（细胞生物学专业论文）载脂蛋白e克隆表达及功能研究.pdf

中文摘要载脂蛋白e ( a p o e ) 是3 4 k d a 大小的多功能分子，由2 9 9 个氨基酸组成，是c m 、7 l d l 、i d l 和部分h d l 的组分，通过l d l 受体途径调控脂蛋白代谢，在脂类代谢中发挥重要作用。a p o e 主要在肝组织和脑组织中合成，其它外周组织中也有不同程度的表达抻枢神经系统中的a p o e对脑组织淀粉样蛋白的沉积与清除、微管蛋白稳定性的维持、细胞信号转导、免疫调节、葡萄糖代谢、氧化应激等都有潜在的作用，a p o e在体内发挥十分重要的生物学活性。a p o e 蛋白是一种多态性蛋白，最常见的三种异构体为a p o e 。、a p o e 。和a p o e 。a p o e 。是大多数健康人所具有的表型。f 在1 1 2 和1 5 8 位a p o e 。分别是半胱氨酸和精氨酸，a p o e ：均是半胱氨酸，a p o e 。均是精氨酸。a p o e 。与l d l r 结合能力很差，与型高脂血症关联aa p o 百2 和a p o e 。与高胆固醇血症、动脉粥样硬化( a s ) 等疾病有关，a p o e 。还是老年痴呆( a d )的高发风险因子，而a p o e 。则对预防老年痴呆病的发生具有积极作用。fa p o e 基因敲除鼠或缺失a p o e 基因的人将出现严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。a p o e 的缺失可促进动脉粥样硬化的发生发展，给a p o e 基因敲除鼠反复注射a p o e 重组蛋白、在肝组织中用腺病毒载体表达a p o e 蛋白、移植带有正常a p o e 基因的小鼠骨髓，都能使a p o e 基因敲除鼠的动脉粥样硬化得到回复，表明a p o e 基因及其表达产物对动脉粥样硬化的发生具有抑制作用，a p o e 。对动脉硬化的阻抑作用要比a p o e 2 和a p o e 4 都明显。流行病学研究表明，a p o e 。基因是a d 发病的易患因子。与a p o e 。相比，a p o e 。基因携带者a d 发病风险增加，发病年龄提前，呈现基因剂量效应。与之相反，a p o e 。基因携带者长寿，a d 发病年龄滞后，因此认为a p o e 。对a d 的发生具有阻止作用。分子生物学研究发现，a p o e 异构体对神经细胞退化表现出异构体特异作用，a p o e 。和a p o e 。有助于维持微管的稳定性，而a p o e 。则使t a u 蛋白超磷酸化，破坏微管的稳定性，使神经细胞易于形成神经纤维缠结。a p o e ：和a p o e 。对a1 3 的清除率远远高于a p o e a ，a p o e 。对ab 的清除能力最强，可见a p o e 。对a d 的发生具有较强的阻止作用。至于a p o e 如何影响神经退化性疾病的发生机制仍然不详。r本姬是基于上述两方面的研究进展，试图探索a p o e 在预防治疗动脉粥样硬化及老年痴呆性疾病中的应用前景，利用分子生物学技术克隆表达人a p o e 基因，并对其功能进行探讨性研究。i 从正常流产胎儿肝组织中提取总r n a ，分离纯化m r n a ，以m r n a 为模板，r t p c r 特异扩增带信号肽和不带信号肽的人a p o e 。e d n a 片段，将a p o e 。e d n a 片段克隆测序，其序列与基因库中已报道的人a p o e 。序列一致。将此c d n a 片段定向插入p q e 。表达载体中，诱导表达人a p o e 。蛋白。所获得的重组人a p o e 。蛋白分子量为3 6 k d a ，是一种融合蛋白，n 端融合有6 个组氨酸，用鼠抗人血浆a p o e 单克隆抗体做免疫印迹分析表明，ec o i l 表达的3 6 k d a 大小的融合蛋白具有免疫反应性，能与人血浆a p o e 单克隆抗体特异结合。p q e 3 0 - a p o e s 重组质粒在b l 2 1 宿主菌中以可溶蛋白形式表达，大部分蛋白存在于裂解液离心上清中，经c h e l a t i n gs e p h a r o s e “f a s tf l o w特异性亲和层析，得到了电泳纯的a p o e 。重组蛋白。纯化的重组蛋白与ab1 - 4 0 淀粉样多肽具有特异性结合作用，并呈现s 型的饱和结合曲线，其k d 值大小为2 6 n m 。重组a p o e 。蛋白对a 且2 5 3 5 多肽诱导的胎鼠大脑皮质神经细胞凋亡及ab2 5 - 3 5 和ab1 - 4 0 多肽诱导的神经成纤维胶质瘤细胞生存力下降均具有明显的拮抗作用，表明a p o e 对神经退化性疾病中的细胞死亡具有拮抗作用。重组a p o e 。蛋白对大鼠血管平滑肌细胞的增殖具有明显的抑制作用，血管平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化进程中发挥重要的病理作用因此a p o e 。对动脉粥样硬化形成具有阻抑作用。用p e d n a 。一a p o e 。真核表达载体与脂质体共转染神经成纤维胶质瘤细胞，用g 4 。选择压力筛选，细胞免疫荧光检测表明，p c d n a 。- a p o e 。转染的神经成纤维胶质瘤细胞表达了a p o e 。重组蛋白，这种内源性的a p o e 。