（细胞生物学专业论文）myosin+Ⅹ在细胞外基质降解过程中作用的研究.pdf

一- ， ： j 乙；二+ 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取 得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文 中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：百叠! 坦 日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位 论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名荔基已塑 指导教师签名： 日 期：逸堂：舀以 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 、， 【l降l【fi：i肾卜 ，j 0 肌球蛋白x 发育系统中m y 0 性，并且在b m p 细胞系降解细胞外基质和侵袭能力的影响。 通过对两株转移能力不同乳腺癌细胞m c f 7 和m d a m b 2 3 1 进行r e a l t i m e p c r 和w e s t e r nb l o t 在m r n a 和蛋白水平上检测m y ox 的表达，结果显示，在高侵袭能力 的m d a m b 2 3 l 细胞中m y ox 高表达，预示m y ox 可能与肿瘤侵袭能力有关。 高侵袭的m d a m b 2 3 1 细胞能形成侵入性伪足降解细胞外基质，这种伪足是导致 恶性肿瘤侵袭性生长的关键结构。c o r t a c t i n 是侵入性伪足的关键蛋白，与肿瘤的侵袭 和转移都有关。通过标记内源性m y 0x 与c o r t a c t i n ，发现在乳腺癌细胞的细胞质、丝足 和周边共定位。通过对细胞外基质降解的研究，发现m y ox 在侵入性伪足中定位，为 进一步研究m y 0x 在肿瘤侵袭过程中的作用打下了基础。 为了深入的了解m y 0x 在肿瘤侵袭过程中的作用，构建了慢病毒包装的沉默载体 m y ox s h r n a ，在h e k 2 9 3 f t 细胞中包装慢病毒，分离纯化病毒，检测其滴度达1 0 7 t u m l 。通过慢病毒反复侵染m d a m b 2 3 l 细胞，转染m d a m b 2 3 1 细胞效率达到9 0 以上，然后进行m a t r i g e l 侵袭能力分析，发现沉默m y ox 后肿瘤细胞的侵袭能力降低 5 8 9 。上述结果说明，m y ox 与细胞外基质降解以及肿瘤侵袭有着密切的联系。 关键词：m y 0x ；细胞外基质降解；侵入性伪足 1j a b s t r a c t m y o s i nxi sac r i t i c a li n t r a c e l l u l a rm o l e c u l a rm o t o r , w h i c hr e g u l a t e st h eg r o w t ho fn e u r a l p r o t r u s i o nd u r i n gn e u r o g e n e s i s ，f i l o p o d i as t a b i l i z a t i o na n di n c r e a s e sc e l lm o t i l i t y , a n d e s s e n t i a lf o rt h eb m p 6s i g n a l i n gp a t h w a y i nt h i ss t u d y , t h er o l eo fm y 0xw a si n v e s t i g a t e d o ne x t r a c e l l u l a rm a t r i xd e g r a d a t i o na n di n v a s i v ec a p a c i t yo fb r e a s tt u m o re e l l l i n e s nv i t r o t w 0e e l ll i n e so fb r e a s tc a n c e r , m c f 7a n dm d a m b 2 31 w i n ld i f f e r e n tm e t a s t a t i c p o t e n t i a l s ，w e r ee m p l o y e dt oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fm y ox a tt h em r n aa n dp r o t e i n l e v e l b yr e a l t i m e p c ：ra n dw e s t e