（食品科学专业论文）木质纤维素超低温微化固定化酶降解制备乙醇工艺研究.pdf

摘要 木质纤维素是一种新的可利用能源。全世界有着大量的木质纤维素类资源，这其中 包括占很大一部分的林业加工废弃物，例如木屑，木渣，树皮等是一大类没有被有效利 用的可再生植物资源，用林业废弃物转化为燃料乙醇、沼气等是一种解决能源问题的新 的有效途径。本文对白桦木质纤维素预处理、白桦木纤维素固定化酶降解及乙醇的发酵 工艺进行了研究。 考察了不同预处理方法对自桦木纤维素酶水解的影响，这几种方法包括：酸处理、 碱处理、微体化预处理和超低温微体化预处理等方法。其中，超低温微体化预处理桦木 纤维素的方法至今未见报道。通过对几种方法的比较发现：酸预处理方法的酶解率最 低，为6 5 8 。超低温微体化预处理的桦木纤维素酶解率最高，为3 1 7 8 。 用交联法对纤维素酶进行固定化，研究了维素酶的固定化工艺，得到了载体与交联 剂浓度、给酶量、固定化时间的最适固定化条件：戊二醛浓度7 o ，酶用量8 0m g g 载 体，交连时间8 小时，固定化纤维素酶活力可达1 1 8t t g 。同时对固定化酶及游离酶的 米氏常数、最适p h ，离子强度对酶活力的影响以及最适反应温度和热稳定性等理化性质 进行了探讨和比较。固定化纤维素酶重复利用1 0 次，酶活力为原来的5 0 以上。 研究了固定化纤维素酶降解白桦木纤维素的酶解工艺。并对酶解工艺进行了优化， 结果得到固定化纤维素酶最佳酶解条件为：温度4 5 1 2 ，p h 值5 o ，酶用量o 1 5 9 g 底物， 还原糖产量为0 6 8 5 m g m l 。 对木质纤维素酶解后的糖化液的发酵结果表明，最佳发酵工艺条件为：温度3 5 1 2 ， p h 值5 5 ，接种量为1 5 ，糖液浓度4 ，摇床转数1 5 0 r p m ，乙醇产率可达3 3 5 。说 明了用超低温微体化与固定化酶连用解降解白桦木纤维素原料生产乙醇的方法是可行 的。 关键词木质纤维素；超低温微体化；固定化纤维素酶；乙醇 a b s t r a c t l i g n o c e l l u l o s ei sal l e wa v a i l a b l ee n e r g y8 0 t t r c c s ，t h e r ei sg r e a ta b u n d a n c eo fs u r p l u s p l a n tm a t e r i a lw o r l d w i d e w o o d yw a s t e ，i e w o o dc h i p s ，w o o dp o w d e r ，a n db a r k s ，i sa l lu n u t i i i z e dp l a n tb i o m a s sf u r t h e r m o r e t h ec o n v e r s i o no fw o o d yw a s t ei n t of i t e lm a t e r i m ss u c h 鹤 e t h a n o la n dm e t h a n es e m st ob ean e wm e t h o df o rp r o d u c i n ga l t e r n a t i v ee n e r g y t h i sp a p e r s t u d i e dt h a tt h ep r e t r e a t m e n to ft h el i n g n o c e l l u l o s e ，t h ei m m o b i l i z e dc e l l u l a s h y d r o l y z e l i g n o c e l l u l o s ea n d t h ep r o c e s so fe t h a n o lf e r m e n t a t i o n i n v e s t i g a t i o nw e r ec a r r i e do u tf o rs e v e r a lm e t h o d so fp r e t r e a t m e n ta f f e c t e dt h eh y d r o s i so f l i g n o c e l i n l o s e ，s u c ha sa c i dp r e t r e a t m e n t ，a l k a f ip r e t r e a t m e n t , s u p e r f i n eg r i n d i n gp r e t r e a t m e n t a n du l t r a - l o wt e m p e r a t u r es u p e r f i n eg r i n d i n gp r e t r e a t m e n t t h e r ei sn or e p o r ts of a rf o rm e t h o d o fa l t t a - l o wt e m p e r a t u r e s u p e r f i n eg r i n d i n gp r e u e a t m e n t t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h e c n z y m o l y s i sy i e l do fa c i dp r e t r c a t m e n tw a sl o w e s t6 5 8 a n dt