罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取及其功能特性的研究优秀毕业论文.pdf

中国海洋大学 硕士学位论文 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取及其功能特性的研究 姓名：曾少葵 申请学位级别：硕士 专业：食品工程 指导教师：林洪 20070601 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 摘要 罗非鱼是我国目前养殖量最大的淡水鱼，加工过程留下大量的下脚料鱼 头、鱼骨、鱼皮等，其中鱼皮占了相当大的比倒。本研究以罗非鱼鱼皮为原料， 分析测定其中的胶原蛋白含量，并在低温条件下利用酸溶解方法或酶促酸溶解方 法提取可溶性胶原蛋白( a s c 、p s c ) ，然而对其物理化学性质及功能特性进行初 步研究。实验结果表明：罗非鱼皮中的租蛋白含量高达3 3 1 4 ( 以湿基计) ，胶 原蛋白含量为2 7 8 ，约占其粗蛋白含量的9 3 9 ，说明罗非鱼鱼皮中含有丰富 的胶原蛋白，是提取可溶性胶原蛋白既丰富又经济的原料；罗非鱼鱼皮经 0 1 m o l l n a o h 溶液浸泡除去其中的非胶原蛋白，用1 0 9 6 ( v v ) 正丁醇除去脂肪后， a s c 和p s c 的提取得率分别为3 9 4 和4 4 6 ( 以干基计) ，说明鱼皮中的胶原蛋 白不能完全溶于0 5 m o l lh a c 溶液：p s c 得率仅略高于a s c ，可见，构成罗非鱼皮 胶原蛋白的主要是能溶于酸的单体胶原蛋白分子；a s c 、p s c 的氨基酸组成极其 相似，甘氨酸含量分别占总氨基酸残基的3 5 6 和3 3 8 ，每1 0 0 0 总氨基酸残基 中亚氨基酸一脯氨酸和羟脯氨酸分别为2 1 0 和2 1 7 ； a s c 在2 2 0 h m 、p s c 在 2 2 2 m n 处各有一强吸收峰，符合i 型胶原蛋白光吸收特征；差示扫描量热 ( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t e r ) ( d s c ) 曲线反映a s c 、p s c 的最大变性 温度厅为3 1 9 7 ，比小牛皮i 型胶原蛋白标准低1 0 多；而对a s c 、p s c 的溶 解性能分析可知，p h 及盐浓度对两者的溶解性影响较大，分别在p h 3 、p h 4 的溶 解度最大，分别为0 7 5 r a g m 和0 7 8 m g m l ；在p h7 时a s c 、p s c 溶解度最小； a s c 在盐浓度大于2 ( w v ) 时溶解度迅速下降，3 ( w v ) 时p s c 的溶解度迅速 下降，当n a c i 浓度大于2 ( w v ) 时，p s c 的溶解性优于a s c ，这说明在酸性及 低盐浓度的环境应用a s c 、p s c 更为方便；c m 一5 2 分离a s c 、p s c 的效果优于 d e a e 一5 2 ，洗脱蓝线显示有2 个吸收峰，表明a s c 、p s c 均由2 条n 链组成；对 a s c 功能特性研究表明：a s c 具有较好吸收性，在3 2 4 c ，9 0 的相对湿度下的 吸水能力为0 1 8 ( g g ) ，较酪蛋白好；保水性在t = 4 0 c ，r h = 5 4 条件下，实验开 始的前4 0 r a i n ，a s c 的水分残存率与保水性很强的保水剂丙三醇基本持平，显示 出较强的保湿效果；吸油性高达1 8 3 5m l g ，高于其他蛋白质类制品；浓度 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 为0 0 3 、p h 3 o - 3 5 的a s c 起泡性高达1 2 8 ，泡沫稳定性良好；乳化性为 9 3 ，放置4 h 后仍能保持5 0 以上的乳化性，可见其乳化稳定性良好。这些功 能特性有利于a s c 作为基料或乳化剂、保湿剂应用于保健食品加工及化妆 品生产中。 关键词：酸溶胶原蛋白、酶促酸溶胶原蛋白、氨基酸组成、理化性质、功能特性 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 s t u d yo ni s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f c o l l a g e n s a b s t r a c t t h eo u t p u to fo r e o c h r o m i sn i l o t i c u s o c c u p i e sf i r s tp l a c ei nf r e s h w a t e rf i s h d u r i n gp r o c e s s i n gs l i c e dt i l a p i a ，g r e a tq u a n t i t i e so f t h eb y p r o d u c ts u c ha ss k i n ，b o n e s a n df i n sa r ep r o d u c e d a m o n gt h e s ew a s t e s ，m o s ti