重组蛋白对2 5um ab2 5 3 5 多肽诱导的神经成纤维胶质瘤细胞的死亡具有拮抗作用。，) - 一1关键词：载脂蛋白e基固克隆蛋白表达动脉粥样硬化老年性痴呆a b s t r a c ta p o l i p o p r o t e i ne ，a3 4 k d ap r o t e i nc o m p o s e do f2 9 9a m i n oa c i d s ，i sam u l t i f u n c t i o n a lm o l e c u l a r , w h i c hi sa l li m p o r t a n tf u n c t i o n a lc o m p o n e n to fc h y l o m i c r o n sa n dv e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n , i n t e r m e d i a t ed e n s i t yl i p o p r o t e i na n dh i 曲d e n s i t yl i p o p r o t e i n s a sal i g a n df o rt h el o wd e n s i t yl i p o p m t e i nr e c e p t o r ( l d l r ) ，i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h em e t a b o l i s mo fp l a s m al i p o p m t e i n s i ti sp r e d o m i n a n t l ys y n t h e s i z e di nl i v e ra n db r a i n , b u ti ti sa l s os y n t h e s i z e db yaw i d ev a r i e t yo ft i s s u e sa n dc e l lt y p e s t h ee x p r e s s e da p o ep r o t e i ni nc e n t r a ln e u r o n a ls y s t e mf u n c t i o n sp o t e n t i a l l yi nd e p o s i t i o na n dc l e a r a n c eo fa m y l o i d a lp e p t i d e ，s u s t a i n i n gt h es t a b i l i z a t i o no fm i c m t u b u l ep r o t e i n s ，c e l l u l a rs i g r l a lt r a n s d u c t i o n , i m m u n er e g u l a t i o n ，g l u c o s em e t a b o l i s ma n do x i d a t i o ns t r e s s a p o ep l a y sak e yb i o l o g i c a la c t i v er o l ei nv i v o a p o ei sap o l y m o r p h i s mp r o t e i n ，w h i c he x i s t sa st h r e ec o m m o ni s o f o r m ，a p o e 2 ，a p o e 3a n da p o e 4 t h em o s tc o m m o ni s o f o r m , a p o e 3 ，h a sc y s t e i n ea n da r g i n i n ea tp o s i t i o n1 1 2a n d1 5 8 ，r e s p e c t i v e l y , w h e r e a sa p o e 2h a sc y s t e i n ea n da p o f 4h a sa r g i n i n ea tb o t hp o s i t i o n s a p o e 2b i n d sp o o r l yt ot h el d l r ，a n dh o m o z y g o u si n h e r i t a n c eo f t h ea p o e 2a l l e l ei ss t r o n g l ya s s o c i a t e dw i t ht y p ei i id y s l i p o p r o t e i n e m i a a p o e 2a n da p o e 4a l ea s s o c i a t e dw i t hh y p e r c h o l e s t e m l e m i aa n da t h e m s c l e m s i s ( a s ) t h ea p o & i sa l s oa s s o c i a t e dw i t hh i g h e ri n c i d e n c ea n de a r l i e ra g eo fo n s e to fl a t eo n s e tf a m i l i a la l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) ，w