h a to fu l t r a - l o wt e m p e r a t u r e s u p e r f i n eg r i n d i n gp r e t r e a t m e n tw a st h eh i g h e s t3 1 7 8 t h r o u g hc o m p a r i n gt h e s ee x t r a c t i n g m e t h o d s t oi m m o b i l i z ec c l i u l a s e sw i t ht h ec r o s s 一 i n k i n g m e t h o d ，s t u d i e dt h ep r o c e s so f i m m o b i l i z e dc c l l u l a s e sa n dt h eb e s tc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o n , s u c ha st h ew e i g h t so f c e u u l o s ew a s8 0m g gs u b s t r a c t e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fg i n t a r a l d e h y d ew a s7 ，c r o s s l i n k i n g t i m ew a s8h o u r s , i m m o b i l i z e dc e l l u l a s e s a c t i v i t yw a g1 1 8u g s o m ec h a r a c t e r so f i m m o b i l i z e da n dn a t i v ec c l l u l a s e s ，s u c ha sm i c h a e l i sc o n t a n t ，o p t i m u mp h ，a n dt h ee f f e c to f i o n i cs t r e n g t h ，o p t i m u m ，t e m p e r a t u r es t a b i l i t i e st oh e a ta n dr e p e a to p e r a t i o nw e l es l u d i e da n d c o m p a r e d r e p e a t e d1 0t i m e sh y d r o l y s i sp r o c e s s e sb yi m m o b i l i z e dc e l l u l a s ，t h ei m m o b i l i z e d c e l l u l a s ea c t i v i t yr e d u c e db y 在l o r ct h a n5 0 s t u d i e dt h ep r o c e s so fi m m o b i l i z e dc e l l u l a sh y d r o l y z eb i r c hf i g n o c e l l u l o s e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n sw e r e ：t e m p e r a t u r e4 5 ，p hv a l u e5 0a n d e n z y m ed o s a g eo 1 5g gs u b s t r a c t e t h er e d u c i n gs u g a ry i e l dw a s0 5 5 8m g m l t h er e s u l t so fe t h a n o lf e r m e n t a t i o no nt h ec e l l u l o s i ch y d m l y s a t es h o w e dt h a t ：t h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e3 5 ，p h 5 5 ，1 5 y e a s t , g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n4 ， f l a k e r s p e e d 1 5 0 r m i n ，e t h a n o ly i e l dr e a c h e d3 5 5 a f t e r6 0 h sf e r m e n t a t i o n t h i s d e m o n s t r a t e dt h a ti tw a gf e a s i b l et op r o d u c ee t h a n o li i if e r m e n t a t i o nw i t ht h em e t h o do fu l t r a - l o wt e m p e r a t u r es u p e r f i n eg r i n d i n ga n di m m o b i l i z e dc e l l u l a sh y d r o l y z eb i r c hl i g n o c e l l u l o s e k e y w o r d s l i g n o c e l l u l o s c ；u l l r a l