mb l o ta s s a y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f m y 0xw a sh i 西e ri nm d a m b 2 31c e l l st h a ni nm c f 7c e l l s ，m e a n i n gm y oxm a y i n v o l v e dw i t ht u m o ri n v a s i v ec a p a c i t y h i g h l yi n v a s i v e c e l lm d a m b 2 31c a nf o r me c m d e g r a d i n gs t r u c t u r e s n a m e l y i n v a d o p o d i 钆w h i c hw a sa ne s s e n t i a ls t r u c t u r e sd u r i n gt h em a l i g n a n tt u l r l o r $ i n v a s i v eg r o w t h c o r t a c t i ni sac r i t i c a lp r o t e i nr e l a t e dt oi n v a d o p o d i a , i n v o l v e di nt u m o ri n v a s i o na n d m e t a s t a s i s b yi m m u n o c y t o c h e m i s t r y ，t h ec o 1 0 c a l i z a t i o no fm y 0xa n dc o r t a c t i nw a s o b s e r v e da tc y t o p l a s m , f i l o p o d i aa n dt h em a r g i n a lo fb r e a s tc a n c e l c e l l s b ye x t r a c e l l u l a r m a t r i xd e g r a d a t i o na s s a y , m y 0xw a st a r g e t e dt oi n v a d o p o d i a , w h i c hl a y saf o u n d a t i o nf o r t h ef u r t h e ri n v e s t i g a t i o no fm y oxf u n c t i o ni nt h et u n l o ri n v a s i o n t of u r t h e rc l a r i t yt h er o l eo fm v 0xi nt u m o ri n v a s i o n , as i l e n c i n gv e c t o rm y ox - s m 斟a w a sc o n s t r u c t e da n dp a c k a g e db yl e n t i v i r u s ，p a c k a g i n gl e n t i v i r u si nt h eh e k 2 9 3 f tc e l l s ， s e p a r a t i n ga n dp u r i f i n gt h el e n t i v i r u s ，t h ef i t r eo fp a c k a g e dl e n t i v i r u sw a su pt 010 7 t u m 1 a n dt h ee 街c i e n c yo ft r a n s f e c t i o nw a sr e a c h e d9 0 洫m d a - m b - 2 3lc e l l s t h e n ，m a t r i g e l a s s a yw a su s e dt os h o wi n v a s i v ec a p a c i t yo ft u m o rc e l l s i nm d a - m b 一2 3 1c e l l s ，t h ei n v a s i v e a b i l i t yw a sr e d u c e d5 8 9 a f t e rs i l e n c i n go fm y oxe x p r e s s i o n t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e d 也a tm v oxw a sc l o s e l yr e l a t e dt ot h ee x t r a c e l l u a rm a t r i xa n dt u l n o ri n v a s i o n k e yw o r d s ：m y ox ；e x t r a c e l l u l a rm a t r i xd e g r a d a t i o n ；i n v a d o p o d i a n r，u rl ? 