（分析化学专业论文）油橄榄果渣中山楂酸的提取分离研究和结构表征.pdf

中南大学硕士学位论文 摘要 摘要 本文对我国陇南地区引种的油橄榄徊彪口p “加p 口p 口三) 中山楂酸 ( m a s l i n i ca c i d ，m a ) 进行系统研究，建立了油橄榄果渣以及油橄榄 叶中山楂酸的提取、分离纯化及测定方法，并对所得的山楂酸单 体通过u v 、i r 、1 h n m r 、1 3 c n m r 、m s 等分析手段进行了结构 表征。理论分析和结果表明： 1 山楂酸的提取。运用正交设计得到了溶剂提取法提取油橄榄果 渣和油橄榄叶中山楂酸的最佳实验条件：在8 0 下，用9 0 ( v v ) 乙 醇溶液提取4 h ，液料比为2 0 ：1 。油橄榄果渣和油橄榄叶中山楂酸的 提取量分别达到4 7 8 m g 和5 2 4 m g 。与溶剂提取法相比，超声提取耗 时短，但提取量较低；而索氏提取法提取量较高，但是耗时长且不利 于工业上进行放大生产。 2 山楂酸的分离纯化。以正己烷脱脂处理油橄榄果渣提取物，用 石油醚对油橄榄叶提取物进行脱除叶绿素的处理。然后通过硅胶柱层 析对果渣和叶子提取物进行初步分离，得到山楂酸和齐墩果酸粗品， 再通过重结晶进行纯化。山楂酸的含量由提取物中的1 7 6 5 上升到 5 4 2 ，收率为5 1 6 。对其重结晶进一步纯化后，山楂酸含量为 8 6 9 8 ，而齐墩果酸得到纯度较高的单体，在乙醇溶液中出现针状结 晶。对重结晶山楂酸采用制备液相色谱进行精制，得到高纯度的单体 ( 至9 7 ) 。 3 山楂酸的测定和结构表征。采用反相高效液相色谱法 ( r p h p l c ) 对油橄榄果渣和橄榄叶提取液和分离纯化中间产物进行 分析( 定量、定性分析) ，并在硅胶柱层析时结合使用了薄层色谱 ( t l c ) 进行定性分析。通过实验确定h p l c 分析条件为：色谱柱， k r o m a s i l c 1 8 ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 肛m ) ；流动相，甲醇1 h a c 溶液 ( 8 8 ：1 2 ，v ：v ) ；流速，1 o m l m i n ；检测波长，持2 1 5 n m ；柱温，2 5 。 山楂酸在3 1 5 3 6 o m g m l 范围内线性关系良好。采用u v 、i r 、 1 h n m r 、1 3 c n m r 、m s 等分析手段确定从油橄榄果渣和橄榄叶中 分离得到了山楂酸单体。 关键词山楂酸，提取分离纯化，反相高效液相色谱法，薄层色谱 法，制备液相色谱法 中南大学硕士学位论文 a b s t r a ( 玎 a bs t r a c t a s v s t e m a t i cs t u d yo fm a s l i n i ca c i d ( m a ) f b ml o n g n a ni n t r o d u c e d o i l0 1 i v e 徊，l 织铡，叩口印夕w a sc a r r i e do u ti nt h i sp 印e r m e t h o d sw e r e e s t a b l i s h e dt oe x t r a c t ，s e p a r a t e ，p u r i 母a n dd e t e r m i n em af 硒mo l i v e p o m a c ea n dl e a v e se x t r a c t s ，a sw e na st h es t r u c t u r a lc h a r a c t e r i z a t i o no f m aw a si d e n t i f i e db ym e a n so fu v ，i r ，1h n m r ，”c n m ra n dm s t h e o r e t i c a la n a l v s i sa n dr e s u l t ss h o w e da sf i o l l o w s ： 1 e x t r a c t i o no fm a t l 量1 eb e s ts o l v e n te x t r a c t i o np r o c e s so fm a 矗o mo l i v ep o m a c ea n dl e a v e sw a so b t a i n e db yo r m o g o n a ld e s i g n a n d t h eo p t i m a le x p 面m e n t a lc o n d i t i o n sw e r e ：t e m p e r a m r e8 0 ；1 i q u i df e e d r a t i o2 0 ：1o f9 0 ( v v ) e t h a n o ls o l u t i o nw h i l ee x t r a c t i o nt i m e4 h t h e e x t r a c t i o na m o u n t so fm a 行o mo l i v ep o m a c ea n dl e a v e sw e r e4 7 8 m g a n d 5 2 4 m gr e s p e c t