o wt e m p e r a t u r es u p e r f i n eg r i n d i n g ；i m m o b i l i z e d c e l l u l a s ；e t h a n 0 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的硼 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅北林业大鲎或其他教商 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：健、彩签字日期：舢7 年月姒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解壅些盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被套 阅和借阅。本人授权盔韭盎些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位讫 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 蔫擎鞠滋囊作者签名：鑫、盎 签字日期：0 年g 月易l 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名= 刁衫牟 j 签字日期：吩声占月2z 日 电话： 邮编： 1 绪论 1 1 课题背景及意义 1 绪论 1 1 1 木质纤维素资源概况 全世界植物每年通过光合作用能产生高达1 - 6 4 x 1 0 1 1 t 木质纤维素类物质。其中纤维 素、半纤维素的总量为8 5 0 亿t ，是生产乙醇的最丰富资源。据估计木质纤维素原料占 世界生物量( 1 0 0 亿一5 0 0 亿0 1 1 】的5 0 。随着现代工业的发展和世界人1 2 1 的激增，能源危 同趋加剧，纤维素的应用愈来愈受到重视。但是纤维素资源大部分未能被有效利用。因 此，如何进一步有效地利用纤维素资源，开拓纤维素在新技术、新材料和新能源中的应 用，成为国内外科学家竟相开展的研究课题【2 1 。 生物法生产的乙醇在一些国家和地区正广泛使用。巴西每年以甘蔗作为原料，生产 1 1 0 0 万t 燃料乙醇，美国则每年利用9 5 的玉米和部分小麦、大麦大约生产5 5 0 万t 以 上的燃料乙醇。加拿大利用玉米和1 5 的小麦，生产2 4 x1 0 8 升燃料乙醇。目前我国乙 醇年产量为3 0 0 多万t ，仅次于巴西、美国，列世界第三位1 3 】。其中发酵法生产乙醇占 绝对优势，现在，8 0 左右的乙醇来自于淀粉质原料，1 0 的乙醇用废糖蜜生产，而以 纤维素原料生产的乙醇约占2 左右，所占比例相当少【4 】。随着乙醇需求量不断增大， 发酵法生产乙醇相关的木质纤维素的转化技术的研究随之成为国内外关注的热点之一， 包括将秸秆、蔗渣、废纸、垃圾纤维等木质纤维素类物质，这其中也包括占很大一部分 的林业加工废弃物，例如木屑、木渣、树皮等是一类没有被有效利用的可再生植物资 源，用林业废弃物转化为燃料乙醇是一种解决能源问题的新的有效途径1 5 1 。 1 1 2 木质纤维素的降解 1 1 2 1 木质纤维素料的预处理 木质纤维素中的有机成份以纤维素、半纤维素为主，其中纤维素含量占3 5 。4 5 ， 半纤维素占2 5 - 4 0 ，木质素占1 5 2 0 。纤维索结构单元是由8 - d 葡萄糖基1 ，4 糖苷键联结而成的线性高分子化合物，每个纤维素分子由8 0 0 1 2 0 0 个葡萄糖分子组成 【6 】。未处理的木质纤维素由于其纤维素中( 1 ，4 ) 糖苷键连接的致密晶体结构和木 质素、半纤维素结合作用，使得木质纤维素有较少可被酶利用的活性位点，因此利用纤 维素酶直接作用木质纤维素不能直接获得可溶性塘，直接影响乙醇发酵过程【7 1 。因此， 采用了大量的预处理方法来破坏纤维素自身的晶体结构，以有利于酶解糖化反应。经过 预处理的木质纤维素酶解糖化，可以最终水解成单糖，进而通过化发酵将生成的还原糖 发酵成生物乙醇。 目前，木质纤维素酶解反应预处理方法很多，包括物理方法、化学方法和生物方法 等。 东北林业大学硕士学位论文 1 物理方法有：机械微粒粉碎、高温分解、微波处理、蒸汽爆破、高能辐射等 8 - 1 2 1 。 ( 1 ) 微粒粉碎该方法是纤维素质原料预处理常用方法之一，它能使木质纤维素原 料在破裂、碾磨等外力作用下使颗粒变小，结晶度降低。 ( 2 )高温分解高温分解后的木质纤维素经0 5 m o l i , h 2 s 0 4 ，9 7 ，2 5 h 水解可使 8 0 8 5 的纤维素生成糖，其中葡萄糖占5 0 以上。 ( 3 ) 微波处理微波是指3 0 0 m h z 3 0 0 k m h z 范围的电磁波。微波处理能使纤维素的 分子间氢键发生变化，处理后的粉末纤维素类物质没有胀润性，能提高纤维素的可及性 和反应活性，可以提高基质浓度，得到较高浓度的糖化液处理时间短，操作简单，但由 于处理费用较高而且难以应用于工业化生产。 ( 4 ) 蒸汽爆破该法是目前国内外研究较多的有效预处理方法之一。目前所用的蒸 汽爆破法是用蒸汽将原料加热至1 6 0 - 2 6 0 c ，维持2 0 s 一3 0 m i n 在高温高压下造成木质纤 维素软化，然后迅速使原料减压造成纤维素晶体和纤维素的破裂，木质素和纤维素分 离，而半纤维素在高温下发生自水解作用可溶化，木质素也发生部分降解。