ss k i l lt h e r e f o r e ，t h i st h e s i ss t u d i e s o ni s o l a t i o nc o l l a g e n sf r o mt h es k i no f t i l a p i aa n dt h e i rc h a r a c t e r i z a t i o na r ea n a l y z e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec r u d ep r o t e i na n dc o l l a g e nc o n t e n to f t h es k i no f f i l a p i a w h i c hi so b t a i n e df r o m f i s h - p r o c e s s i n gf a c t o r y a r c u p t o3 3 1 4 a n d 2 7 8 r e s p e c t i v e l y , o nt h eb a s i so f w e tw e i g h t t h ec o n t e n to f c o l l a g e na c c o u n ta b o u t 8 3 9 o ft h ec r u d ep r o t e i n a f t e rr e m o v i n gn o n c o l l a g e n o u sp r o t e i n sw i t ho 1 m o l l n a o ha n df a t 诵ml o ( v v ) b u t y la l c o h 0 1 t h ey i e l d so f a s ca n dp s ca l e3 9 4 a n d4 4 6 r e s p e c t i v e l y , o nt h eb a s i so fd r yw e i g h t t h i ss h o w st h a tc o l l a g e ni nt h e s k i nc o u l dn o ts o l v ec o m p l e t e l yi na c i d a tt h es a n l et i m e , t h ey i e l do f p s cw f l ss l i g h t h i g h e rt h a nt h a to fa s c t h e r e f o r e m o s tc o l l a g e ni nt h es k i ni sm o n c o l l a g e n 弧e a v ( t i n ( 3a c i dc o m n o g i t i c mo fa s ca n dp s ca r es i m i l a r a s ca n dp s ca r er i c h i n g l y c i n e ( 3 5 6 a n d3 3 8 ) ，t h ea m o u n t so fi m i n oa c i d s ，p r o l i n ea n dh y d r o x y p r o l i n e i n a s c a n d p s c a r e 2 1 0 和2 1 7r e s i d u e s p e r l 0 0 0r e s i d u e s r e s p e c t i v e l y t h ed i s t i n c t a b s o r p t i o na r eo b t a i n e da t2 2 0u ma n d2 2 2 n m ；r e s p e c t i v e l y t h i sr e s u l t i si n a c c o r d a n c ew i t ht h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h et y p ei a s ca n dp s cs h o wt r a n s i t i o n c u r v e sw i t hm a x i m u mt e m p e r a t u r e s ( 茹o f31 9 t ci no 0 5 ma c e t i ca c i d ，w h i c hi s l o w e r10 t h a nt h a to fc a l fs k i nc o l l a g e n m a x i m u ms o l u b i l i t yi no 5 ma c e t i ca c i di s o b s e r v e d ( o 7 5 m g m la n do 7 8 m g m l ) a tp h3a n dp h4f u ra s ca n dp s c ， r e s p e c t i v e l y s o l u b i l i t yr e a c h e st h em i n i m u mw h e nt h ep hi s7 as h a r pd e c r e a s ei n s o l u b i l i t yi so b s e r v e di nt h ep r e s e n c