i v e l y c o m p a r e d w i t hs 0 1 v e n t e x t r a c t i o n ， u l t i a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o nn e e dl e s st i m e b u te x t i a c t i o na m o u n tw a s l o w e rt h a nt h a to fs o l v e n te x t r a c t i o n ；w h i l es o x h l e te x t r a c t i o nh a sh i g h e x t r a c t i o na m o u n t ，b u ti t st i m e - c o n s u m i n ga n dn o tc o n d u c i v et oe n l a 唱e t h ep r o d u c t i o ni ni n d u s t 巧 2 s e p a r a t i o na n dp u 打f i c a t i o no fm a t h en h e x a n ew a sc h o s e nt o d e g r e a s et h ee x t r a c t i o no fo l i v ep o m a c e ，w h i l el e a fc h l o r o p h y l lo fo l i v e 1 e a v e se x t r a c t i o nw a sr e m o v e dw i t hp e t r o l e u me t h e r t h e ns i l i c ag e l c o l u i i 1c h r o m a t o g r a p h yw a su s e df o rp d m a 巧i s o l a t i o no ft h ee x t r a c t s 行o mo l i v ep o m a c ea n d1 e a v e sa n dc m d em a s l i n i ca c i da n do l e a n o l i c a c i d ( o a ) w e r eo b t a i n e d a n dt h e nr e c r y s t a l l i z a t i o nw a su s e df o r 向r t h e r p u 订f i c a t i o n t h ec o n t e n to fm aw a s5 4 2 i nc o n t r a s tt o17 6 5 w i t h o u t p r i m a wi s o l a t i o nw i t ht h e 皿e l d51 6 r e c w s t a l l i z a t i o nw a s c a r r i e do u t f o r 向r t h e rp u r i f i c a t i o na n dt h ec o n t e mo fm aw a s8 6 9 8 ，w h i l eh i g h p u r i t ym o n o m e r o f0 aw a so b t a i n e da i l di t sn e e d l e l i k ec 巧s t a l sa p p e a r e d i ne t h a n o ls o l u t i o n p r 印a r a t i v eh i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o 铲a p h y ( p r e - h p l c ) w a su s e df o rr e f i n i n gm a w h i c hw a sr e c 巧s t a l l i z a t e dt og e t h i g hp u r i t y m o n o m e ro fm a ( 至9 7 ) 3 m e a s u r e 】n e n ta n ds t m c m r a lc h a k i c t e r i z a t i o no fm a t h e0 1 i v e p o m a c ea n dl e a v e se x t r a c t sa n dt h ei n t e m e d i a t ep r o d u c t so fs e p a r a t i o n i i 中南大学硕士学位论文a b s t r a c t a n dp u r i f i c a t i o nw e r ea n a l y z e d ( q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ) b y r p - h p l c a n dt h i n 1 a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) w a sa l s ou s e df o r q u a l i t a t i v ea n a l