卜 ，1 摘要i 英文摘要i i 目录i i i 1 引言 1 1 细胞迁移与细胞伪足的关系1 1 2 侵入性伪足是细胞外基质降解的关键结构1 1 3c o r t a c t i n 是肿瘤侵袭和肿瘤转移过程中的关键蛋白2 1 4m y ox 在细胞迁移过程中起着重要的作用2 1 5 立题依据3 2 材料和方法 2 1 细胞株和菌种4 2 2 主要试剂和抗体4 2 3 构建m y ox s h r n a 表达载体4 2 3 1 序列设计4 2 3 2 退火5 2 - 3 3 构建p e nh h l m y 0x 克隆。5 2 3 4l r 重组构建m y 0x s h r n a 5 2 3 5 沉默效率检测6 2 4 慢病毒包装6 2 5 质粒的大量制备6 2 6 细胞总i m a 提取和r t - p c r 以及r e a l t i m ep c r 7 2 6 1 细胞总i a 的提取7 2 6 2 去除d n a 污染7 2 6 3 逆转录合成c d n a 7 2 6 4r t - p c r 8 2 6 5r e a l t i m ep c r 8 2 7 w e s t e r nb l o t 9 2 7 1 细胞裂解液的制备：9 2 7 2 免疫印迹9 2 8 侵入性伪足的定位1o 2 9m a t r i g e l 侵袭分析1 0 3 结果与分析。 3 1m y ox 在乳腺癌细胞系中差量表达。l l 3 2m y ox 与c o r t a c t i n 共定位1 2 3 - 3m y 0x 在侵入性伪足中表达1 4 3 4 慢病毒包装m y ox s h r n a 。1 4 3 5 沉默m y 0x 后m d a m b - 2 3 1 细胞侵袭能力降低1 6 4 讨论 i i i ，t i=r 5 结论 参考文献。 致谢 i v 1 8 2 2 j l 1， 叫 可 t 1 1 细胞迁移与细胞伪足的关系 细胞迁移是肿瘤的侵润和转移性生长的必备条件，细胞迁移是高度整合的多步骤过 程，最初起始于形成的突起，根据其形态、结构和功能的特点，可分为丝状伪足、片状 伪足、侵入性伪足、足体【l 】。丝状伪足位于细胞的前导缘，在肿瘤细胞侵袭的起始阶段 可能起主要作用，侵入性伪足是丝状伪足的亚型，仅在高度侵袭性肿瘤细胞中可以观察 到，是侵袭性肿瘤细胞在基底膜一侧形成的含肌动蛋白的突起样结构。足体被认为是侵 入性伪足的前体，存在于高运动性和高侵袭性的细胞中，粘着斑与应力纤维一起转化为 动力型的足体，最终成熟为有功能的侵入性伪足，进而浸润和降解细胞外基质屏障，导 致细胞浸润、转移【2 3 4 】，因此，研究侵入性伪足和足体的分子机制对肿瘤的病理有重要 作用。 1 2 侵入性伪足是细胞外基质降解的关键结构 细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 降解是细胞迁移通过组织的阻碍所必需的 过程，肿瘤的侵袭和转移都依赖于吸附基底膜，降解细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ， e c m ) ，迁移通过3 d 基劂5 6 7 】。基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，m m p s ) 是肿 瘤细胞侵袭所必需的，而侵入性伪足在肿瘤侵袭过程中是肿瘤细胞连接细胞基底膜的结 构，在侵入性伪足的顶端有基质金属蛋白酶，特别是膜l 型基质金属蛋白酶( m e m b r a n e t y p e1m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e m t l m m p ) ，能够降解e c m 中的蛋白1 8 , 9 , 1 0 。 侵入性伪足是丝状伪足的亚型，仅在高度侵袭性肿瘤细胞中可以观察到，是侵袭性 肿瘤细胞在基底膜一侧形成的含肌动蛋白的突起样结构。在肿瘤细胞中与蛋白酶一起降 解细胞外基质。它的分子组成主要包括：支肌动纤维装配蛋白、膜运输蛋白、信号蛋白、 跨膜蛋白酶【2 3 】。侵入性伪足最先在s r c 激酶活化的细胞中发现，被认为与肿瘤的侵袭有 关。侵入性伪足的组成蛋白被发现参与粘着斑和板状伪足的形成，这说明它可能是受到 信号调节，由细胞的这些结构的成分组成的一个结构【l 。 