eo f n a c l a b o v e2 a n d3 ( w v ) f u ra s ca n d p s c ，r e s p e c t i v e l y c m - 5 2c o l u m nc h r o m a t o g r a mo fd e n a t u r e da s ca n dp s cf r o m t i l a p i as k i ns h o wt h a ta s ca n dp s cc o n s i s to ft w oc tc h a i n s s o m em a j o rf u n c t i o n a l p r o p e r t i e so fa s cf r o mt h es k i no ft i l a p i aa r ed e t e r m i n e d i ti sf o u n dt h a tt h ew a t e r 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 a b s o r p t i o ni sh i g hu pt oo 1 8 ( g g ) a tt e m p e r a t u r e3 2 4 c a n dr e l a t i v em o i s t u r e 9 0 , w h i c hi s b e t t e rt h a nt h a to fc a s e i n w e t l a b i l i t ya n do i l a b s o r p t i o n a n d e m u l s i f i c a t i o na n df o a mf o r m i n ga n df o a mk e e p i n go f a s ca r eg o o d k e yw o r d s ：a c i d - s o l u b i l i z e dc o l l a g e n ，p e p s i n - s o l u b i l i z e dc o l l a g e n ，a m i n oa c i d c o m p o s i t i o n ，p h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c ，f u n c t i o n a lp r o p e r t y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：、鬻节奏签字日期：工呻年f 月雳日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：、曹填 签字日期：二砷年月日 工作单位：穸尔硇泻犬滔 通讯地址：许啦讳羚i 6 ( 异猕p 导师繇舯 签字日期：。7 年钐月矿日 电话；。1 s ：3 彤二7 邮编歹降， 罗非鱼鱼皮较原蛋白的提取其及功能特性的研究 o 绪论 胶原蛋白( c o l l e g a n ) 是由动物的成纤细胞合成的一种生物高分子，是一种 白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质，它主要存在于脊椎动物和无脊椎动物支 持结构如皮肤，筋腱、软骨、骨骼及其它结缔组织中，是哺乳动物体内含量最丰 富、分布最广的一种蛋白质，约占哺乳动物总蛋白的1 3 。胶原蛋白在各种组织 中的含量多少与动物种类、个体年龄大小及组织部位有关。 随着分子生物学、材料应用学等学科的迅速发展，如何从不同的生物组织提 取胶原蛋白并应用于生物、食品、医药及化妆品等领域，成为研究的热点之一。 0 1 胶原蛋白的结构及功能特性 迄今为止，已发现1 9 种以上氨基酸序列不同的胶原蛋白分子，这些胶原蛋 白分子不仅在氨基酸残基序列上差别很大，而且在形态结构、物理化学性质以及 生理功能也有很大的不同。生物体内晟常见的是i 型、型和犁胶原蛋白， 这三种类型约占其总胶原蛋白的8 0 9 0 9 6 ，皮肤及骨组织存在的主要是l 型胶 原。i 型胶原蛋白的一级结构为n 链内特定的氨基酸组成结构单位为甘氨酸脯 氨酸_ x ，x 通常是羟脯氨酸。分子结构呈圆棒状，长z 线2 8 0 0 a ，直径约1 5 a ，相对 分子质量略少于3 0 0 ，0 0 0 0 d a ，每一分子由三条肽链组成，两条a ( i ) 链，一条 a ( 1 1 ) 链，a ( i ) 链与a ( 1 1 ) 链问只是在氨基酸连接顺序i ：存在微小差异， 两条n 链形成的二聚体叫b 一肽链，三条肽链叫y 一肽链，组成胶原分子三连螺 旋体的三条链的长度是相等的，每条链的分子量约9 5 ，0 0 0d a 。胶原分子间依靠 氢键、离子键和疏水基的作用而形成稳定的空间结构。 有研究表明，胶原蛋白不溶于水，但可在稀酸中发生溶胀而形成胶体，其溶 解性大小主要取决于其交联的程度、赖氨酸的含量及特异性非胶原蛋白的存在。 般的蛋白酶很难水解打开其三条链，只有在特异性胶原酶和特殊条件下才能水 解。由于胶原蛋白结构的特殊性，使得其不仅具有其它合成高分子不可比拟的生 物相容性、低抗原性和生物降解性“1 。生物相容性指的足。