y s i si nt h ep r o c e s so fs i l i c ag e lc o l u i i u lc h r o m a t o g r a p h y t h ea n a l y s i sc o n d i t i o n s ：c o l u i 衄，k r o m a s i lc 1 8 ( 2 5 0 m m 4 6 m m ，5 u m ) ； m o b i l ep h a s e ，m e t h a n 0 1 w a t e r - a c e t i c a c i d - 8 8 ：1 2 ：1 ( v v ) ：f 1 0 wr a t e ， 1 o m l m i n ；d e t e c t i o nw a v e l e n 舀h ，入产215 咖；c o l u m nt e m p e r a t u r e ， 2 5 t h eg o o d1 i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e np e a l ( a r e aa n dc o n c e n t r a t i o n w a so b t a i n e di nt h er a n g e so f 3 1 5 3 6 o m m lf o rm a t h es t m c t l l r eo f m ai s o l a t e df 而m0 1 i v ep o m a c ea n d1 e a v e se x t r a c t sw a si d e n t i f i e db y m e a n so fu v ，i r ，1h n m r ，c n m ra n dm s k e yw o r d sm a s l i n i ca c i d ，e x t r a c t i o n ，s e p a r a t i o na n dp u r i n c a t i o n ， i t p h p l c ，t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ，p r 印a r a t i v eh i 曲p r e s s u r e l i q u i dc 1 1 r o m a t o g r a p h y ( p r e - h p l c ) 中南大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论弟一早 三百t 匕 油橄榄p 彪口e 甜，d p 口p 口厶j ，又名洋橄榄、齐墩果( 广西、云南) 、阿列 布( 酉阳杂俎) ，为木犀科、齐墩果属常绿乔木。一般高5 7 米；枝近于圆柱形， 无刺。单叶对生，椭圆形、长椭圆形或披针形，长2 7 8 厘米，表面暗绿色，背 面密被银白色鳞片。圆锥花序，腋生，较叶为短；萼短小，4 齿裂；花冠短，4 裂几达中部；雄蕊2 枚；子房2 室，每室有胚珠2 颗。核果近形或长椭圆形，长 1 5 4 厘米，内果皮硬，成熟时黑色有光泽；种子1 颗，胚乳肉质，含有油分， 胚直。 据考古学家们发掘的古代遗物分析，油橄榄在地中海沿岸地区，己有多年 的栽培历史。主产国有西班牙、意大利、希腊、葡萄牙、突尼斯、土耳其、法国、 阿尔巴尼亚等。我国栽培油橄榄历史较晚，是1 9 6 4 年3 月3 日开始，一直 发展到现在，全国现有油橄榄超过1 6 0 0 万株。其中受国家质监总局公告2 0 0 5 年第1 7 6 号国家地理标志产品保护规定保护的甘肃省陇南市武都区是 目前全国最大油橄榄基地。 1 1 油橄榄的价值与应用 1 1 1 药用、食用与美容价值 油橄榄的营养成分可参见表1 1 。 表卜1 油橄榄的营养成分( 每10 0 9 含量) 油橄榄除含有以上营养成分以外，还含有磷脂，其中4 7 3 5 8 9 为磷脂 酰胆碱( p c ) ，5 3 8 0 为磷脂酰乙醇胺( p e ) ，1 8 0 2 3 9 为磷脂酰肌醇( p i ) 。 中医认为，油橄榄性味甘、涩、酸、平，对人体具有清肺、利咽、生津、解毒的 作用。因此，在中医药应用中多用于治疗咽喉肿痛，以及烦渴、咳嗽、吐血、菌 痢，还可解河豚毒和酒毒。故橄榄果除食用、榨油外，还广泛用于医药工业及化 妆品工业等l l 】。 中南大学硕士学位论文第一章绪论 橄榄油是油橄榄鲜果直接冷榨而成的天然食用植物油，营养丰富、抗 氧化性较强，产品用途广泛，是世界上公认的植物油皇后、液体黄金。橄榄 油中含有6 5 8 8 4 9 的单不饱和脂肪酸和3 5 2 2 左右的多不饱和脂肪酸，以及 丰富的微量元素角鲨烯、黄酮类物质和多酚化合物，同时它还含有每百克o 0 3 到o 3 6 毫克的b 胡萝卜素，1 2 4 3 毫克的维生素e ，及维生素a 、d 、f 、k 等多 种脂溶性维生素。因此当今医学界把橄榄油公认为最益于健康的食用油之一。美 国、德国等西方国家早已把橄榄油载入药典1 2 】。 国际橄榄油理事会( i o o c i n t 锄a t i o n a lo l i v eo i lc o u l l c i l ) 及欧盟的资料表 明，橄榄油对健康的益处如下： ( 1 ) 促进血液循环：橄榄油能防止动脉硬化以及动脉硬化并发症、高血压、心 力衰竭、肾衰竭、脑出血。