汽爆过程中 加入稀硫酸或二氧化碳可以有效促进酶水解，减少抑制物的形成，使半纤维素去除量增 多反应能力增大。 2 化学方法 ( 1 ) 酸处理【1 3 l 稀酸水解已经成功地用于木质纤维素原料预处理，稀硫酸预处理可 以获得较高的得率，显著促进纤维素水解。但酸处理污染环境，对设备条件要求高。 ( 2 ) 碱处理n a o h 有较强的脱木质素作用，原料除去木质素后，酶水解糖化率将明 显提高。 ( 3 ) 臭氧法臭氧可以用来分解木质纤维素原料中的木质素和半纤维素。该方法中本 质素受到很大程度的降解，但由于需要的臭氧量比较大，整个过程成本较高。 3 生物法。 生物处理是利用分解木质素的微生物除去木质素，以解除其对纤维素的包裹作用。 虽然很多微生物都能产生木质素分解酶，但酶活性较低，很难应用于工业生产【1 4 1 。在生 物预处理中，白腐菌、褐腐菌和软腐菌等微生物常被用来降解木质素、半纤维素，其中 最有效的白腐菌是担子菌类。从成本和设备角度出发，生物预处理显示了独特的优势， 可用专一的木质酶处理原料，分解木质素和提高木质素消化率，但是生物预处理后水解 得率很低，此种方法虽然取得了一定的成功，但多停留在试验阶段，采用基因工程技术 对白腐菌进行改良，将有助于拓展生物预处理技术的应用m j 。 1 1 2 2 木质纤维素料的水解 经过预处理的纤维素通常通过酸水解或酶水解来糖化，将木质纤维素先水解为可发 酵的己糖和戊糖。 1 木质纤维素原料的酸水解【1 q 酸水解糖化纤维素的方法有着古老的历史，本世纪初德国等欧洲国家就进行了此工 艺的研究，并形成了以此工艺为基础的工业化生产。常用的无机酸有盐酸和硫酸。无机 1 绪论 酸催化纤维素分解的机理是：酸在水中解离并产生氢离子，当纤维素链上的8 - 1 ，4 葡 萄糖苷键和水合氢离子接触时，后者将一个氢离子交给8 - 1 ，4 葡萄糖苷键上的氧，使 这个氧变得不稳定。当氧键断裂时，与水反应生成两个羟基，并重新放出氢离子，后者 可再次参与催化水解反应。在一定的酸浓度范围内，纤维素水解反应的速度与酸的浓度 呈正比。温度增加酸水解反应的速度也会加快，一般认为，温度增加1 0 ，水解速度提 高1 2 倍。纤维素在浓酸中的水解是均相水解。是纤维素晶体结构在酸中润胀或溶解 后，通过形成酸的复合物，再水解成低聚糖和葡萄糖： 纤维素一酸复合物一低聚糖一葡萄糖 酸水解又分为浓酸水解和稀酸水解法。 ( 1 ) 浓酸水解工艺浓酸水解在1 9 世纪即已提出，它的原理是结晶纤维素在较低的 温度下可完全溶解于7 2 的硫酸、4 2 的盐酸和7 7 一8 3 的磷酸中，导致纤维素的均 相水解。浓硫酸水解为最常用方法，其主要优点是糖的回收率高，大约有9 0 的半纤维 素和纤维素转化的糖被回收。浓酸对水解反应器的腐蚀作用是一个重要问题。近年来在 浓酸水解反应器中利用加衬耐酸的高分子材料或陶瓷材料解决了浓酸对设备的腐蚀问 题。 ( 2 ) 稀酸水解工艺稀酸水解工艺较简单，是木质纤维素原料生产乙醇的最古老的方 法，也是较为成熟的方法。革新的稀酸水解工艺采用两步法【1 7 l 。第一步稀酸水解在较低 的温度下进行，半纤维素非常容易被水解得到五碳糖产物，分离出液体( 酸液和糖液) 。 第二步酸水解是在较高的温度下进行，重新加酸水解残留固体f 主要为纤维素结晶结 构) ，得到水解产物葡萄糖。总的说来，稀酸水解工艺糖的产率较低，一般为5 0 左 右，而且水解过程中会生成对发酵有害的副产品。 酸水解法需要耐酸、耐压的设备，操作条件下糖发生二次分解，糖收率低，抑制后 段的乙醇发酵；操作安全性较低，成本较高。 2 木质纤维素料的酶水解 应用酶催化可以高效水解木质纤维素，生成单糖。酶水解工艺的优点在于：可在常 温下反应，水解副产物少，糖化得率高，不产生有害发酵物质，可以和发酵过程耦合。 但是由于木质纤维素致密的复杂结构及纤维素结晶的特点，需要合适的预处理方法，使 得纤维素分子成为松散结构，便于纤维素酶分子与纤维素分子的结合，然后通过纤维素 酶分子的催化作用，高效地水解产生单糖。因此木质纤维素酶水解工艺必然包含原料预 处理的关键步骤1 1 s l 。 ( 1 ) 纤维素酶的组成木质纤维素原料经过适当预处理后，可以利用纤维素酶催化水 解纤维素生成葡萄糖，其优点是反应条件温和( 5 0 c ，p h 4 8 1 ，不发生副反应。纤维素酶 是一种很复杂的酶：( 1 ) 内切葡聚糖酶( e n d o b 1 ，4 - g l u c a n a s ee c 3 2 1 4 ，简称e g ) ，攻 击纤维素纤维的低结晶区，产生游离的链末端基；( 2 ) 外切葡聚糖酶，常称纤维二糖水解 酶( e x o e 一1 ，4 - g l u c a n a s ee c 3 2 1 9 1 ，简称c b h ) ，通过从游离的链末端脱除纤维二糖单 元来进一步降解纤维素分子；( 3 ) 葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 2 1 ) ，水解纤维二糖产生葡萄糖。 东北林业大学硕士学位论文 ( 2 ) 纤维素酶的作用机理纤维素酶是具有不同底物特异性的多酶复合物。关于它的 作用机制，不同的研究者根据对不同的微生物纤维素酶的研究结果提出了不同的看法 【1 蚍1 1 。目前较为流行的理论主要有三种：协同理论( s y n e r g i s m ) 、原初反应假说 ( i n i t i a ld e g r a d i n g ) 和碎片理论( f r a g m e n t a t l o n ) ，但大多数人倾向于协同理论。