由于胶原分子特有的 三股螺旋结构及其交联形成的纤维或网络构成细胞重要组成成分，故胶原材料无 论是在被吸收前作为形成新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主，成为宿主组 织的一部分，都与细胞i l 毒| 围的基质有着良好的相互作用，表现出相互影响协调性， 并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分；低抗原性是由于其抗原决定簇主 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 要存在于胶原分子两端的非螺旋区，酶解法提取胶原过程中选择性地切除分子两 端的非螺旋区，使胶原的抗原性进一步降低。生物降解性即在胶原酶的作用下， 胶原的肽键将被水解而逐渐打断，胶原肽链的断裂随即造成螺旋结构的破坏，致 使胶原被蛋白酶彻底水解。 o 2 胶原蛋白功能研究现状 随着生物化学的发展，人们对胶原蛋白的认识逐渐深入，现在已经肯定胶原 蛋白和免疫球蛋白一样，富有多样性和组织分布的特异性，是与各组织上、器官 机能有关的功能性蛋白质。王学川等。1 介绍了胶原蛋白的研究进展及在化妆品中 的应用，李国英、沈洪兴等报道认为，i 型胶原蛋自的主要功能是维持皮肤和组 织器官的形态和结构，也是修复各类损伤组织的重要组织材料，例如，在骨损伤 修复中起直接作用的主要是i 型胶原蛋白，对成骨细胞的粘附和分化起促进作 用；张法浩等”1 认为i 型胶原蛋白可调节磷酸钙矿化过程中的晶体生长。另外， d g o p i n a t h 等”1 研究研究认为，胶原具有很强的生物活性及生物功能，能参与细 胞的迁移、分化和增殖，使骨腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度。又因其弱的 抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、硬组织修复、 创伤止血等医药卫生领域用途广泛”。除此之外，在食品领域，由于胶原蛋白组 成中含有多种氨基酸，又易于人体消化吸收，一直受到的营养保健专家的关注， 国外a k k a s i tj o n g j a r e o n r a k 等“”利用红鳍鲷和大眼鲷鱼皮明胶制备可食膜的研 究，国内王映红，杨意等“”也对胶原制备可食膜的结构及功能进行了研究。目 前已有利用胶原制成肠衣或作为食品粘合剂合成纤维膜的专利，用作肉类、鱼类 等食品包装纸；陈秀金等“”报道，可用胶原制成补钙的保健食品。 近年来，由于疯牛病及口蹄疫对人类健康的影响，哺乳动物胶原蛋白在功能 性食品、化妆品及药用产品的应用受到限制，人们开始寻求从水产动物如鱼类组 织中提取胶原蛋白。水产动物皮中胶原蛋白的利用一直是空白，水产动物胶原与 猪等陆生动物胶原蛋白相比，胶原蛋白的特性、组成及溶液性质都存在显著不同“”。 目前，国外学者对鱼类胶原蛋白的研究主要是针对海洋鱼类进行居多，有 t a k e s h in a g a i 等“”从鲣鱼( k a t s u w o n u sp e l a m i s ) 、日本锯鲻( l a t e o a b r a x j a p o n i c u s ) 等鱼加工的废弃物鱼皮、鱼骨及鱼鳍中提取胶原蛋；t o s h i y u k i i k o m a 等“”研究了从海水鱼真鲷( p a g r u sm a j o r ) 和淡水鱼尼罗罗非鱼 2 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 ( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) 鱼鳞提取的l 型胶原蛋白的物理性质；s h o s h im i z u t a 等“”测定了红鳍东方纯( t a k i f u g ur u b r i p e s ) i 型胶原蛋白生物化学和免疫化 学特性；c r i g o 等“”对墨鱼( s e p i a o f t ，i c i n a l i s ) 软骨胶原蛋白的进行了电泳 及免疫实验，证实墨鱼软骨中存在着各种类型的胶原蛋白。韩国y o n j i nj e o n 等人采用复合酶水解技术和膜分离技术从鳕鱼( 6 a d u s m a r h u a ) 鱼排中分离出 分子量为3 0 k d a 、i o k d a 、5 k i ) a 和3 k d a 的四种肽，并证实它们具有良好的乳化性、 抗氧化性和血管紧张素转换酶( a c e ) 抑制活性；h e e g u kb y u n 等人采用复 合酶水解的方法从阿拉斯加雪鱼皮中得到了具有血管紧张素转换酶( a c e ) 抑制 作用的g l y p r o l e u 和g l y p r o m e t 三肽2 种，其i c 5 0 分别为2 6 u m 和1 7 1 3i lm 。国内有傅燕凤等”利用淡水鱼鲢鱼( t t y p o p h t h a j m i c h t h y s m o l i t r i x ) 、鳙( m i s t i c h t h y sn o b i l i s ) 、草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 鱼皮提取胶原蛋白；陈申如等”对多种鱼皮胶原蛋白进行了纯化及酶解性质研 究，陈胜军等对罗非鱼鱼皮酶解液降血压活性进行了研究；刘庆慧等研究了 鱼鳞胶原蛋白对动物的有关生理功能，实验结果表明其提取的鱼鳞胶原蛋白能有 效防止实验性高胆固醇症的形成，并且具有明显的抗衰老作用；戴岚等报道了 金目鲷鱼皮胶原蛋白作为化妆品新原料的开发及其特性。 