h e r e a sa p o e 2m a yh a v et h eo p p o s i t ee f f e c t d e f i c i e n c yo fa p o er e s u l t si ns e v e r eh y p e r c h o l e s t e r o l e m i aa n dd i f f u s ea t h e r o s c l e r o t i cd i s e a s ei nh u m a n sa n dg e n e - t a r g e t e dm i c e d e f i c i e n c yo fa p o em a yp r o m o t et op r o d u c ea n dd e v e l o pa t h e r o s c l e r o t i cl e s s i o n s t h ea p o eg e n e t a r g e t e dm i c ew i l lr e s u l ti nm a r k e dr e g r e s s i o no fb o t he a r l ya n da d v a n c e da t h e r o s c l e r o t i cl e s i o n sb yi n j e c t e da p o er e c o m b i n a n tp r o t e i n o rb yt r a n s f e c t e da d v i r a lv e c t o r 、v i t l la p o ec d n at oe x p r e s sh u m a na p o et r a n s g e n ei nl i v e r , o rb yt r a n s p l a n t a t i o no fb o n em a r r o w 、i t l ln o r m a lr a ta p o eg e n e t h i sd e m o n s t r a t e st h a ta p o eg e n ea n di t se x p r e s s i n gp r o d u c tc a ni n h i b i tp r o g r e s s i o no fa t h e r o g e n e s i s a p o e 3h a sam o r ee f f e c t i v ep r e v e n t i o nf r o ma st h a na p o e 2a n da p o e 4 e p i d e m i o l o g i c a ls t u d i e sa r es h o w nt h a ta p o e 4g e n ei sar i s kf a c t o rf o ra l z h e i m e r sd i s e a s e c o m p a r e dw i t ha p o e 3 ，t h es u b j e c t sw i t ha p o e 4g e n ei n c r e a s et t l er i s kf o ra l z h e i m e r sd i s e a s ea n dd e c r e a s et h ea g e 丽ma l z h e i m e r sd i s e a 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sm o r ee f f e c t i v et h a nb ya p o e 4 a p o e 2h a st h es t r o n g e s ta b i l i t yt oc l e a rt h ea m y l o i d a lp e p t i d e i ti ss h o w nt h a ta p o e 2h a sas t r o n g e rp r e v e n t i o nf r o ma l z h e i m e r sd i s e a s e a st ot h em e c h a n i s mo fa p o eh o wt oa f f e c tt h en e u r o d e g e n e m t i v ed i s e a s e si sy e tu n c e r t a i n t h et h e s i si sb a s e do nt h ea b o v er e s e a r c ha d v a n c e w eh a v eb e e nw i n gt oe x p l o r et h ep r o s p e c t i o no fa p o ei np r e v e n t i o nf r o ma t h e r o s c l e r o s i sa n da l z h e i m e r sd i s e a s e t h ea p o eg e n ew a ss e p a r a t e d ，c l o n e da n de x p r e s s e d ，a sw e l la si t sf u n c t i o nw a ss t u d i e di nt h et h e s i s t h eh u m a nt