在体外研究侵入性伪足也是研究细胞外基质降解一种方法，m d a m b 2 3 1 细胞是 典型的研究侵入性伪足的细胞系，在盖玻片上铺一层带有荧光标记的明胶，将细胞铺在 上面，一段时间后固定细胞，荧光标记侵入性伪足的标志性蛋白c o r t a c t i n 或者标记 f a c t i n ，能形成侵入性伪足，降解带有荧光标记的明胶，在明胶表面会形成黑斑，这个 黑斑是细胞降解形成的，也就是细胞形成侵入伪足的位置，在细胞中能被标志性蛋白标 记【12 1 。所以，一般在细胞外基质降解的部位，侵袭性肿瘤细胞能形成侵入性伪足，参与 1 4m y ox 在细胞迁移过程中起着重要的作用 m y ox 是重要的细胞内分子马达，在神经发育系统中m y ox 调节神经突起的生长 拉3 1 ，也有报导m y ox 与细胞粘附有关1 2 4 】。s t r e h l e e r 等发现在肿瘤细胞中c l p ( 类钙调蛋 白) 可能是m y 0x 特异调节轻链，通过上调m y ox 的表达增加丝状伪足的稳定性从而提 高细胞游走性【2 5 2 6 。c h e n e y 等报导招募和运输整合素和b m p 6 到丝状伪足的顶端，启 动基质粘附的丝状伪足形成延伸，在血管内皮细胞中参与b m p 6 信号通路，调节丝足的 形成和血管发生，这一发现说明m y ox 可能与肿瘤的血管发生有判2 7 2 8 2 9 州。在人类乳 腺癌细胞中，整合素a v e 3 是m m p 2 细胞表面受体，整合素和m m p 2 可能被招募到侵 入性膜结构，刺激局部e c m 的降解【3 。在神经细胞内d c c 和n e t r i n 1 相互作用，调 节基质粘附和招募c d c 2 ，r a c l 和n w a s p 进入细胞内，启动肌动蛋白细胞骨架重排， 维持细胞极性，当共转染m y 0x 和d c c 时细胞极性更为明显。n w a s p ，m m p 2 ，r h o g 1 1 p 等这些蛋白在肿瘤细胞中，与肿瘤转移和侵袭有关。 2 苞 东北师范大学硕士学位论文 1 5 立题依据 我们利用w e s t e r nb l o t 分析了不同转移潜能的人乳腺癌细胞系m c f 7 和 m d a m b 2 3 1 ，发现m y ox 的表达量在这两种细胞中存在明显差异，在低转移潜能的 m c f 7 细胞中低表达，而在高转移潜能的m d a m b 2 3 1 细胞中高表达，提示m y ox 的 表达可能与肿瘤侵袭有一定的相关性。通过免疫组化在正常乳腺组织和乳腺癌组织中标 记m y ox ，发现在两种组织中都有很强的表达，尤其是在乳腺癌组织中表达更强。 乳腺癌细胞m d a m b 2 3 l 是高运动和高侵袭性的细胞系，它能形成足体和侵入性 伪足，其侵袭能力与降解e c m 直接相关，m y ox 在m d a m b 2 3 1 细胞中高表达，而 在不能形成足体和侵入性伪足的m c f 7 细胞中低表达。同时鉴于丝状伪足和侵入性伪 足以及足体之间的关系，m y 0x 在丝状伪足中起着重要的作用，m y ox 可能在足体和 侵入性伪足形成过程中起着一定的作用，鉴于上述，研究e c m 过程中的m y 0x ，对研 究肿瘤侵袭和转移的分子机制有着一定的作用。 东北师范大学硕士学位论文 2 1 体、 2 材料和方法 细胞株和菌种 乳腺癌细胞系m d a m b 2 31 和m c f 7 都购于上海生命科学学院细胞库。 h e k2 9 3 f t 细胞和慢病毒体系的p e n _ h i l l ，p d s l _ h p u g i p 、p s p a x2 、p m d2 载 s t b1 3 菌株、t o p1 0 菌株都购于i n v i t r o g e n 公司。 2 2 主要试剂和抗体 核酸限制性内切酶b a m hi 、x h o l 、k p ni 均购于北京n e b 公司；l r 重组酶购于 i n v i t r o g e n 公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于a x y g e n 公司；m y ox 抗体、 h a 抗体都为本实验室保存，鼠源a c t i n 抗体购于s i g m a 公司；h r p 标记山羊抗小鼠i g g 购于北京中山生物科技有限公司：f i t c 羊抗兔抗体、t r i t i c 羊抗鼠抗体购买于i n v i t r o g e n 公司：p d b u 购于s i g m a 公司。m a t r i g e l 购于b d 公司。 2 3 构建m v ox s h r n a 表达载体 2 3 1 序列设计 ( 1 ) 根据人源m y ox 基因序列在l n v i t r o g e n 公司主页上用相应的软件设计，设计的原 则：1 9 b p 的特异性结合m y ox 的序列的g c 含量为4 5 5 5 ，退火温度4 5 c - 6 5 c ， 同时避免起始端有两个以上的a ，尾端不能有两个以上的t 。将选取的片段进行b l a s t 人基因组比对，选择特异性序列。 ( 2 ) 以b a m hi n 1 9 - t t - l o o p - n 1 9 一x h o l 形式合成一段6 0 b p 序列，n 1 9 为n 1 9 的反 向互补，5 端为b a m hi 酶切位点，3 端为x h o l 酶切位点。 m y 0x s e n s eo l i g - 5 g a t c c c c c c t c c t a g c c c t t a t c aa r t t c a a g a g a a t t g a = r a a g g g c t a g g a g g t t t t t c 3 m y 0x a n t i s e n s eo l i g 5 t c g a g a a a a a c c t c c t a g c c c t l ：a t c a 汀t c t c t t g a a a t t g a l a a g g g c t a g g a g g g g g 3 ( 3 ) 参照文献资料，选取了一段对照1 9 b p 序列，按照b a m hi n 1 9 t t - l o o p - n 1 9 - x h o l 结构合成6 0 b p 的序列。 c o n t r o ls e n s eo l i g - 5 g a t c c c c g t g a g a t c g t a g t g c g t g a i t c a a g a g a t c a c g c a c t a c g a = i c t c a c t t l 丌c 3 c o n t r o la n t i s e n s eo l i g 4 等 t 东北师范大学硕士学位论文 5 - t c g a g a a a a a g t g a g a t c g t a g t g c g t g a t c t c t t g a a t c a c g c a c l a c g a t c t c a c g g g 3 2 3 2 退火 ( 1 ) 将合成的两段o l i g 溶解至5 0l a m ，各取1 0 0 p l 混合。 ( 2 ) 9 5 变性5 m i n ，快速转移至7 0 水浴锅中，孵育l o m i n ，关闭水浴锅电源，过 夜。 ( 3 ) 次日取出混匀，放在冰上备用，或者2 0 长期保存。 2 3 3 构建p e n h i l l - m y ox 克隆 ( 1 ) 取l p gp e n _ h h l 载体，b a m hi 和x h o l 双酶切，电泳，回收线性p e n _ h h l 大片 段。 ( 2 ) 连接和转化。将线性p e n _ h h l 浓度稀释至1 6 0 n g l a ，连接反应( n e b 公司的 1 4d n a 连接酶) d n a 片段 3 p l 载体lift ， 5 x l i g a t i o nb u f f er 4 0 l t 4d n a 连接酶l l a l d d h 2 0 t o2 叩1 1 6 过夜连接，将连接产物转化t o p l 0 感受态细胞，涂布在具有庆大霉素的l b 平板上。 ( 3 ) 阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，试剂盒提取质粒，k p n l 单酶切鉴 定，切成线性的克隆为阳性克隆。阳性克隆命名为p e n _ h i l l m y 0x ，以 5 g g c c g c t c t a g a c c a 工3 为测序引物，送北京华大基因测序。 2 3 4l r 重组构建m y ox s h r n a ( 1 ) 质粒抽提试剂盒抽提p d s l _ h p u g i p 和p e n _ h i l l - m y ox 质粒，调整两种质粒的浓 度，1 0 u ll r 重组体系如下： p e n _ h h l - m y 0x 1 0 0u g p l l l a l p d s l _ h p u g i p 15 0u e p l l l a l l r 重组酶 2 p l t eb u f f e r 6 p l 将以上溶液混合均匀，2 5 水浴锅中过夜。次日，l r 重组产物中加入l l a l 蛋白 酶k ，3 7 处理1 0m i n 。 ( 2 ) 将重组产物转化进入s t b1 3 感受态细胞中，涂在含有氨苄青霉素的l b 培养板中， 3 7 培养1 6 h 。 5 东北师范大学硕士学位论文 ( 3 ) 次日，挑取单克隆菌落，抽提质粒，酶切鉴定，并送华大基因测序。 2 3 5 沉默效率检测 将m y 0x 一8 6 分别与m y 0x s h r n a 和c o n t r o l 载体共转h e k 2 9 3 细胞，提取蛋白， 通过w e r s t e mb l o t 检测沉默效率，选取的抗体为h a 抗体和a c t i n 抗体。