o 3 本课题的目的与意义 罗非鱼( o r e o c h r o m i sn i j o t i c u s ) 是继对虾养殖后的第二大养殖水产品。 据最新的f a o 统计，全球罗非鱼总产量达1 8 2 万t ，预计到2 0 1 0 年，全球各种 罗非鱼产量可达2 5 0 万t ，总产值将达到3 0 亿美元恤1 。我国罗非鱼的引种始于 1 9 7 3 年，最早引进的是红罗非鱼，目前主要生产的种类有尼罗罗非鱼、红罗非 鱼、白罗非鱼等。目前，我国已成为世界上罗非鱼养殖产量最大的国家，2 0 0 4 年罗非鱼总产量达8 9 8 万吨，约占全球总量的4 5 ；2 0 0 5 年总产量达1 0 4 万t ， 养殖地主要集中在广东、广西、海南三省，其中广东罗非鱼产量约占全国总产量 的4 9 0 , 6 ，湛江和茂名两市是其主要产地。随着养殖业的迅猛发展，罗非鱼加工 企业也不断增加；在不到5 年的时间内，全国就建起了罗非鱼加工工厂3 0 多家， 年加工生产能力超过5 0 万t 原料鱼。随着出口的强势增长，越来越多的经营企 业开始经营罗非鱼及其加工产品的出口，2 0 0 0 年经营罗非鱼出口并在欧美注册 的企业不足1 0 家，到目前已有3 0 多家汹1 ，而广东省罗非鱼对美出口量己占全国 罗非鱼鱼皮腔原蛋白的提取其及功能特性的研究 罗非鱼对美出口总量的近八成，成为我国对美出口罗非鱼最大的供应基地，到 2 0 0 5 年，广东省年出口量在9 0 0 0 吨以上的企业就有3 家”1 。然而，目前我国罗 非鱼产业化仍面临许多问题，其中出口产品单一，缺乏品牌优势成为主要制约因 素。我国出口的罗非鱼以冻原条鱼为主，且规格偏小，鲜鱼片及冻鱼片出口量不 大，附加值不是很高。从2 0 0 5 年开始，这种状况有怕改善，冻鱼片产品逐渐成 为罗非鱼消费产品的主流，美国消费罗非鱼冻鱼片的比例从2 0 0 1 年的1 3 ，提 高到2 0 0 5 年的4 1 2 。据统计，企业在加工冻罗非鱼片时，出肉率不到4 0 ，约 每加工1 t 罗非鱼片，大约要产生2 t 的下脚料，留下大量的鱼皮、鱼头、鱼鳞及 鱼骨等废弃物。因此，如何合理、有效的利用这些废弃物，开发出具有营养和保 健功能的罗非鱼副产品，降低企业的生产成本，成为一个急需解决的问题。 罗非鱼加工废弃物中，很大一部分是鱼皮，鱼皮中的主要成分为胶原蛋白( 8 0 9 6 ) 以上，可利用其加工成保健食品，也可采用酸法或胃蛋自酶促溶方法对胶原 进行局部水解，以便获得酸溶胶原蛋白( a s c ) 和酶促酸溶胶原蛋白( p s c ) ，更方 便地应用于医药材料及化妆品领域。1 蜘。因此，有效利用罗非鱼加工废弃物中鱼 皮的胶原蛋白，具有重要意义。一方面不仅可达到变废为宝的目的，还可降低罗 非鱼加工企业的生产成本，同时又能进一步促进水产养殖业的可持续发展，产生 巨大的社会效益和经济效益。另一方面，随着人们生活水平的提高，饮食结构由 温饱转向营养及保健方向发展，对具有保健功能食品的需求会越来越多，鱼类胶 原蛋自由于其来源的安全性有良好的保障，一定会有电好的开发利用前景。 0 4 本研究的主要内容 基于上述思考，本研究以罗非鱼加工企业的废弃物鱼皮为原料，进行一 系列研究： 第一章：分析罗非鱼皮的原料特性并提取胶原蛋白。分析鱼皮的基本营养成 分及胶原蛋白含量，并对其氨基酸组成进行讨论。有研究资料表明，只有胶原才 具有生物活性，因而比明胶和水解胶原蛋白更有应用前途。因此本章利用罗非鱼 皮为原料，在低温条件下利用酸溶解方法及酶促酸溶解方法，提取可溶性胶原蛋 白( a s c 、p s c ) 。 第二章；a s c 、p s c 理化性质的研究。对提取得到的酸溶胶原蛋自样品通过氨 基酸分析法、紫外吸收光谱法进行鉴定，判断其所属类型，另外探讨它们的溶解 4 罗菲鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 性能、蛋白质热变性温度等理化性质。 第三章：离子交换柱层析分离纯化a s c 、p s c 。在胶原的应用过程中，有的是 胶原纤维网，有的是胶原水解混合物，有的是提纯的胶原蛋白。根据对皮胶原蛋 白水解程度的不同，其中所含的分子量的大小、分布会有所不同，只有通过对这 些蛋白质分子进行分离、纯化和制备，获得一定质和量的纯品，才能满足结构特 性的测定和应用的要求。 第四章：罗非鱼皮胶原蛋白功能特性研究。主要是对a s c 的吸水性、保湿性、 吸油性、起泡性及乳化性等功能特性进行初步的探讨，以此分析其作为食品添加 剂或化妆品的保湿剂、乳化剂应用的可能性。 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 1罗非鱼鱼皮的原料特性及胶原蛋白的提取 如前所述，罗非鱼经放血后剖腹、机械去皮、切片加工成冷冻鱼片。这过程 产生大量的下脚料鱼头、鱼排及鱼皮等，其中鱼皮占了相当大的比例。一直 以来，这些鱼皮多数被加工企业作为饲料廉价出售，其中含量丰富的蛋白质资源 未能得到充分利用，造成资源的极大浪费，增加了企业的生产成本。 