橄榄油中的3 脂肪酸能增加氧化氮这种重要的化学 物质的量，可以松弛动脉，从而防止因高血压造成的动脉损伤。另外( ) 3 脂肪酸 还可以从两个方面防止血块的形成：首先，它能降低血小板的黏稠度，让血小板 与纤维蛋白原不易缠绕在一起；其次，3 脂肪酸能降低纤维蛋白原的量，也就 大大减少了血栓形成的机率。 ( 2 ) 改善消化系统功能：橄榄油中含有比任何植物油都要高的不饱和脂肪酸、 丰富的维生素a 、d 、e 、f 、k 和胡萝卜素等脂溶性维生素及抗氧化物等多种成 分，并且不含胆固醇，因而人体消化吸收率极高。 ( 3 ) 保护皮肤：橄榄油富含与皮肤亲和力极佳的角鲨烯和人体必需脂肪酸，吸 收迅速，有效保持皮肤弹性和润泽；橄榄油中所含丰富的单不饱和脂肪酸和维生 素e 、k 、a 、d 等及酚类抗氧化物质，能消除面部皱纹，防止肌肤衰老，有护 肤护发和防治手足皴裂等功效，用橄榄油涂抹皮肤能抗击紫外线防止皮肤癌。 ( 4 ) 提高内分泌系统功能：橄榄油能提高生物体的新陈代谢功能。橄榄油中含 有8 0 以上的单不饱和脂肪酸和3 脂肪酸。 ( 5 ) 对骨骼系统的益处：橄榄油中的天然抗氧化剂和( ) 3 脂肪酸有助于人体 对矿物质的吸收如钙、磷、锌等，可以促进骨骼生长，另外3 脂肪酸有助于保 持骨密度，减少因自由基( 高活性分子) 造成的骨骼疏松。 ( 6 ) 防癌作用：由于橄榄油中含丰富的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸，其 中多不饱和脂肪酸中的3 脂肪酸能降低癌肿从血液中提取的亚油酸的数量，使 癌肿戒除了一种非常需要的营养物质。3 脂肪酸还能与6 脂肪酸争夺癌肿 在代谢作用中所需要的酶，使癌细胞的细胞膜更为不饱和，变得易于破坏胄皂抑 制肿瘤细胞生长，降低肿瘤发病率。因此它能防止某些癌变( 乳腺癌、前列腺癌、 结肠癌、子宫癌) 。 ( 7 ) 防辐射作用：由于橄榄油含有多酚和脂多糖成分，所以橄榄油还有防辐射 2 中南大学硕士学位论文第一章绪论 的功能。 ( 8 ) 制作婴儿食品：原生橄榄油营养成分中人体不能合成的亚麻酸和亚油酸的 比值和母乳相似，且极易吸收，能促进婴幼儿神经和骨骼的生长发育。 ( 9 ) 抗衰老：橄榄油众多成分中，胡萝卜素和叶绿素赋予橄榄油黄绿色，而叶 绿素起新陈代谢作用，促进细胞生长，加速伤口愈合。还有助于美化人的外表， 减少皱纹的产生。 ( 1 0 ) 预防心脑血管疾病：橄榄油它可以从多方面保护心血管系统： 它通过降低高半胱氨酸( 一种能损伤冠状动脉血管壁的氨基酸) 防止炎症发生， 减少对动脉壁的损伤。 通过增加体内氧化氮的含量松弛动脉，降低血压。 原生橄榄油中的单不饱和脂肪酸能够降低l d a 胆固醇的氧化的作用。 橄榄油中所含有的一种叫角鲨烯的物质，可以增加体内h d l ( 好胆固醇) 的含 量，降低l d l ( 坏胆固醇) 的含量，而体内h d l 胆固醇的数量越多，动脉中氧化 了的l d l 胆固醇的数就越少。 橄榄油能通过增加体内3 脂肪酸的含量来降低血液凝块形成的。 1 1 2 经济价值 油橄榄是一种生态型经济树种，最重要的经济价值在于油橄榄果含油率很 高，一般在2 0 哆扣3 0 ，一吨油橄榄鲜果可榨油2 0 啦2 5 0 千克，目前市场上橄榄 油价格在每千克1 2 肛2 0 0 元不等。橄榄油是医药、保健、食品、乳品、化工等的 重要原料；另外，油橄榄鲜果还可用于制作罐头、蜜饯、果酱等；果渣可提油脂、 生物活性成分、蛋白质、制酒、生产肥料、塑料、压模板等；其嫩枝梢与叶子可 制作高级保健茶；油橄榄树纹理细致，是制作工艺美术品、家具、农具、建筑等 的良材；榨油后的糟粕可以作为饲料，实验证明1 3 蚝糟粕相当于1 埏玉米；每 年修剪下来的枝条经过粉碎加工后也可作为饲料，地中海沿岸国家每年把千万吨 的枝条加工成饲料，既促进了畜牧业的发展，又可以节省百万吨粮食。由此可见， 油橄榄具有很高的经济价值【2 j 。 1 1 3 观赏及人文价值 油橄榄属常绿小灌木，树形美观，枝叶繁茂，每年9 月份开白色小花， 1 0 月份结果，1 1 月份果实由绿色变成红色而成熟，我国从2 0 世纪6 0 年代 引种，现已在许多地区作为园林观赏植物栽培。 油橄榄是希腊的国树，这与希腊人民心目中神圣女神雅典娜是分不开的。 3 中南大学硕士学位论文第一章绪论 从橄榄树上，人们就能了解到希腊人民追求和平的历史，看到橄榄枝就会珍惜来 之不易的和平生活。如今橄榄枝已众所周知的成为和平的象征，联合国徽章和联 合国维和部队徽章都使用了橄榄枝作为图案。当古奥运会在奥林匹亚举行时，橄 榄枝被选作为给予运动员的最高奖赏，2 0 0 4 年雅典奥运会的会徽主体就是一个 由橄榄枝缠绕而成的桂冠。 1 2 油橄榄叶中的主要化学成分及其药理作用 国外学者对油橄榄的化学成分己进行了广泛和深入的研究工作，己分离到 1 0 0 多个化合物。在2 0 世纪9 0 年代以前，主要研究了该属植物茎皮和果实的化 学成分。近年来，研究工作集中在油橄榄叶的化学成分研究上。从油橄榄果和油 橄榄茎、叶中分离到的化学成分可分为：黄酮类2 0 种，木脂素2 1 种，香豆素类7 种，裂环烯醚萜类2 5 种，糖类，有机酸类及其他化合物【2 】。 