协同理 论主要有：顺序作用假说( c i c x 假说) ：由内切葡聚糖酶首先随机作用于纤维素内部 的b 葡萄糖苷键，打开缺口，然后由纤维二糖水解酶在缺口处的非还原端切下一个二 聚糖( 纤维二糖) ，进而由b - 葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖：改进的a - o 【假 说：首先有c 1 酶作用于纤维素的结晶区，引起纤维素膨胀，形成变形的纤维素( 碱可溶 性纤维素) ，进而由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶分别作用，产生纤维 寡糖、纤维二糖和葡萄糖。两种假说的根本区别在于，后者认为存在一种能首先破坏纤 维素结晶区的c 1 酶，而纤维二糖水解酶只是水解“活化”纤维素的酶类之一；前者则认 为首先作用的是内切b 葡聚糖酶( c x ) ，所谓c 1 酶就是与c k 酶协同作用的纤维二糖水 解酶。目前这两种假说中哪种更接近于纤维素酶的实际作用机制，仍无定论。 1 1 3 酶的固定化 酶的固定化( i m m o b i l i z a t i o no f 明z v m e 曲是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域 内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术【硐。酶是由活细胞产 生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊蛋白质。能特定地促成某 个化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高，条件温和，反应产物污染小，能耗 低，反应容易控制等特点，因此得到广泛的应用吲。但其在酸、碱、热及有机溶液等条 件下易发生酶蛋白的变性，从而使酶活降低或丧失，而且酶反应多在溶液中进行，反应 终了后不易回收，反应产物分离提纯困难，难以实现工业上的连续化、自动化生产，因 此酶工程的应用发展受到了很大的限制。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一 定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收重复使用的技术。与游离酶相比，固 定化酶不但可保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性，并且其贮存稳定性高、分离 回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点【刎。 1 1 3 1 酶的固定化方法 2 5 - 2 9 1 依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固 定化。 ( 1 ) 包埋法包埋法指将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化。包埋法分为网 格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。包埋 法常用载体主要有：明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、交联树脂、海藻酸钠 和火棉胶等，但是包埋法中凝胶或半透膜的分子尺寸的选择范围会对大分子底物与产物 的扩散产生影响。周诗毅等瞄l 采用包埋法固定s o d ，并对固定化后的s o d 的性质进行 了研究，其结果表明，包埋剂聚丙烯酰胺的浓度为2 2 5 时，固定化的效果最好，固定 化酶具有明显的热稳定、抗酸碱性、保存时间较长及可重复使用等优点。 1 绪论 ( 2 ) 交联法交联法指借助多功能试剂使酶分子之间发生交联作用而制成固定化酶 的方法，亦称架桥法，其机理为游离酶的氨基酸残基与双官能团或多官能团交联剂反应 而被固定。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、n ，n - 亚甲基双丙烯 酰胺和双偶氮苯等【舢3 n ，其中应用最广泛的是戊二醛。 r g - 醛能与酶蛋白的氨基形成薛夫氏碱而与酶蛋白分子交联。其反应式如下所示： b 埔一一一t 一洲h 矿 p警 轳吝 y 用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时间使用。但是，由于交联反应较激烈， 酶活力损失较大。实际使用时，往往与其他固定化方法联合使用，如将酶先经凝胶包埋 再进行交联等，用此法制备的固定化酶活性高，机械强度好。苏新清p 2 j 等通过悬浮聚合 制各了丙烯酰胺丙烯腈二乙烯基苯三元共聚物以及丙烯腈二乙烯基苯二元共聚物，并 讨论了三元共聚物中丙烯酰胺与丙烯睛摩尔比对载体性能的影响，以载体对牛血清蛋白 ( b s a ) 的结合量来确定三元共聚物的最佳摩尔比。结果发现在二乙烯基苯交联下，丙烯 酸胺、丙烯腈的摩尔比为1 ：3 时，在6 5 经悬浮聚合2 4 小时所得三元共聚物，以其为 载体对牛血清白蛋白有最大结合量2 0 9 3 m g g ，可预示此为一类固定化酶的优良载体； 交联剂量在7 7 ( i n 0 1 ) 以下聚丙烯腈载体对牛血清蛋白的结合无太大差别。并可见丙烯 酸类载体中，随着化学组成的不同，其性能存在着差异。 ( 3 ) 吸附法吸附法是指通过物理吸附或离子吸附的方法将酶固定在水不溶性基质 上以达到使酶固定化的目的。