有研究表明，鱼皮主要成分是胶原蛋白，其含量比鱼体的其它部位高出许多， 是提取胶原蛋白潜在的经济原料。本章选用罗非鱼加工企业生产冻鱼片的下脚料 鱼皮为原料，分析其基本营养成分、氨基酸组成及胶原蛋白含量，以便了解 其营养特性，为更加合理地利用提供参考依据。同时，在低温条件下，利用酸或 酸加胃蛋白酶水解的方法提取酸溶胶原蛋白( a s c ) 和酶促酸溶胶原蛋白( p s c ) ， 旨在为罗非鱼皮的综合利用提供基础数据。 1 1 实验材料、试剂与仪器 1 1 1实验材料 新鲜的罗非鱼鱼皮：由湛江环球水产有限公司提供，经手工去除鱼鳞、清洗 沥干后，分装、冷冻在一2 5 冰箱中备用。 1 1 2试剂 1 1 2 1 试剂 羟脯氨酸标准品s i g m a 公司 胃蛋白酶：l ：1 0 0 0 0 ，u s a ，s i g m a 化学公司进口分装 氯胺t国药集团化学试剂有限公司 对二甲氨基苯甲醛国药集团化学试剂有限公司 高氯酸广州化学试剂厂 柠檬酸广州化学试剂厂 氯化亚锡广州化学试剂厂 其余所用化学试剂均为分析纯。 1 1 2 2 试剂的配制 ( 1 ) 羟脯氨酸标准储备液( 5 0 0 i lg ：m l ) ：称取5 0 o m g 羟脯氨酸，用少量 6 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 蒸馏水溶解，加一滴6 m o l l 盐酸，定容n i o om l 容量瓶中。 ( 2 ) 羟脯氨酸标准工作液( 51 1g m l ) ：吸取标准标准储备液5 o o m l 于容量 瓶中，定容。 ( 3 ) 缓冲液：将5 0 9 柠檬酸、2 6 3 9 氢氧化钠和1 4 6 1 9 结晶乙酸钠溶于水， 稀至1 l ，此溶液与2 0 0 m e 水和3 0 0 r a l 正丙醇混合。 ( 4 ) 显色剂：称取l o g 对二甲氨基苯甲醛，用3 5 m l 高氯酸溶解，缓慢加入6 5 m l 异丙酵。 1 1 3仪器与设备 1 0 1 a 一2 型电热鼓风干燥箱上海浦东跃欣科学仪器厂 8 3 5 5 0 型氨基酸自动分析仪 日本日立公司 u v 一7 5 6 m c 紫外可见分光光度计日本岛津公司 j j 一2 组织捣碎匀浆机金檀市宏华仪器厂 c r 2 2 g 高速冷冻离心机日本日立公司 a l p h a l 2 型冷冻干燥机德国c h r i s t 公司 1 2实验方法 1 。2 1 基本营养成分的测定 水分，常压干燥法m ，；灰分，5 5 0 灰化涮“j 粗脂肪：索氏提法1 ； 粗蛋白：半微量凯氏定氮法”；总糖：葸酮比色法1 。 1 2 2 鱼皮蛋白质的氨基酸组成分析 样品经6 m o l l 的h c l 水解2 4 h ，采用日立8 3 5 - 5 0 型高速氨基酸分析仪分析1 7 种 氨基酸1 ，另取样壅z 2 5 m o l l 的n a o h 水解后，采用同机测定色氨酸含量。 分析条件： 离子交换柱：2 6 x1 5 0 n h n 。 交换树脂型号：n q 2 6 1 9 ( 5 2 0 5 1 ) 。 柱温：5 3 。 泵流速：0 2 2 5 m l 讥in 。 泵压力：8 8 m p a 。 洗脱液：i p h l 、2 、3 、4 。 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 分析时间：7 2 m i n 。 进样量5 0 ul 。 1 2 3 鱼皮胶原蛋白含量的测定 羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，通过测定鱼皮中羟脯氨酸的含量，再乘 以相应的系数就可以得到胶原蛋白的含量。鱼皮中羟脯氨酸含量采用分光光度 比色法测定。 1 2 。3 1 标准曲线 分别吸取羟脯氨酸标准工作液0 0 0 ，1 0 0 0 ，2 0 0 0 ，3 0 0 0 ，4 0 o o m l ，分别置于 l o o m l 容量瓶中，定容摇匀，浓度分别为0 0 0 ，0 5 0 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0 肛g m l 。取不 同浓度的上述溶液4 o o m l ，分别加入2 0 l 具塞试管中，加氯胺t 溶液2 m l ，摇匀后于 室温放置2 0 r a i n 。加入显色剂2 m l ，摇匀，塞上塞子，置于6 0 c 恒温水浴中保温2 0 r a i n 后取出，迅速冷却。在波长5 6 0 h m 处测定吸光值o d ，以羟脯氨酸的含量为横坐标， 吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图1 1 。 o 3 5 e 0 3 0 。0 2 5 ：0 2 0 鲁0 1 5 窭o 1 0 昏0 0 5 o o o 024681 0 羟脯氨酸含量( 1 l g m l ) 图1 1 羟脯氨酸标准曲线 f i g 1 1s t a n d a r dc u r v eo fh y d r o x y p r o l i n e 1 2 3 2 样品处理 ( 1 ) 回流处理： 8 罗非鱼鱼皮胶原蛋自的提取其及功能特性的研究 称取罗非鱼鱼皮1 o g ( 精确至0 0 0 1 9 ) 放入2 5 0 m l 锥形瓶中，注意不要使样 品粘在壁上。