o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mt h ef o e t a ll i v e rt i s s u es a m p l eo fs p o n t a n e o u sa b o r t i o n m r n aw a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e df r o mt o t a lr n a a p o e 3e d n aw a sa m p l i f i e db yr t _ p c rw i t has i g n a lo rw i t h o u tas i g n a ls e q u e n c e i t ss e q u e n c ei sc o n s i s t e n tw i t ht h er e p o r t e da p o e 3s e q u e n c ei nt h eg e n eb a n k t h ea p o e 3e d n af r a g m e n tw a si n s e r t e di n t op q e 3 0e x p r e s s i n gv e c t o ra tb a m h ia n dh i n d i i is i t e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si n d u c e dt oe x p r e s si nb l 2 1h o s tc e l lb yi m mi p t g t h ee x p r e s s e dp r o t e i ni sa3 6 k d af u s i o np r o t e i nw i t hs i xh i s t i d et a i la ti t snt e r m i n a ls e q u e n c e i tc a nb eh y b r i d i z e db ym i c ea n t i h u m a na p o em o n o c l o n a la n t i b o d y t h i sd e m o n s t r a t e st 1 1 a tt h ee x p r e s s e d3 6 k i ) af u s i o np r o t e i ni ne c o l ih a sa ni m m u n o b i o a c t i v i t yw h i c hs p e c i f i c a l l yb i n d st oh u m a na p o em o n o c l o n a la n t i b o d y p q e 3 0 - a p o e 3r e c o m b i n a n tp l a s m i dc o u l de x p r e s ss o l u b l ei n t e r e s t i n gp r o t e i ni ne c o l ic e l l m o s te x p r e s s e dp r o t e i ni si nt h es u p e r n a t a n to ft h ep r e c i p i t a t i o no ft h el y s e sb a c t e r i a le x t r a c t t h er e c o m b i n a n ta p o ep r o t e i nw a sa b s o r b e ds p e c i f i c a l l yb yc h e l a t i n gs e p h a r o s e l ”f a s tf l o wm e d i aa n de i n t e dt oo b t a i nt h ep u r er e c o m b i n a n tp r o t e i na te l e c t r o p h o r e s i sl e v e l t h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l db i n dt ob e t aa m y l o i d a lp e p t i d e1 4 0f r a g m e n t ss p e c i f i c a l l ya n de x h i b i tt h e s ”f o r ms a t u r a t e db i n d i n gc u r v e h sk d v a l h e i s 2 6 n m r e c o m b i n a n ta p o e 3p r o t e i nc o u l di n h i b i tt h ed e a t ho ft h en e u r o c y t ec e l lo fm i c eb r a i ni n d u c e db yb e t aa r n y l o i d a lp e p t i d e2 5 - 3 5f r a g m e n ta 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4 l b ，n 坨i m m u n o h i s t o c h