油橄榄叶的主要活性物质为裂环烯醚萜类( 橄榄苦甙为主要成分) 和黄酮等 多酚类化合物，鉴于多酚类化合物的抗氧化能力，国外把油橄榄叶提取物已经广 泛用于化妆品、食品和药品。研究表明：油橄榄叶中含有的抗氧化活性成分较之 油橄榄果更为突出，尤其是裂环烯醚类主要存在于油橄榄叶中。每1 0 0 9 油橄榄 叶中，含抗氧化成分6 0 0 0 9 0 0 嘶g ，而油橄榄果中的含量为1 0 0 0 4 0 0 0 m g ，橄榄 油中仅有2 5 0 m g ，橄榄苦甙和黄酮等多酚类化合物在叶中的含量明显高于果子 和树皮【2 】。实验证明：橄榄多酚有抗氧化能力，能减轻低密度脂蛋白的氧化程度， 预防冠心病、动脉粥样硬化的发生。橄榄多酚也有舒缓血管平滑肌，降低血压的 能力；此外，它也有降血脂、降血糖的药理作用，有证据表明其降血糖作用与糖 诱导胰岛素释放反映增强和外周血葡萄糖的利用有关。n i s h i b es 等【3 1 人探讨了 橄榄叶提取物对肿瘤坏死因子的生成以及大鼠嗜碱性白血病细胞释放b 一氨基己 糖苷酶的抑制作用，并且了确定了对肿瘤坏死因子的生成起作用的活性成分和碱 性白血病细胞释放b 氨基己糖苷酶的抑制作用的活性成分；季崇敏等1 4 j 研究了橄 榄叶提取物对正常及糖尿病小鼠血糖和血脂水平的影响；王胜奎等【5 】研究表明橄 榄叶提取物橄榄苦甙对正常成人血糖水平具有明显的降糖作用； o b e i l a v e n t e g a r c i a 掣6 】研究了橄榄叶中多酚类化合物的抗氧化能力。 油橄榄叶水提物和醇提物用于抗疟疾和其他细菌、真菌、病毒引起的疾病， 如冷或热流感等；在临床上作为药品，能抑制病毒、细菌、微生物及其引起的毒 素，提高t 淋巴细胞、n k 细胞、吞噬细胞等的再生能力，加强细胞对病毒感染 的免疫能力【2 1 。 n s 缸c h e za v i l a 掣刀采用超声提取、超声硅烷化g c m s 法测定了油橄榄叶 4 中南大学硕士学位论文第一章绪论 中的三萜化合物，证实了油橄榄叶中山楂酸的存在；但是其因为缺乏山楂酸标准 品而采用齐墩果酸标准曲线进行定量计算，山楂酸在其两种油橄榄叶样品中的含 量( o 2 7 ，o 3 3 p g g 1 ) 还需证实。 1 3 油橄榄果及果渣中主要化学成分及其药理作用 油橄榄果及果渣中的主要成分是山楂酸、齐墩果酸等齐墩果烷型三萜化合 物。其具有广泛的生物活性和药理作用，尤其在抗肿瘤、抗炎以及机体免疫调节 等方面显现出令人关注的药理特性。 1 3 1 山楂酸性质 山楂酸( m a s l i n i ca c i d ) 纯品为白色粉末，分子式：o 觑占仉，分子量：4 7 2 7 0 ， 熔点：2 6 6 2 6 8 。不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、甲醇，可溶于乙酸乙酯、 苯、氯仿。山楂酸及齐墩果酸的分子式见图1 1 、1 2 。 h o h o 图卜l 山楂酸分子式 1 3 2 山楂酸的药理药效研究 图卜2 齐墩果酸分子式 1 3 2 1 抗肿瘤、抗癌作用 f 锄a n d oj 等【8 】研究发现在5 0 8 0 抑制细胞增长的浓度内 ( i c 5 0 h t 2 9 = 6l 士1 “m ，i c 8 0 h t 2 9 = 7 6 士l 肛m ，i c 5 0 c a c o - 2 = 8 5 士5 肛m ，i c s o c a c o - 2 = 1 1 6 士5p m ) ，山楂酸能够引起强烈的g 0 g 1 细胞周期阻滞和d n a 破碎，同时 增强胱冬肽酶3 的活性。然而，山楂酸并不改变细胞周期或者非肿瘤肠内细胞系 i e c 一6 和i e c 1 8 的细胞凋亡。证明在结肠癌细胞中山楂酸显示了显著地的抗增 殖效果，这是通过引起以胱冬肽酶3 激活为特征的细胞凋亡过程，而胱冬肽酶3 的激活是通过线粒体紊乱和细胞色素c 释放发生的p 5 3 i n d 印e 1 1 d e n t 机理实现的。 这些研究结果支持了山楂酸作为肿瘤抑制剂和一种有可能治疗结肠内异常细胞 中南大学硕士学位论文第一章绪论 增殖新方法的作用。在另一研究中，f e m a i l d oj 等【9 】研究发现山楂酸能够明显抑制 b c l 一2 的表达而增加b a x 蛋白，又能刺激线粒体细胞色素c 的释放并激活半胱天 冬氨酸酶9 和半胱天冬氨酸酶3 ，显著地抑制细胞增殖并导致癌细胞凋亡，从而 可以治疗结肠癌。 n o 血i r 0b a n n o 等【1 0 】研究了从枇杷叶中提取所得的三萜酸的抗肿瘤效果， 实验表明山楂酸表现中等强度的阻滞1 2 o 十四烷酰佛波醋酸酯1 3 ( t p a ) 诱导激 活e b 病毒早期抗原( e b v e a ) 的活性，其i c 5 0 = 4 8 1 ( m o lr a t i o 3 2p m o lt p a ) 。 i g u c l l i 等【l l 】报道山楂酸对人口腔鳞状癌细胞( h s c 2 ) 和人唾液腺癌细胞 ( h s g ) 具有抑制生长的功能，其活性强于熊果酸和齐墩果酸。 鼬m 等【l2 j 报道山楂酸对肺癌细胞a 5 4 9 、卵巢癌细胞s k - o v 3 和黑色素瘤细 胞s k - m e l 2 有抑制增殖作用。此外山楂酸还可用于乳腺癌【1 3 】、皮肤癌【1 4 1 以及 其他类型肿瘤【1 5 】的治疗。 