加几粒沸石，再加入氯化亚锡溶液l o o m l ，置于水浴上加热回流8 h ， 趁热将水解溶液过滤于2 0 0 r a l 容量瓶中，并用6m o l l 热盐酸l o m l 反复三次冲洗 锥形瓶和滤纸，冷却，用去离子水定容到刻度，混匀。 吸取5 o o m l 水解液于1 0 0 m l 烧杯中，用l o m o l l 、1m o l l 氢氧化钠溶液调 节p h 为8 0 2 ，过滤于2 5 0 r a l 容量瓶中，用去离子水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化 亚锡沉淀，反复三次，把洗液并入滤液中，以水洗至刻度，摇匀备用。 ( 2 ) 羟脯氨酸含量测定 从容量瓶中吸取4 o o m l 样液于2 0 m l 带塞的试管中，加氯胺t 溶液2 m l ，摇匀 后于室温放置2 0 r a i n 。加入显色剂2 m l ，摇匀，塞上塞子，置于6 0 恒温水浴中保温 2 0 r a i n 后取出，迅速冷却。在波长5 6 0 h m 处测定吸光值，同时作空白对照。根据羟脯 氨酸标准曲线，计算罗非鱼皮羟脯氨酸含量。 1 2 4 胶原蛋白的提取 所有提取胶原蛋白( a s c 、p s c ) 的实验操作均在4 c 条件下进行。 1 2 4 1 非胶原蛋白的去除 将罗非鱼鱼皮半解冻后，剪成0 5 0 5 的碎片，用组织捣碎机捣约3 m i n ， 清洗沥干后，用0 1 m o l ln a o h 溶液浸泡( 鱼皮与溶液的质量比例为l ：3 0 ) l 2 d ，每4 8 h 更换一次浸泡液，然后用蒸馏水洗涤至中性，沥干。 1 2 4 2 脂肪的去除 经1 2 4 1 处理的鱼皮用l o ( v v ) 正丁醇溶液浸泡1d ，鱼皮与溶液的比例 为1 ：3 0 ( w v ) ，然后用蒸馏水洗涤至中性，沥干。 1 2 4 3 酸溶胶原蛋白( a s c ) 的提取 经1 2 4 1 、1 2 4 2 处理的罗非鱼鱼皮用0 5 m o l l h a c 溶液( 鱼皮与溶液 的比例为1 ：5 0 ( w v ) 浸提3d ，期间需不时搅拌。然后将酸浸液在高速冷冻离心 机离心3 0 m i n ( 4 ，2 1 2 0 0 x g ) ，取上层粘液。残渣再用适量0 5 m o l lh a c 溶 液浸提2 d ，在同样的条件下进行离心，取上层粘稠液，将2 次所得的粘液合并， 添加研磨细的固体n a c l ，直到最终浓度为0 9 m ，放置过夜，形成絮状沉淀。然 后离，i f , ( 2 1 2 0 0 g ，4 ，3 0 m i n ) ，收集沉淀物。沉淀物用0 5m o l lh a c 溶液 溶解，然后对0 1 m o l lh a c 溶液透析2 4 h ，每4 h 更换一次透析液，以便除去1 2 k d a 以下的小分子物质。随后更换蒸馏水透析至中性，用10 9 6 硝酸银溶液检验氯离子 9 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 的存在，直到透析液中没有白色沉淀产生为透析完全将透析液进行冷冻干燥， 即得酸溶胶原蛋白( a s c ) 。 1 2 4 4 酶促酸溶胶原蛋白的提取 经1 2 4 1 、1 2 4 2 处理的去除非胶原蛋白及脂肪的罗非鱼鱼皮用 0 5 m o lh a c 溶液按1 ：5 0 ( w v ) 比例浸提，另添加0 3 6 , v ) 的胃蛋自酶( 1 ： 1 0 0 0 0 ) ，浸提3 d ，期间不时搅拌。浸提液在4 c 以2 1 2 0 0 g ，离心3 0 r a i n ，取上 层粘稠液。为了终止胃蛋白酶反应，将上层粘稠液装入透析袋内用1 0 倍体积的 0 0 2t o o l l 磷酸盐缓冲液( 州7 2 ) 透析4 8 h ，每4h 更换透析液，同时除去1 2 k d a 以下的小分子物质。透析物经2 1 2 0 0 x g ，离心3 0 m i n ，得到絮片物，再用1 0 倍 体积的0 5 4 a c 溶液溶解，然后添加研磨细的固体n a c i 直到最终浓度为0 9 m ， 放置过夜，离心( 2 1 2 0 0 x g ，4 c ，3 0 r a i n ) ，取沉淀物，用0 5 i l 矗c 溶解后，再 对蒸馏水透析至中性，冷冻干燥，即得酶促酸溶胶原蛋白( p s c ) 。 1 3 结果与讨论 1 3 1 罗非鱼鱼皮基本成分 罗非鱼加工的下脚料鱼皮去鳞后，清洗、沥干，取样进行基本成分分析， 结果如表卜l 所示。 表i - i罗非鱼皮的一般营养成分 t a b 1 1n u t r i e n tc o n t e n t so ft h es k i no ft h e o c h r o m i sn i l o t i c u s ( ) 从上表可知，罗非鱼加工下脚料鱼皮中含有丰富的营养物质，其中粗蛋 白含量高达3 3 1 4 ( 以湿基计) ，均高于淡水鱼鲢鱼( h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ) ( 2 5 9 ) 、鳙( i r i s t i c h t h y s n o b j l s ) ( 2 3 6 ) 、草鱼( c e n o p h a r y n g o d o n i d r l l u s ) ( 2 9 8 ) 拉“，粗脂肪含量也比上述3 种淡水鱼鱼皮( 分别为0 7 2 、0 2 0 、0 7 5 ) 要高。