e m i c a la s s a yw a ss h o w nt h a tn e u r o b l a s t o m ac e l lt r a n s f e c t e db yp c d n a 3 a p o e 3e x p r e s s e dt h er e c o m b i n a n ta p o ep r o t e i n t h ei n t r a c e l l u l a re x p r e s s e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l di n h i b i tt h ed e a t ho fn e u r o b l a s t o m ac e l ji n d u c e db yb e t aa m y l o i d a lp e p t i d e s2 5 3 5f r a g m e n t k e yw o r d s ：a p o l i p o p r o t e i neg e n ee x p r e s s i o ng e n ec l o n ea t h e r o s e l e r o s i sa l z h e i m e r sd i s e a s e独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：鍪) 塞日期：旦墨，生：! 兰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：召筮) 蠢指导教师签名：日期：! i ：! ! e t期：学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：丝塑蟛邮编：堕塑型a da saba p oa p pc a dc ec mc n t fc h dc s fd m p cf d主要英文缩写词表a 1 z h e i m e r sd i s e a s ea t h e r o s c l e r o s i sb e t a a m y l o i dp e p t i d ea p o i p o p r o t e i na m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i nc o r o n a r ya r t e r yd i s e a s ec h o le s t e r y le s t e rc h y l o m i c r o nc i1i a r yn e u r o t r o p h icf a c t o rc o r o n a r yh e a r td is e a s ec e r e b r a ls p i n a lf l u i dd i m y r i s t o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n ef a m i l i a ld y s b e t a l i p o p r o t e i n e m i ah d lh i g hd e n s i t yli p o p r o t e i nh s p gh a p a r a ns u l f a t ep r o t e o g l y c a nh v u e c1 d ll d ll p sl r p姒p k姒pn f th u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i c a lc e l l si n t e r m e d i a t ed e n s i t y1i p o p r o t e i nl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i nl i p o p o l y s a c c h a r i d el d lr e c e p t o r a s s o c i a t e dp r o t e i nm i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s em i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i nn e u r o f i b r i1 a r yt a n g l e阿尔茨海默氏症动脉粥样硬化b 淀粉样蛋白载脂蛋白淀粉样前体蛋白冠状动脉病胆固醇酯乳糜微粒纤毛神经营养因子冠心病脑脊液二甲基磷脂酰胆碱家族性异常b 脂蛋白血症高密度脂蛋白硫酸乙酰肝素蛋白聚糖人脐动脉血管内皮细胞中等密度脂蛋白低密度脂蛋白脂多糖l d l 受体相关蛋白有丝分裂原活化的蛋白激酶微管相关蛋白神经纤维缠结p h fp a i r e dh e l i c a lf i l a m e n t s成对螺旋纤丝p n 卜hp h o s p h o r y l a t e dn e u r o f il a m e n to fh i g h 高分子量磷酸化神m o l e e u l a rw e i h g t经丝v c a m 一1v a s c u l a re e l la d h e s i o nm o l e e u e l血管细胞粘附分子s m cs m o o t hm u s c l ec e l l平滑肌细胞s ps e n i1 ep l a q u e老年斑t gt r i g l y c e r i d e甘油三酯t p ct o t a lp l a s m ac h o l e s t e r o l总胆固醇第一部分文献综述脂蛋白中的蛋白部分称为载脂蛋白( a p o p o p r o t e i n ，a p o ) 2 0 世纪6 0 年代中期以来，脂蛋白中的蛋白质部分成为研究的焦点，开始是研究载脂蛋白的分离、提纯及阐明其物理性质和化学结构，后来着重研究载脂蛋白的功能，8 0 年代以来基本上已阐明了各种主要载脂蛋白的基因结构。