜中四环素( t c ) 等进行了分离。研究了电 泳缓冲液的p h 、不同有机试剂添加剂、温度等因素对抗生素分离的影响。实验结 果表明，体积分数为4 的n 一甲基吗啡啉的加入可大大改善分离效果。在各自相应 的浓度范围内，峰面积和样品浓度之间呈现良好的线性关系，重现性好。四环素 的检测极限为2 0 p 叽【6 3 1 。牛长群采用高效毛细管电泳法将四环素、4 - 差向四环素、 脱水四环素、脱水差向四环素、二甲胺四环素、去甲基金霉素及土霉素完全分离， 并测定了四环素中杂质洲。 1 5 5 分析技术联用 分析技术联用是现代化学的发展特点，这样可以取长补短，获得单一分析技 术难以达到的效果，联用技术主要解决两个问题，一是样品的净化或纯化，二是 确证分析。前者应用于样品的前处理，分离除去不需要的干扰物，如采用固相免 疫亲和柱净化样品【6 5 】，后者弥补分析技术特异性不强的缺点。常见的不同方法的 技术联用有液相色谱一质谱( h p l c m s ) 、气相色谱一质谱( g c - - m s ) 、免疫分析 一液相色谱( i a s - h p l c ) 、薄层层析一免疫分析( t l c l a s ) 、超临界萃取一免疫 8 分析( s f e l a s ) 和微乍物一色浒法1 6 6 1 。 1 5 6 几种方法的比较 由于动物性食品中四环素残留涉及人类健废，对于动物性食品中四环素贱留 的检测引起各国政府和广大人民群众的高度重视。目前，h p l c 法是应用最为广泛 的残留分析检测方法，e l i s a 法发展也很快。这两种方法各有优缺点，h p l c 法具 有高灵敏度、高分离效率和高准确度，灵敏度为5 - - 0 u g k g 。但检测成本较高， 操作的专业人员少，可用于四环素的定量测定。e l i s a 法具有快速、灵敏，专一 性强的特点，但准确度稍差，侧重于大批量样品的定性检出。因此，应该努力研 究和开发一些简单快速同时便携的分析技术，实现分析过程的自动化和智能化， 以提高分析效率，降低分析成本，保证消费者的健康。 本试验研究选用h p l c 法检测鸡、鸭组织中四环素残留，获得较为满意的结 果。 1 6 四环素残留有待研究的问题及意义 四环素残留分析，国内外文献报导的研究内容大多数为蜂蜜、牛奶、水产品 等动物源性食品。对鸡和鸭组织中四环素残留分析方面，仅有对个别脏器的零星 报导，并且多数为检测方法的研究。至于养殖户滥用四环素造成畜禽体内残留和 蓄积性中毒的系统研究少见报导。对鸭组织中四环素残留及毒性的研究未见报导。 本试验对鸡和鸭组织中四环素残留及毒性引起的病理变化作了较系统的研 究，为生产上及时检出四环素残留超标的畜禽产品和早期防止四环素残留超标提 供科学依据，为人们食品安全提供保障。 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 主要仪器 5 1 5 高效液相色谱仪 美国w a