电转以及慢病 毒侵染m d a m b 2 3 1 细胞，用r t - p c r 检测沉默效率，选取g a p d h 作为内参。 2 4 慢病毒包装 ( 1 ) m y 0x s h r n a 、p s p a x2 、p m d2 三种质粒以2 ：1 ：l 的比例用脂质体共转h e k 2 9 3f t 细胞，6h 后换液，加入原来一半体积的培养基和血清，比如：1 0c m 板加5m l 培养基和血清；6 孔板每个孔加入li n l 培养基和血清。 ( 2 ) 换液后计时，4 8h 后在荧光显微镜下观察转染效率，效率高时，收集上清，3 0 0 0r p m ， 离心1 5m i n ，取上清，立刻侵染目的细胞( m d a m b 2 3 1 细胞) ，或者8 0 长期保存。 ( 3 ) 侵染7 2h 后，荧光显微镜观察，流式细胞仪检测转染效率。 ( 4 ) 加入适当的抗生素进行筛选，扩大培养。 2 5 质粒的大量制备 ( 1 ) 接种s t b l 3 s h r n a m y ox 单菌落到含有氨苄青霉素的5m ll b 中3 7 摇床过夜 培养，次日将过夜培养的菌液按1 ：1 0 0 的比例扩大培养，o d 6 0 0 达到1 o 左右停止培 养。 ( 2 ) 4 ，1 0 0 0r p m 离心2 m i n , 弃掉上清。 ( 3 ) 加入预冷的2 0 叫裂解液i 重悬沉淀，充分混匀，转移到1 0 0m l 离心管中。 ( 4 ) 加入新鲜配置的2 0i n l 溶液i i ，轻轻混匀。 ( 5 ) 加入预冷的2 0l n l 溶液，混匀，充分裂解。 ( 6 ) 4 ，1 4 0 0 0r p m 离心3 0 m i n ，纱布过滤，收集上清到新的离心管中。 ( 7 ) 在上清中加入o 6 倍体积的异丙醇，混匀，冰浴3 0 5 0 m i n 。 ( 8 ) 离心，1 6 0 0 0r p m ，3 0r a i n ，4 。 ( 9 ) 弃去上清，干燥沉淀。 ( 1 0 ) 用5m 16 5 预热的无菌水，将沉淀充分溶解。 ( 1 1 ) 加入5r d j5ml i c l ，混匀，离心1 4 0 0 0r p m ，1 0 m i n ，4 。 ( 1 2 ) 将上清转入另外一个5 0 血离心管中，加入1 0 皿异丙醇。冰浴3 0 r a i n ，离心， 15 0 0 0 r p m ，1 0m i n 。 ( 1 3 ) 弃上清，干燥沉淀。 ( 1 4 ) 用5 0 0 山无菌水充分溶解沉淀，转入1 5m le p p e n d o r f t u b e 中。 ( 1 5 ) 加入2 0mo 5n 幽f n l 的r n a s e ，室温放置1h 或者3 7 3 0m i n 。 ( 1 6 ) 加入等体积的1 3 p e g 8 0 0 0 混匀，室温放置lh 。 ( 1 7 ) 离心，1 4 0 0 0r p m ，1 0r a i n ，4 ，弃上清，用吸水纸吸干剩余的液体。 6 东北师范大学硕士学位论文 ( 1 8 ) 用4 0 0 “l 无菌水溶解沉淀。 ( 1 9 ) 加入4 0 0r t l 酚：氯仿( 1 ：1 ) 。 ( 2 0 ) 离心，1 4 0 0 0r p m ，5m i n ，4 ，转移上层水相到另外一个e p p e n d o r f t u b e 中。 ( 2 1 ) 加入2 0 0 p 1 无菌水到酚氯仿中，离心，1 4 0 0 0r p m ，5m i n ，4 c ，合并两次所得水相。 ( 2 2 ) 加入1 1 0 体积的裂解液i 。 ( 2 3 ) 加入2 倍体积无水乙醇，室温3 0r a i n 或者2 0 过夜。 ( 2 4 ) 离心，1 4 0 0 0r p m ，1 5m i n ，4 。 ( 2 5 ) 弃上清，7 0 乙醇洗一次，离心，1 4 0 0 0r p m ，1 5m i n ，4 ，干燥沉淀。 ( 2 6 ) 1 0 0 3 0 0 1 d 无菌水溶解沉淀，进行电泳和酶切鉴定。 ( 2 7 ) a 2 6 0 2 8 0l l m 测量吸收值( a 2 6 0 2 8 0 应在1 7 1 9 ) 。 2 6细胞总r n a 提取和i m p c r 以及r e a l t i m ep c r 2 6 1 细胞总r n a 的提取 ( 1 ) 6 孔板细胞融合度为8 5 时，吸去培养液，用p b s 洗三次后，每孔加t r 亿o l 试剂 ( g i b c o l 公司) 1i n l ，摇匀，消化5 分钟，用去r n a s e 的枪头吸打，当裂解液重新变得 澄清，将其转移到d e p c 处理过的1 5m le p 管中。 ( 2 ) 加入新的氯仿( 无r n a s e 污染) 0 2m l ，轻摇1 5 秒。 ( 3 ) 室温静置3 m i n 后，1 2 0 0 0r p m ，1 5m i n ，4 c ，离心。然后取上清无色水相( 约0 6m 1 ) 到e p 管( d e p c 处理过) ，加o 5m l 异丙醇，室温下静置1 5m i n 。 ( 4 ) 1 2 0 0 0r p m ，1 0 m i n ，4 c ，离心。弃上清，7 5 乙醇1 0m l 洗涤( 用d e p c 水 新 鲜配制) 管底的白色沉淀，1 2 0 0 0r p m ，5m i l l ，4 c 离心。 ( 5 ) 弃上清，干燥沉淀，加入d e p c 处理水2 0 3 0u l ，5 5 6 0 水浴1 0 m i n 溶解总r n a ， 测o d 值，o d 值1 9 2 0 之间的r n a 说明纯度较高可以进行下一步实验 ( 6 ) 电泳检测r n a 的完整性，有无被降解。 2 6 2 去除d n a 污染 提取的总r n a 用d n a s ei 处理去除d n a 污染，反应步骤按照i n v i t r o g e n 说明书进行。 d n a s e1 0 5 1 a l t o t a lr n a 5 l a l 10 d n a s eir e a c t i o nb u f f e rlp l d e p c 处理过的d d h 2 0 t olo o l 室温下反应3 0 m i n ，然后加入l u le d t a ，6 5 孵育1 0 m i n 。 2 6 3 逆转录合成c d n a ( 1 ) 将1 p g 总r n a 加到d e p c 处理过i 拘p c r d 管中，置于7 0 c 的热水浴中孵育l o 分钟， 它结合到c d n a 上。反转录的 d d h 2 0 9 5 m p c r 参数：9 5 c5 m i n - - - 9 4 c7 0 s - - - 6 0 c3 0 s _ 7 2 3 0 s ，共2 5 循环，最后再7 2 延伸5 皿n 。 ( 3 ) p c r 产物电泳，分析电泳带的亮度，统计数据，制作柱状图。 z 6 5r e a l - t i m ep c r ( 1 ) 将所制的c d n a 用无菌水稀释至10 1 1 山。 ( 2 ) 反应体系 s y b rg r e e nr e a l t i m ep c rm a s t e r1 2 5u l 引物l o 5 山 引物2 o 5 山 样品溶液 2 山 d d h 2 0 9 5 山 ( 3 ) 反应条件9 5 ( 26 0 s _ f 9 5 1 5 s - - - 6 0 c 6 0 s j4 0 个循环。 8 2 7w e s t e mb l o t 2 7 1 细胞裂解液的制备： ( 1 ) 弃旧培养液，并将瓶 使残余培养液流到瓶底，然后再用移液器将其吸走) 。 ( 2 ) 每瓶细胞加3 m l4 c 预冷的p b s ( o 0 1 mp h 7 2 7 4 ) 。平放轻轻摇动l m i n 洗涤细 胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将p b s 弃净后 把培养瓶置于冰上。 ( 3 ) 按i m l 裂解液加1 0 山p m s f ( 1 0 0 m m ) ，混匀置于冰上( p m s f 要摇匀至无结晶时 才能与裂解液混合) 。 ( 4 ) 每瓶细胞加4 0 0 山含p m s f 的裂解液，冰上裂解3 0 m i n ，为使细胞充分裂解培养 瓶要经常来回摇动。 ( 5 ) 裂解后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧( 动作要快) ，然后将细胞碎片和 裂解液移至1 5 m l 离心管中( 整个操作要在冰上进行) 。 ( 6 ) 4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ( 提前开离心机预冷) 。 ( 7 ) 将离心后的上清分装转移到0 5i n l 的离心管中放于- - 8 0 保存。 2 7 2 免疫印迹 ( 1 ) 清洗玻璃板，务必保证玻璃板的清洁。配制8 分离胶，4 的浓缩胶，按照每个泳 道的上样量为4 0 - - 8 0 9 9 蛋白以5 s d s 上样缓冲液混合样品，沸水中煮5 m i n 使蛋白 变性。电压为浓缩胶6 0 - - 8 0 v ，分离胶为8 0 i o o v ，电泳时间一般为3 h 。 ( 2 ) 电转移蛋白质至硝酸纤维素膜，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。 每隔一小时换一下冰袋，并搅动转移缓冲液。一般用1 0 0 v 转移4h 或5 0 v 转移过夜。 ( 3 ) 1 丽春红染液染5 m i n ( 于脱色摇床上摇) ，以检测蛋白转移效果。