这与罗非鱼皮的含永量较低有一定关系。可见，罗非鱼加工下脚料鱼 皮是较好的蛋白质来源原料。 1 3 2 罗菲鱼鱼皮蛋白质氨基酸组成 对新鲜罗非鱼鱼皮进行水解，然后利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含 1 0 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 量，其结果如表l 一2 所示。 表卜2 罗非鱼鱼皮蛋白质氨基酸组成 t a b l e l 一2 ：a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no ft h es k i no fo r e o c h r o m i sn i l o t i e u s 注： 为必需氟基酸 理想的蛋白质应满足必需氨基酸和非必需氨基酸之间平衡，支链氨基酸含量 丰富。f a 0 w h o 推荐的理想蛋白质模式认为，质量较好的蛋白质其氨基酸组成 e 从t 从在4 0 左右，e 从n e 从为0 6 0 以上。从表卜2 中可知，在组成罗非鱼 鱼皮蛋白质的氨基酸中，必需氨基酸占氨基酸总量的2 2 3 3 ，显然不是优质蛋 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 白质。与其他水产食品氨基酸组成相似悟“，鱼皮中色氨酸含量最低，为第一限 制氨基酸，胱氨酸在罗非鱼皮中也有一定含量。然而，罗非鱼皮含有极其丰富甘 氨酸、脯氨酸，其中甘氨酸含量最高，约占氨基酸总量的2 0 9 6 。这符合胶原蛋白 氨基酸组成特点。可见，组成罗非鱼鱼皮蛋白质的主要成分为胶原蛋白。 1 3 3 罗非鱼皮胶原蛋白含量 各种鱼皮中胶原蛋白的含量随着鱼的种类、年龄及捕获季节的不同而相关很 大“1 “。据报道，羟脯氨酸( h y p ) 和羟赖氨酸是胶原蛋白的特有组成成分“”1 ， 在其它非胶原蛋白中很少发现。通过测定罗非鱼鱼皮羟脯氨酸含量，乘以相应的 系数1 1 1 “时，即可计算出其胶原蛋白含量。比色法测定罗非鱼鱼羟脯氨酸的含量 为2 5 ，则胶原蛋白含量为2 7 8 9 6 。 从表卜1 知，鱼皮的粗蛋白含量为3 3 1 4 ，胶原蛋白占其粗蛋白含量的8 3 9 ， 与淡水鱼草鱼( 7 7 ) 、鲤鱼、鲫鱼含量相似。“删。作为生产罗非鱼片下脚料的 鱼皮是提取胶原蛋白既经济又丰富的原料。 1 3 4 罗非鱼皮a s c 和p s c 的提取得率 从罗非鱼鱼皮中提取a s c 和p s c 的得率分别为1 3 8 和1 5 6 ( 以湿基计) ，以 干基表示的a s c 和p s c 的得率分别3 9 4 和4 4 6 。 这表明罗非鱼鱼皮不能完全溶解于0 5 m o l lh a c 溶液。由此可知，罗非鱼鱼 皮中的胶原分子之间极有可能是以共价键缩合不同分子末端肽区的醛基，最终导 致其在弱酸溶液中的溶解性较低m “。与a k k a s i tj o n g j a r e o n r a k 等5 ”的研究结 果相比，a s c 缛率，罗非鱼鱼皮高于红鳍笛鲷( l u t j a n u sv i t t a ) 鱼皮( 9 9 6 ) ，略 低日本海狼鲈( l a t e o l a b r a x j a p o n y c u s ) 、日本鲐鱼( s c o m b e r j a p o n i c u s ) 及日本 鲨鱼( t t e t e r o d o n t u sj a p o n i c u s ) 鱼皮( 分别为5 1 4 ，4 9 8 和5 0 1 ，以干基计) 。 本试验中添加胃蛋白酶促溶提取的胶原蛋白( p s c ) 得率仅略高于a s c 的得率。 由此可知，罗非鱼鱼皮胶原蛋白主要是由能溶于酸的单体胶原蛋白分子。”构成， 添加胃蛋白酶对罗非鱼鱼皮胶蛋白分子问交联的破坏影响不大。 由于鱼皮的韧性很强，提取得率不仅与提取时间有关，鱼皮片状的大小也是 影响得率的一个因素。 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特忭的研究 1 4小结 从上分析可见，罗非鱼鱼皮中含有丰富的粗蛋白，其主要成分为胶原蛋白， 约占鱼皮粗蛋白的8 3 9 ，氨基酸组成中甘氦酸含量约占氨基酸总量的2 0 ，在低 温条件下提取酸溶胶原蛋白a s c 、p s c ，得率分别为3 9 4 和4 4 6 ，2 种方法的提 取得率相差不大。 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取其及功能特性的研究 2罗非鱼鱼皮胶原蛋白理化性质研究 胶原蛋白具有多样化和组织分布的特异性，现有发现了3 0 多种胶原蛋白链的 基因编码嘲。同时，不同鱼种或同种鱼生活在不同水域，其鱼皮胶原蛋白分子组 成、理化性质也会发生变化。迄今为止，有关罗非鱼鱼皮胶原蛋白的结构及性质 的研究还少有报道。因此，本章对从罗非鱼加工下脚料鱼皮中分离出酸溶胶 原蛋白( a s c ) 及酶促酸溶胶原蛋白( p s c ) 的理化性质进行分析研究，旨在为它 们在保健食品及化妆品等领域的应用提供基础数据。 2 1实验材料与仪器设备 2 1 1 材料与试剂 2 1 1 1 材料 f i