1 3 2 2 降血糖作用 温小安等【1 6 ，1 1 7 】研究发现，山楂酸可显著对抗肾上腺素、葡萄糖引起的血糖 升高，对抗肾上腺素引起的肝糖原降解，增加葡萄糖致高血糖小鼠肝糖原含量， 可增加正常小鼠肝糖原储备，但不影响正常血糖。在山楂酸对小鼠肝糖原磷酸化 酶抑制测定实验中，其i c 5 0 - 9 9 “m 。 1 3 2 3 抗h i v 作用 x uh x 等【1 8 ，1 9 】报道了山楂酸具有抑制艾滋病病毒蛋白酶活性，在浓度 1 7 9 u 咖l 下，其对艾滋病病毒蛋白酶的抑制率达l o o ，强于熊果酸的8 5 。 a j l d r 6 sg a r c i a g r a n a d o s 等【2 u j 研究发现山楂酸能够抑制丝氨酸蛋白酶，而艾 滋病病毒正是利用这种酶将自身从被感染的细胞中向外部释放，扩散至病毒感染 者全身。科学家分别用浓度为每毫升2 5 微克和每毫升3 0 微克的山楂酸对人类t 淋巴细胞系进行了试验。结果显示，前者使培养基上清液中的p 2 4 抗原水平下降， 受艾滋病病毒感染的细胞减少。后者的防病效果更好，不仅p 2 4 抗原水平下降， 且细胞几乎不受艾滋病病毒的影响。p 2 4 是一种病毒衣壳蛋白，患者感染艾滋病 病毒后，其血清中最先出现的就是p 2 4 抗原。科学家由此确认，山楂酸能使艾滋 病病毒在体内扩散的几率降低8 0 。 1 3 2 4 抗氧化作用 a n am 细u e z m a n i n 等研究表明从油橄榄提取出的天然成分山楂酸在体 外培养细胞中有明显抗氧化性能，并在小鼠腹膜巨噬细胞模型中表明山楂酸在脂 多糖( l p s ) 诱导水平上抑制动脉诱导型一氧化氮核酶( i n o s ) 基因的表达。 m o n t i l l a 等【2 2 】通过体外由f e 2 + h 2 0 2 和体内由f e 3 + 抗坏血酸盐体系诱导产生 的羟基自由基研究了山楂酸对血浆或肝细胞膜易感性的脂质过氧化作用( l p o ) ， 6 中南大学硕+ 学位论文第一章绪论 结果表明经过山楂酸治疗的小鼠内源性血浆过氧化脂质水平和脂质过氧化敏感 性明显降低，显示了其体内和体外的抗氧化自由基的功能，预示其在抵抗氧化抑 制方面的潜力。 1 3 2 5 抗炎作用 a n am a r q u e z m a n i n 等【2 3 1 研究表明5 0 和1 0 0 p m ( p 提取 温度 提取时间 液料比，最佳提取方案为b 2 c 4 d 2 ，即以9 0 的乙醇溶液作为溶 剂，以2 0 ：l 的液料比在8 0 下提取4 h ，可以获得最佳提取效果，这与单因素试 验结果基本吻合。 3 4 提取山楂酸粗品 根据正交实验结果所得的提取条件，对油橄榄果渣样品按照3 2 5 项“提取 工艺流程和具体操作步骤进行提取。称取2 0 0 9 油橄榄粉末，加入4 l 9 0 乙醇 溶液于8 0 加热回流4 h ，得到沉淀固体物7 4 2 1 1 9 。用正己烷回流脱脂，所得固 体物干燥后称重，为3 8 2 3 4 9 对两次的样品进行h p l c 含量分析，山楂酸的含量 由1 1 5 7 提高至1 7 6 5 ，分别为0 8 5 8 6 9 和o 6 7 4 8 9 。2 0 0 9 油橄榄果渣中山楂酸 的含量为o 8 2 岛按提取率计算得提取率为8 2 3 。 3 5 中南大学硕士学位论文第三章山楂酸提取工艺条件的研究 3 5 本章小结 ( 1 ) 以油橄榄叶中山楂酸提取量作为指标，对油橄榄果渣和油橄榄叶中山 楂酸提取工艺进行优选，为其大规模工业生产提取奠定基础。采用h p l c 进行定 量分析，经单因素试验后采用l 1 6 ( 4 4 ) 正交试验，考察提取溶剂浓度、提取时间、 提取温度和液料比等因素来确定最佳提取条件。结果表明，用9 0 乙醇溶液作为 溶剂，以2 0 ：1 的液料比在8 0 恒温水浴中提取4 h 为最佳提取工艺条件。该提 取工艺方法简单、合理、成本低，可以作为油橄榄果渣和油橄榄叶中山楂酸的最 佳提取工艺条件。 ( 2 ) 采用溶剂回流法对两种原料提取物进行分离纯化前的预处理，使得硅 胶柱层析分离时对样品的处理变得简便。 中南大学硕士学位论文第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 4 1 概述 第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 色谱法是目前分离三萜类化合物最常用的方法。由于植物中三萜类化合物常 与极性相近的其他类成分共存，以复杂的混合物形式存在于天然样品中，且有些 三萜类化合物问结构十分相近，因此普通硅胶柱色谱、制备薄层色谱等传统色谱 分离方法难以满足获得较纯单体的目的。近年来，由于色谱填料和技术( 闪柱色 谱，正相或反相制备型h p l c 、l p l c 、m p l c 、d c c c 、双向高效薄层色谱 ( 2 d h p t l c ) 、棒柱色谱、硼酸阴离子交换树脂色谱( a s 砌p a l ( e s 一5 0 2 n ) 、和 羟基磷灰石柱色谱( h y d r o x y a p a t i t e ) 等，以及联用技术如l c u v 、l c m s 、 l c n m r 的不断发展与完善，加快了三萜类化合物分离纯化的进程。 