使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。此法制成 的固定化酶活力损失少，但酶与载体的结合不牢固，易于脱落。物理吸附法常用的吸附 剂有活性炭、氧化铝、硅藻土【3 3 j 、多孔陶瓷、羟基磷灰石等。吸附法制备固定化酶，操 作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用，但酶与 载体的结合不牢易于脱落。离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结 合，酶在载体上结合较为牢固，离子吸附法在工业上应用广泛。 ( 4 ) 共价结合法通过共价结合的方法将酶固定在基质上。共价键结合法常用的载 体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物和甲基丙烯酸共聚物 等，与载体以共价结合的酶的官能团为氨基羧基酪氨酸与组氨酸的芳环。用共价结合法 制备的固定化酶结合牢固，酶不易脱落，可连续使用相当长的时间。但载体的活化操作 比较复杂，因为结合法的反应激烈，容易使酶活力损失。共价结合法包括重氮化、烷基 化和芳基化、戊二醛法、钛鳌合法和硫醇二硫化合物互换法p 4 】。 东北林业大学硕士学位论文 另外还有一些方法是将上述方法组合起来使用。但是没有一种方法对所有酶都适 用，因为不同酶的化学组成和性质存在较大差异，酶催化反应的底物和产物的性质也不 同，而且每种方法都有各自的优缺点。 固定化酶是生物工程的一个重要方面，固定化酶比游离酶有较好的稳定性，可以重 复使用和回收，又便于连续操作，因此可以大大降低成本。美国、日本在2 0 世纪7 0 年 代初开始进行纤维素酶固定化的研究，国内只是近几年才开始这方面的研究。 m a s s a y u k i 努j 以肠溶衣聚合物为载体固定化纤维素酶，可保留酶活力6 0 以上，回收率 可达1 0 0 ，并且对微晶纤维素的水解率明显高于游离酶。陈盛等p 6 】以壳聚糖为载体固 定化纤维素酶，结果发现固定化纤维素酶的最适p h 向酸性方向移动( p h 3 3 5 7 ) ，最 适温度升高到6 0 ，酶活力回收率为7 5 利用固定化纤维素酶技术，对促进纤维素 糖化发酵实现工业化生产有十分重要的意义。 1 1 4 乙醇发酵 乙醇发酵是利用酵母或细菌等微生物的生理活动，把淀粉或糖转化为乙醇的过程。 纤维素的乙醇发酵主要分为两个阶段：第一阶段是纤维素物质在纤维素酶的作用下水解 为葡萄糖；第二阶段为葡萄糖经发酵生成乙醇吲。利用植物纤维原料生产乙醇的发酵方 法，按照各生物转化程序的特点可以划分为以下几种方法1 3 8 l ： ( 1 ) 直接发酵法直接发酵法的特点是基于纤维分解细菌直接发酵纤维素生产乙醇，不 需要经过酸解或酶解前处理过程。该工艺方法设备简单，成本低廉；但乙醇产率不高， 产生有机酸等副产物。利用混合菌直接发酵，可部分解决这些问题。例如热纤梭菌能分 解纤维素，乙醇产率较低( 5 0 9 6 ) ，热硫化氢梭菌不能利用纤维素，乙醇产率相当高，进 行混合发酵、产率可达7 0 ，提高乙醇乙酸比值1 0 倍以上。 ( 2 ) 间接发酵法间接发酵法先用纤维素酶水解纤维素，酶解得到的糖液进行发酵。此 法中乙醇产物的形成受末端产物、低浓度细胞以及基质的抑制。为了克服乙醇产物的抑 制，必须不断的从发酵罐中移出乙醇，采取的方法有：减压发酵法、快速发酵法等。对 细胞进行循环利用，可以克服细胞浓度低的问题。筛选在高糖浓度下存活并能利用高糖 的微生物突变株，以及使菌体分阶段逐步适应高基质浓度，可以克服基质抑制。 ( 3 ) 混合菌种发酵法混合菌种发酵法可以利用纤维水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖 等单糖和寡糖的混合物。针对多碳源发酵乙醇的菌株不多，工艺及设备满足代谢上有一 定困难，碳源利用率低，乙醇产率低等问题，可采用气升柱发酵木糖和溢流柱发酵葡萄 糖的串联发酵工艺。串联发酵首先由es t i p i t i s 酵母进行限氧发酵，再经s c e r e i s i a e 的 厌氧发酵过程而结束。 ( 4 ) 同步糖化发酵法( s s f 法) s s f 法是在酶水解糖化纤维素的同一容器中加人产生乙醇 的纤维素发酵菌，使糖化产生的葡萄糖和纤维二糖转化为乙醇。纤维素的酶水解糖化和 发酵过程在同一装置内连续进行，由于葡萄糖不断被发酵利用，消除了底物葡萄糖浓度 的增加对纤维素酶的反馈抑制作用在工艺上采用一步发酵法，简化了设备，节约了总 1 绪论 生产时间，提高了生产效率。但s s f 法也存在一些抑制因素，如木糖的抑制作用、糖化 温度和发酵温度不协调等。消除木糖抑制的方法是利用能转化木糖为乙醇的菌株，如： 假丝酵母、管囊酵母等。现在研究较多的是能利用葡萄糖与木糖的菌株混合发酵，与单 纯的葡萄糖发酵菌和单纯的戊糖发酵菌相比，混合发酵乙醇的产量分别提高3 0 3 8 和1 0 。3 0 1 3 9 1 。 ( 5 ) 固定化酶糖化发酵法使用同一种微生物完成纤维素酶的分泌，纤维素的糖化和发 酵过程。固定化酶糖化发酵法( c b p ) 仅利用一种微生物产生的纤维素酶和半纤维素酶， 酶解产生的糖仍由同一株菌来完成发酵的过程。固定化酶比游离酶有较好的稳定性，可 以重复使用和回收，又便于连续操作，且能提高发酵器内细胞浓度和乙醇浓度。目前研 究最多的是酵母和运动发酵单胞菌的固定化，常用载体有海藻酸钙、卡拉胶、多孔玻璃 等。此方法工艺简单，历时短，得到国内外同行的重视。