然后用水冲洗 掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白带。将膜晾干备用或直接用于下一步杂交。如果 有预染蛋白m a r k e r 可以根据m a r k e r 转移的程度来确定转膜效率。 ( 4 ) 将膜用p b s t 从下向上浸湿后，洗涤5 m i n 。然后移至含有封闭液的平皿中，室温 下脱色摇床上摇动封闭1 3 h 。 ( 5 ) 将一抗用p b s t 或t b s t 稀释至适当浓度；加入一抗，室温下孵育1 - - 2 h 或者4 度过夜。 ( 6 ) 去掉一抗，用p b s t 或t b s t 在室温下脱色摇床上洗5 次，每次5 m i n 。 ( 7 ) 同上方法准备h r p 标记的次级抗体工作液，室温下孵育1 - - 2 h 后。 ( 8 ) 用p b s t 或t b s t 在室温下脱色摇床上洗5 次，每次5 m i n 。 ( 9 ) 取p i e r c e 公司的s u o e r s i g n a l w e s tp i c oc h e m i l u m i n e s c e n ts u b s t r a t e 试剂盒。将 两个底物成分按1 ：1 混和制成底物工作液。 ( 1 0 ) 将膜与底物工作液接触，室温下孵育5 m i n 。 9 2 9m a t r i g e l 侵袭分析 ( 1 ) 将m a t r i g e l 放在冰上4 过夜融化，次日m a t r i g e l 由黄色固体变成红色液体，l o 叩l m a t r i g e l 加入4 0 叩l 培养基稀释，取2 5p 1 稀释液加入到t r a n s w e l l 上室，3 7 处理3 0 m i n 使m a t r i g e l 凝固，处理完的小室可保存两周。细胞侵袭能力与穿过m a t r i g e l 吸附在膜 下方的细胞数成正相关。 ( 2 ) 在下室中加入含有5 超级新生牛血清的培养基。将生长状态良好的细胞用无血清 的培养基稀释到3 x 1 0 5 个m l ，每个上室加入1 0 01 1 1 细胞稀释液，继续培养1 6 h 。 ( 3 ) 取出t r a n s w e l l 小室，p b s 洗3 次，4 多聚甲醛固定3 0 m i n ，p b s 洗3 次，吹干。 ( 4 ) 结晶紫染色3 0 m i n ，p b s 洗3 次，用湿润的棉签擦掉t r a n s w e l l 上室中的细胞，将 小室放入新的2 4 孔板中，显微镜观察，显微镜下随即选取6 个视野计数，统计侵袭过 膜的细胞数量。 1 0 f k c e 图lm y ox 在乳腺癌细胞系中差量表达。a r t - p c r 检测m y ox 的表达量。b 对r t - p c r 统计分析。 c r e a l t i m e - p c r 溶解曲线。d 为双d e l t c t 值分析所得统计图。e w e s t e r nb l o t 榆测m y ox 在m c f 7 和m d a m b - 2 3 1 细胞中表达。m y ox 在m d a m b 2 3 1 细胞中表达明显高于m c f 7 细胞中的表达， m y ox 显示2 2 0 k d 和1 7 0 k d 两条带型，与文献报导一致。a c t i n 作为内参。f w e s t e r nb l o t 统计图， 统计分析显示p 0 0 1 。 东北师范大学硕士学位论文 m d a m b 2 3 1 细胞中的表达量是m c f - 7 的1 4 3 倍，对6 次结果进行统计分析结果 显示p 0 0 5 ，差异显著。进一步利用w e s t e r nb l o t 在蛋白水平上分析m y ox 在这两种乳 腺癌中的表达( 图le & f ) ，a c t i n 作为内参，m y ox 显示2 2 0 k d 和1 7 0 k d 两条带型， 与文献报导一致，在m d a m b - 2 3 1 细胞中m y ox 表达明显高于m c f - 7 细胞，这些结 果表明m y ox 表达量与肿瘤细胞侵袭性呈正相关。 3 2m y ox 与c o r t a c t i n 共定位 c o r t a c t i n 是一种与肿瘤发生、侵袭和转移相关的重要的蛋白，它在细胞的丝状伪足、 板状伪足、侵入性伪足、足体均有表达，作为一种膜蛋白，在这些结构行使功能时起到 重要的作用。而m y ox 也是一种与细胞突起结构相关的蛋白，与细胞的迁移相关，我 们用免疫荧光技术检测m d a m b 2 3 1 细胞内源的m y ox 和c o r t a c t i n 的定位情况。将 m d a m b 2 3 1 细胞铺到胶原包被的盖玻片上，6 小时后固定细胞，用相应的抗体标记内 源性c o r t a c t i n 和m y ox ，共聚焦显微镜观察。实验结果表明，这两