通常，在研究三萜类成分的产物时，在文献调研的基础上需结合实际实操 作环境，针对性地从硅胶柱色谱、大孔吸附柱色谱、s e p h a d e xl h 2 0 柱色谱、 o d s 柱色谱、闪柱色谱、l p l c m p l c h p l c 、d c c c 等各种色谱分离方法中选 取几种相互结合运用，以分离得到三萜类化合物。 4 2 实验部分 提取所得的山楂酸粗品中山楂酸的含量较低，且含有齐墩果酸，需进一步的 分离纯化。本章将采用硅胶柱层析法对山楂酸进行初级分离，以提高其在样品中 的含量，然后以制备高效液相色谱进行纯化得到高纯度山楂酸单体。 4 2 1 仪器和试剂 d h g 型智能电热鼓风干燥箱，南通嘉程仪器有限公司；s h b i i i 循环水式多 用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；w 二o 型系列恒温水浴锅，上海申顺生物 科技有限公司；r 2 0 1 旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；a y l 2 0 型电子 天平( 1 1 0 0 0 ) ，日本岛津公司。 氯仿、丙酮、乙酸乙酯、l ，2 二氯乙烷、冰醋酸、甲醇，国药集团化学试剂 有限公司；硅胶g 板( 5 0 1 0 0 m m ) ，层析硅胶( 2 0 0 3 0 0 目) ，青岛海洋化工厂； 玻璃层析柱( 3 0 x5 0 0 1 1 1 m ，5 0 1 2 0 0 m m ) 。 3 7 中南大学硕士学位论文 第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 4 2 2 湿法装柱 装柱方式常用的有两种，即湿法装柱和干法装柱；干法装柱因不易装填均 匀使分离效果下降而逐渐被湿法装柱所取代。但采用干柱层析分离效果好于湿 法，所以对于某些分离系统，干法装柱仍有自身的优点，依然适用。 硅胶完全冷却后，加入硅胶体积约一倍量的氯仿用玻璃棒充分搅拌，超声赶 走液体中的气泡，然后再搅拌、超声直至气泡完全赶走，硅胶全部浸润。将层析 柱底部用一层脱脂棉塞好( 不能太紧或太松，否则流速太慢或太快都会导致馏分 交叉，并且太松时硅胶会流出) 。用胶头滴管吸取一些氯仿沿柱壁慢慢滴下，以 浸湿脱脂棉；将硅胶匀浆一次性全部倾入层析柱中。随着沉降，会有一些硅胶沾 在柱壁上，用氯仿将其冲入柱中。在硅胶沉降过程中，用洗耳球或橡皮塞( 套在 玻璃棒上) 轻轻敲打四周柱壁以赶走可能存在的小气泡。另外再加入一些氯仿， 当硅胶面不再下降，流速稳定时，即可上样进行洗脱。柱床约为9 1 0 柱体积。 4 2 3 上样和洗脱 加样方式有两种，即溶剂加样和干法加样，目前常用的是前者，分离效果 较好，但后者较为方便。 在柱色谱分离中，样品的溶解是十分重要的。用一定的极性强的良性溶剂溶 解样品，加入适量硅胶，使样品均匀涂渍在硅胶上，再挥干溶剂将它装于色谱柱 柱床顶部。实验中称取定量山楂酸粗品，在甲醇中溶解后加入硅胶，在甲醇环境 中把二者研磨均匀，然后加热挥净甲醇，将其轻轻加到色谱柱的柱床顶部。加入 一些氯仿，小心地将山楂酸样品加入柱床顶部，用胶头滴管吸取氯仿冲洗粘在柱 壁上的样品。待样品表面平整时，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面，避免在加 入洗脱剂时冲散样品或造成样品塌陷。 洗脱剂的选择是绝对分离效果的关键，一般应先用同类吸附剂制成的薄层 色谱做展开实验后选定。通常若样品极性较强，洗脱剂也应选择极性强的溶剂； 若样品极性弱，洗脱剂也应选择极性较弱的溶剂，具体情况需要在实验中探索得 到。洗脱方式可分为等浓度洗脱、脉冲洗脱和梯度洗脱，常用梯度洗脱；洗脱液 流速视柱子体积而定，洗脱馏分的接样体积视上样量的多少而定。 将洗脱剂接近填满硅胶柱，然后取蓄液球置于顶端，加入洗脱剂进行洗脱， 根据上样量的多少选择适合的体积进行馏分收集，采用薄层色谱跟踪检测目标 物，合并相同馏分旋转蒸发至干。 中南大学硕士学位论文 第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 4 2 4 重结晶 通过硅胶柱色谱分离后的目标物已经具有较高的浓度，但实际上可能种种原 因使得产品并不是很纯，如由于大剂量的有机溶剂的浓缩，有机溶剂中原本含量 很低的杂质在洗脱过程中得到了积聚，使得在样品中得到检出；另外所购买的商 品硅胶也可能含有一些不纯物，而硅胶的用量又比较大，这也可能引入杂质。因 此可以对所得成分进行重结晶以提高目标物的纯度。将分段收集的山楂酸、齐墩 果酸馏分分别蒸发至干，在烧瓶底部用吹风机吹几分钟以使低沸点的有机溶剂杂 质挥发，然后置于烘箱中在1 0 5 烘3 0 m i n 。将收集的样品制成热的饱和乙醇溶 液，然后将溶液置于冰水浴中迅速冷却，待完全冷却后过滤。齐墩果酸馏分经重 结晶后溶剂在无水乙醇中，在冰箱中放置过夜，出现针状结晶，与文献描述一致。 4 3 结果与讨论 4 3 1 吸附剂用量的选择 在吸附过程中，吸附剂用量是一个非常重要的参数，直接影响到吸附是否完 全、吸附剂的利用率和分离的效果。对于容易分离的样品，样品与硅胶的重量比 可以高达l ：3 0 ；对于一般的分离，如两组份待分离物在薄层上的r f 0 4 ，则可 使用1 ：( 5 0 1 0 0 ) 重量比比较合适；对于较难分离的样品，可以使用1 ：2 0 0 的比例。 