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能，载脂蛋白构成并稳定脂蛋白的结构；修饰并影响与脂蛋白代谢有关的酶活性：作为脂蛋白受体的配体，参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的结合及其代谢过程。一、载脂蛋白e载脂蛋白e ( a p o l i p o p r o t e i ne ，a p o e ) 是一种多功能分子，是血浆脂蛋白的主要组分，通过低密度脂蛋白( l o wd e n s i t y1 i p o p r o t e i n ，l d l ) 受体途径负责对脂蛋白残粒的摄取。它还是中枢神经系统的主要组分，对脑组织淀粉样蛋白的沉积与清除、微管蛋白稳定性的维持、细胞信号传导、免疫调节、葡萄糖代谢、氧化应激等都有潜在的作用。3 。与其它载脂蛋白相比，a p o e 在许多外周组织中都有表达，具有十分广泛的生物学活性。在正常人血浆中a p o e 蛋白浓度为3 0 5 0 m g l ，对体内脂质代谢及其它生化过程发挥重要的作用。( 一) a p o e 基因结构人a p o e 基因位于1 9 号染色体p 1 3 一q 1 3 区，处于a p o c i 基因上游5 5 k b 处，与a p o c i a p o c i i 基因构成紧密连锁的载脂蛋白基因家族0 3 。在a p o e 基因的远端区有多组织特异性的增强子和负调控元件”1 ，远端增强子和肝控区是a p o e 在肝中表达所必需的，位于a p o e基因下游1 5 k b 处“1 。一3 6 0 与一8 0 间的区域及第一内含子中的区域对a p o e 基因表达调控很重要。1 ，转录因子s p 一1 在其中发挥重要作用，它结合一1 6 1 至- 1 4 1 处序列调节上游调控元件的活性“1 。a p o e 基因全长3 5 9 7 b p ，与其它载脂蛋白基因具有相似的结构”1 ，如图i 示，由四个外显子( 4 4 ，6 6 ，1 9 3 ，8 6 0 b p ) 和三个内含子( 7 6 0 ，1 0 9 2 ，5 8 2 b p ) 组成”1 。第二内含子切断编码a p o e 前体肽第4 位氨基酸的密码子，第三内含子切断编码成熟蛋白质第6 l 位氨基酸的密码子。m r n a 转录起始点位于第一内含子上游4 4 b p 处”1 。a p o e 基因的t a t a 盒元件位于转录起始点上游3 3b p 处，a p o e 基因编码1 1 6 3b p 的m r n a 。图1 人载脂蛋白a i 、a i i 、a n 、b 1 0 0 、e 、c 1 1 、c 基因组成比较a p o e 基因具有多态性，其异构体a p o e ：、a p o e 。和a p o e 。在d n a 水平只在外显子4 中有单一位点突变。与a p o e 。相比，a p o e 。在1 1 2 位密码子中的t c ( t g c c g c ) ，a p o e ：在1 5 8 位密码中的c t ( c g c t g c )“，认为a p o e 。和a p o e 。基因是从a p o e 。基因进化来的“。a p o e 基因还存在一些其它多态变异位点，由此决定一些罕见的a p o e 基因突变体“。近年来对a p o e 基因及其两侧区域的序列进行重新测序，发现了2 2 个双位点变异，定义为3 1 种a p o e 基因的近模式标本m 1 。a p o e 基因频率在不同地域的人群间变化很大。a p o e 。基因在人群中都是常见的等位基因，a p o e 。基因频率在巴布亚新几内亚人种中最高“，在尼日黑人中最低( 0 0 0 2 7 ) “，在日本人中为0 0 3 7 “，在美国印第安人种和澳大利亚土著人种中a p o e 。基因总体上几乎不存在“2 ”1 。a p o e 。基因在侏儒症病人“、尼日黑人n 3 1 、苏丹人m 1 和澳洲土著人”中比较常见，其基因频率分别为0 4 1 、0 3 0 、0 2 9 、0 2 6 ，而在中国人群中a p o e 。基因频率最低“，在欧洲从北到南a p o e 。基因频率呈明显的下降态势“。a p o e 基因多态性对基因本身产物具有很强的作用，a p o e 。基因表达的蛋白浓度较高，而a p o e 。基因则表达较低浓度的a p o e 蛋白1 。a p o e还有一些稀有突变体，它们都是a p o e 。基因、a p o e 。基因和a p o e 。基因的变异体，根据这些基因可以产生六种基因型：a p o e 。、。、。、。，：和。其基因频率依次递减“。