固定化酶是生物工程的一个重 要方面【删。 1 1 5 本课题的研究内容 以木质纤维素类物质生产乙醇在近3 0 年里研究得很多，对其组分、水解方法、发 酵工艺和发酵菌种等方面都进行了全面而深入的研究，为木质纤维素生产乙醇奠定了一 定的基础。目前利用纤维素生产乙醇的技术已基本成熟，但是由于纤维素预处理技术局 限性使得木质纤维素水解率较低，以及纤维素酶的成本太高，生产过程中，酶用量偏 大，导致木质纤维素生产乙醇的价格无法与粮食乙醇相竞争，最终使得木质纤维素类物 质工业化生产乙醇工艺还不成熟，没有较好地利用自然界丰富的木质纤维素资源，特别 是对林业加工废弃物乙醇转化的研究在国内外还较少。基于以上原因，本文首先考察了 不同于处理方法对白桦木纤维素酶降解的影响，这几种方法包括：酸处理、碱处理、微 体化预处理和超低温微体化预处理。其中，超低温微体化预处理白桦木纤维素的方法至 今未见报道。其次，研究了维素酶的固定化工艺。探讨了载体与交联剂浓度、给酶量、 交连时间的最适固定化条件，同时对固定化酶及游离酶的米氏常数、最适p h ，离子强度 对固定化酶活力的影响以及最适反应温度和热称定性等理化性质进行了探讨和比较，并 将固定化后的纤维素酶用于白桦木纤维素的降解，研究了固定化纤维素酶降解白桦木纤 维素的酶解工艺及各种条件对固定化酶降解白桦木纤维素生产还原糖的影响。最后对酶 解后的糖化液的发酵工艺进行了研究，得到最适发酵工艺条件。下面分别介绍白桦木质 纤维素的预处理、纤维素酶的固定化及乙醇发酵的研究。 东北林业大学硕士学位论文 2 白桦木纤维素预处理工艺研究 纤维素分子是由大量的b d 葡萄糖分子以1 ，4 - 糖苷键连接组成的链状聚合物。在 天然植物纤维原料中，纤维素通常总是与半纤维素、木质素共存，形成复杂的结构。由 于目前所筛选的许多高酶活的纤维素分解菌，其半纤维素酶及木质素酶活性不高，很难 将天然植物纤维的三大组成成份降解。另一方面，由于天然的复杂结构，又直接影响着 纤维素酶的作用。进行植物纤维原料的预处理有利于纤维素酶降解和转化，并且预处理 的效果直接影响着纤维素酶水解的结果。目前预处理方法大致可分三种类型：化学法、 物理法和生物法1 4 1 1 。本文主要选择酸、碱、微体化、超低温微体化四种预处理手段，比 较其四种预处理方法的特点及其对木质纤维素酶水解的影响因素。 2 1 实验材料与设备 2 1 1 实验材料与试剂 白桦木纤维素粉体 葡萄糖 3 ，5 二硝基水杨酸 浓硫酸 纤维素酶 丙酮 葡萄糖 甲苯 氢氧化钠 甲基橙 无水乙醇 柠檬酸钠 柠檬酸 十六烷基三甲基溴化铵 十二烷基硫酸钠 盐酸 2 1 2 实验仪器 微型植物粉碎机 7 2 2 型可见分光光度计 a l c1 1 0 4 电子天平 1 0 1 2a 电热鼓风干燥箱 分析纯 分折纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 来源于哈尔滨市某木材加工厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 上海化学试剂采购供应五联化工厂 北京新光化工试剂厂 酶活力= l o o o o u g ，上海国药集团 天津市福晨化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 北京化工厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 上海山浦化工有限公司 天津市石英钟厂霸州市化工分厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市泰斯特仪器有限公司 上海第三仪器有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 2 白桦木纤维素预处理工艺研究 电热恒温水浴锅 g x z 型智能光照培养箱 马富炉 球磨机n d 6 2 l 型 p h s 3 c 酸度计 9 8 1 1 3 电子控温电热套 f w l 0 0 高速万能粉碎机 超声波清洗器 2 1 2 实验方法 天津市泰斯特仪器有限公司 宁波江南仪器厂 天津市中环实验电炉有限公司 南大天尊设备有限公司生产 上海精密科学仪器有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 上海科导超声仪器有限公司 2 2 1 白桦木质纤维素组分的测定 4 2 1 2 2 1 1 中性洗涤纤维n d f 的测定准确称取风干样品0 。5 - 1 0 克放入1 0 0 毫升中性洗 涤剂( 3 十二烷基硫酸钠，p i t = 7 ) 内煮沸l 2 小时，冷却结束后，用1 0 0 目尼龙绢纱套在 玻璃漏斗上进行抽滤，滤渣转入已称重的玻璃滤锅，热水冲洗数次，真空抽滤，除去部 分水份后，放入1 0 0 烘箱烘干后，再在干燥器中冷却，恒重，即可求出中性洗涤纤维 n d f 量。 2 2 1 2 酸性洗涤纤维a d f 的测定称取风干样品2 5 克，( 粉碎，通过1 毫米筛孔) ， 于回流容器中加入1 0 0 毫升酸性洗涤剂2 0 克十六烷基三甲基烷化氨于1 升1 0 n 浓硫酸 中) 5 1 0 分钟内加热至沸腾，回流1 小时，用套有尼龙绢纱的玻璃漏斗抽滤，转入已称 量玻璃滤锅( 1 0 0 1 2 0 目孔径) ，每次用5 0 毫升热水冲洗数次，真空抽滤，最后用丙酮 洗涤l 也次，于1 0 0 烘箱内烘干，冷却后恒重，即可求出酸性洗涤纤维a i ) f 。 