t l c 分析时，山楂酸和齐墩果酸斑点的r f 差值约为o 3 ，实验中探索了样品与 硅胶重量比在l ：1 0 0 左右时两者的分离效果：当硅胶用量与上样量比低于7 0 ：1 ( 曲 时，山楂酸与齐墩果酸馏分无法充分展开；两者比例在7 0 ：1 1 0 0 ：1 时，由于两者 极性相近，无法得到有效分离，有一定程度的交叉；两者比例在1 0 0 ：1 1 2 0 ：1 时， 分离有所改善，能够基本实现分离山楂酸馏分紧随齐墩果酸馏分之后被洗脱下 来。若比例继续增大时，硅胶的用量增加，在两馏分间出现一段空白馏分，而且 硅胶浪费严重。实验中，选择硅胶用量与上样量比为1 2 0 ：1 ，既能实现分离的目 的又节省了硅胶和洗脱剂。 4 3 2 洗脱剂的选择 将上柱样品与对照品溶解于甲醇并排点于薄层板上，采用1 0 乙醇硫酸溶 液1 0 5 加热显色，考察了氯仿丙酮、石油醚乙酸乙酯、氯仿甲醇水、二氯甲 烷一乙酸乙酯、l ，2 二氯乙烷乙酸乙酯等展开剂的展开效果，结果发现4 ：1 的氯仿 3 9 中南大学硕士学位论文 第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 丙酮体系中目标斑点清晰，山楂酸与齐墩果酸斑点的r f 差值约为o 3 ，且山楂 酸的比移值r f 为0 3 7 8 ，所以选择氯仿丙酮体系作为洗脱剂。 4 3 3 纯度及收率测定 实验中称取了1 5 9 山楂酸粗品上样进行柱层析，按照2 3 项中色谱条件进行 含量分析，山楂酸的含量由粗品中的1 7 6 5 提高至5 4 2 ，收率为5 1 6 。对其 重结晶进一步纯化后，山楂酸含量为8 6 9 8 。柱层析山楂酸馏分经浓缩后样品 的h p l c 色谱图见图4 2 。山楂酸馏分重结晶样品的h p l c 检测示意图如图4 3 所示。 图4 2 硅胶柱层析山楂酸馏分高效液相色谱图 图4 3 山楂酸馏分重结晶后h p l c 检测示意图 中南大学硕士学位论文第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 4 4 制备型h p l c 法 h p l c 色谱分析发现仍能检测到齐墩果酸色谱峰。采用制备型h p l c 对其进 行纯化以除去齐墩果酸成分。 作为一种能获得高纯度化合物的分离制备技术，制备型高校液相色谱 ( p r e h p l c ) 在最近几年中发展很快，与常规液相色谱分析过程不同，制备型 液相色谱的目的不是为了了解混合物中各化合物的组成，而是收集被分离开的组 分，此时需要考虑的是产品的纯度、回收率、操作时间、成本等。传统的制备色 谱柱中填料的粒径较分析色谱柱大，为了达到相同的分离度，制备色谱柱的长度 也较长，而且必须先在分析色谱柱上优化分离方法，再在制备色谱柱上进行二次 优化，因而耗费大量的时间与溶剂。随着制备液相色谱技术的发展，目前的技术 已可以将小粒径( 5 p m ) 的填料装填成制备色谱柱而直接利用在分析色谱柱上优 化的方法进行线性放大，大大节省了方法开发的时间和放大过程所需的费用，同 时也更进一步地促进了制备型高效液相色谱技术的广泛应用。 4 4 1 预处理 制备型高效液相色谱可以获得纯度很高的产品，单样品在上样之前需要经过 预处理，如柱层析，尽量除去杂质，获得相对较纯的粗产品。由于现在制备型高 校液相色谱的制备柱填料直径较小，通常在5 一l o p m ，所以在上柱前需用o 4 5 岬l 的滤膜过滤以除去大的杂质，防止堵塞。 4 4 2 线性放大 从分析色谱过程放大到制备色谱过程，通常需要考虑的因素包括色谱柱尺 寸、填料、流量、操作压力、进样量、产品纯度、产品回收率、色谱分离效果等 多种因素。由于分析色谱系统和制备色谱系统的化学性质、传质过程在线性范围 内基本保持不变，因而只要将进样量、流量、收集体积等乘以线性放大系数即可。 线性放大系数为制备色谱柱截面积与分析色谱柱截面积之比。 制各柱进样量= 分析柱进样量( 如付，) 2 ( 三以，) 制备柱流量= 分析柱流量( 如留，) 2 其中，击：制备柱的直径幻：制备柱的长度 西：分析柱的直径三，：分析柱的长度 4 l 中南大学硕士学位论文 第四章山楂酸分离纯化工艺的研究 制备色谱中，最好的线性放大是在其他工艺条件都不变的情况下，只改变柱子和 流速，就可以进行放大生产，同时分离效果保持不变。 4 4 3 超载 制备型h p l c 以生产纯物质为目的，在经济合理的前提下，规模越大越好。 在制备型h p l c 中，超载可提高制备量，节省投资和降低操作费用，即以最少的 时间生产最大量的产品。柱的超载方式有两种，一种是质量超载，即维持较小的 进样体积，提高进样浓度；另外一种是体积超载，即保持较小的进样浓度，增加 进样体积。体积超载对制备分离的柱效的影响比质量超载的影响更大，在制备型 h p l c 中，一般采用质量超载的方式较好。 4 4 4 主要试剂及仪器 乙醇、乙酸( 分析纯，国药集团化学试剂有限公司) ，双蒸水( 本实验室自 制) ；a 西1 e 1 1 t 1 1 0 0 高效液相色谱仪，包括：真空脱气机，四元泵，自动迸样器， 恒温柱温箱，紫外检测器，h p 化学工作站等，美国安捷伦公司；色谱柱：