，与人类相比，鼠类只有一个a p o e 基因，人a p o e ，对鼠低密度脂蛋白受体( l d l r ) 的亲和力较低，因为人a p o e 。与鼠a p o e 间存在差异，人和鼠a p o e 氨基酸序列存在3 0 的差异，这种差异多存在于n 端和c 端”“，人与鼠a d o e 受体结合域( 1 3 6 1 6 0 ) 高度保守，2 5 个残基中有2 1 个是相同的，其中包括几个被认为对受体结合很关键的残基。从功能上看，它与人类功能的相似度有多大还不清楚，用人a p o e 。基因替换鼠a p o e 基因，结果e 。基因型鼠很易患高脂食物型高脂血症，表明人的a p o e 可能不是鼠受体的适合配体。“。( 二) a p o e 蛋白结构s h o r e 于1 9 7 3 年首先发现a p o e ”“，u t e r m a n1 9 7 5 年分离并命名为载脂蛋白e ”“。r a i l 等于1 9 8 2 年测出了a p o e 蛋白的一级结构o ，是一种富含精氨酸的碱性蛋白，人a p o e 蛋白由2 9 9 个氨基酸组成，分子量为3 4 1 4 5 d ，含3 2 个a r g 和1 2 个l y s ，存在于血浆的乳糜微粒( c h y l o m i c r o n ，c m ) 、极低密度脂蛋白( v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，v l d l ) 、中等密度脂蛋白( i n t e r m e d i a t ed e n s i t yl i p o p r o t e i n ，i d l )和部分高密度脂蛋白( h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，h d l ) 及其残粒中，一部分a p o e 在血液中与a p o a i i 形成复合体。随后t a y l o r 建立了a p o e的e d n a 序列。重组a p o e 蛋白先后在真核细胞和原核细胞中得到了表达，对其结构与功能进行了多方面的研究嘶删。细胞表达的a p o e 是一种糖蛋白，但在血浆中发现的a p o e 蛋白却是去糖基化的，a p o e 蛋白的糖基化功能不详，以前研究其它糖蛋白的n 连接和0 连接糖基化在决定胞内分选定位、胞内稳定性、血浆中蛋白清除及生物功能中发挥重要作用，研究发现未糖基化及脱唾液酸的a p o e 与培养的表皮成纤维细胞的l d l 受体具有相同的亲和力。“。a p o e 是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体1 ，即a p o e 。、a p o e s 和a p o e t 。各种a p o e 异构体的主要区别是氨基酸一级结构的不同，这涉及到半胱氨酸( c y s ) 和精氨酸( a r g ) 的交换：a p o e 。含一个c y s ( 第1 1 2 位) ：a p o e 4 不含c y s ，但比a p o e 。多一个a r g ( 第1 1 2 位) ：a p o e 。含2 个c y s ，但比a p o e 。少一个a r g ( 第1 5 8 位) 啪1 。这三种异构体由于氨基酸的替换产生了电荷的差异，a p o e 。具有二个中性的半胱氨酸，a p o e 。有一个半胱氨酸，a p o e 。则没有，a p o e 。中的g l u 。与a r g m 形成盐桥，因而它们的净电荷分别为o ，+ l ，+ 2 。异构体的电荷差异可用等电聚焦技术对基因表型进行分析”“。a p o e 蛋白结构高度螺旋，既亲水又亲脂。“，它的二级结构已基本确定如图2 示。据推算和测定，在介质中a p o e 有6 2 的a 一螺旋，9 的0 一片层，11 的b 一转角和1 8 无规则卷曲”“，这种结构在去垢剂或脂类环境中仅有极微小的变化，是比较稳定的。对a p o e 三级结构也有部分了解，同其他载脂蛋白( 如a i 、a i i 、c i i ) 相比，a p o e 有易变的、松散的、折迭三级结构，如图3 示。圈2 撬脂蛋白e 的二缓结构图3 载脂蛋白e 三级结构a p o e 蛋白分子具有几个功能域：受体功能域，肝素结合功能域，脂质和脂蛋白结合域。“，如图4 示。其分子可以被凝血酶水解为两个区域”4 。”1 ，即n 端区( 1 - 1 9 1 ) 和c 端区( 2 1 6 - 2 9 9 ) ，其间由一绞链区( 1 6 5 2 1 5 ) 连接“。a p o ec 端的稳定区可能是主要的脂蛋白脂类结合区，此区没有与l d l 受体结合的活性”。而n 端区具有很强的与l d l受体结合的能力。c 端区( 2 1 6 2 9 9 ) 分子量为l o k d a ，螺旋程度很高，不稳定。“，是脂蛋白的结合区。脂类和脂蛋白的结合区位于2 4 4 - - 2 9 9 位残基域。“，脂质的结合能诱发a p o e 构象发生变化。用截去了末端的变异体及合成多肽片段进行a p o ec 端的检测表明，1 9 1 残基以外至c 端存在三个螺旋，其中两个为a 型( 2 0 3 2 2 3 和2 2 5 2 6 6 ) ，第三个( 2 6 8 2 8 9 ) 为g 型螺旋。与脂类或不同的脂质微粒或二甲基磷脂酰胆碱( d i m y r i s t o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，d m p c ) 结合表明，g 螺