2 2 1 3 酸不溶木质素的测定将装有酸性洗涤纤维的坩埚内加入7 2 硫酸液浸没内容 物，搅拌成糊，在1 5 下消化3 小时，真空抽干，热水多次洗涤，p h 试纸检查无酸 性，置坩埚于1 0 0 烘箱内烘干，放在干燥器中冷却称至恒重。再将其灰化，留下的灰 分为样品中硅酸含量，称酸不溶灰分，烘干沉淀量与灰化量之差为酸不溶木质素a d l 。 纤维索= a d f - a d l - 灰分。 2 2 2 还原糖的测定1 4 3 】 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是 还原糖。还原糖在碱性条件与3 ，5 - - - 硝基水杨酸反应被氧化成糖酸及其它产物，3 ，5 二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3 氨基5 硝基水杨酸。在一定范围内，还原塘的量与 棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在5 4 0 n m 波长下测定光密度值， 查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。 取6 支1 0 m l 具塞刻度试管编号，按表2 1 分别加入浓度为l m g m l 的葡萄糖标准 液、蒸馏水和3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 2 m l ，配成不同葡萄糖含量的反应液。如表2 1 所 示。 东北林业大学硕士学位论文 表2 1 还原糖标准曲线的制作 葡萄糖溶液( m l ) 0 0 20 40 60 81 0 1 2 1 4 蒸馏水( m l ) 2 01 81 61 4 1 2 1 0 0 8 0 6 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热1 0 r a i n ，取出冷却至室温，用蒸馏水定容至 1 0 m l ，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长5 4 0 n m ，用0 号管调零点， 测出1 彳号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，制作还原糖标 准盐线。 2 2 3 纤维素酶液的配制 准确称取纤维素酶制剂0 5 9 于1 0 0 r a l 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入 1 0 0 m l 容量瓶中，用蒸馏水定容至1 0 0 r a l ，此酶液的浓度为5 m g m l ，4 冰箱中保存 备用。 2 2 4 酸预处理 分别称取一定量白桦木纤维素粉体，各加入0 5 ，1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 的稀硫 酸，固液比l ：1 0 ，室温放置2 4 小时后过滤，将滤液调p h 至中性( 0 1 甲基橙为指示 剂) ，测定水抽提液的含糖量。将滤渣用水冲至中性，烘干以后取1 0 9 ，加入5 0 m l 纤维 素酶溶液( 酶液配制：o 5 9 纤维素酶溶解于1 0 0 m lp h 4 8 ，0 0 5 m o l l 的柠檬酸一柠檬酸钠 缓冲溶液) 在5 0 1 2 静置保温4 8 h 后煮沸灭活，测定还原糖量 2 2 5 碱预处理 分别称取一定量白桦木纤维素粉体，分别加入0 5 、1 、1 5 、2 0 9 6 、2 5 、 3 0 、4 o 的n a o h ，固液比为1 ：2 5 ，室温放置2 4 小时后过滤，将滤液调p h 至中性 ( 0 1 甲基橙为指示剂) ，测定水抽提液含糖量。将滤渣用水冲至中性，烘干以后取 1 0 9 ，加入5 0 m l 纤维素酶溶液( 酶液配制：0 5 9 纤维素酶溶解于1 0 0 m lp h 4 8 ， 0 0 5 m o l l 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液) 在5 0 静置保温4 8 h 后煮沸灭活，测定还原糖 量。 2 2 6 微体化预处理 取1 0 9 烘干的自桦木质纤维素粉体，装入球磨机磨罐中，加入玛瑙球后调节球磨机 转数为2 0 0 转分，在不同时间内进行微体化处理，然后用振动筛进行筛分至 5 0 2 s o u m 。取白桦木质纤维素微粉体1 o g ，加入5 0 m l 纤维素酶溶液( 酶液配制：0 5 9 纤维素酶溶解于1 0 0 m l p h 4 8 ，0 0 5 m o l l 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液) 在s o c 静置保温 4 8 h 后煮沸灭活，测定还原糖量。 2 2 7 超低温微体化预处理 取1 0 9 烘干的白桦木质纤维素粉体，在温度为1 9 6 0 条件下进行超低温快速冷冻， 待物料充份冷冻后，迅速取出放入球磨机磨罐中，加入玛瑙球后调节球磨机转数为2 0 0 2 白桦木纤维豢顶处理工艺研究 转，分进行研磨1 h ，在不同的时间内进行如此冻磨处理。从预处理后的物料中取1 0 2 ， 加入5 0 m l 纤维素酶溶液( 酶液配制：0 5 9 纤维素酶溶解于1 0 0 m lp h 4 8 ，0 0 5 m o l l 的 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液) 在5 0 c 静置保温4 8 h 后