（分析化学专业论文）微流控芯片空间温度梯度毛细管电泳系统检测dna突变的研究.pdf

、 ，l1iii、 j 1 _ j ， at h e s i si n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y am i c r o f l u i d i cc h i p - - b a s e ds p a t i a lt e m p e r a t u r e g r a d i e n tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o r d n am u t a t i o nd e t e c t i o n b yl in a s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rx uz h a n g r u n n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j a n u a r y2 0 0 8 i r - - 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 ：芷 恳。 学位论文作者签名：季搠严 日 期：p 砌旱吱日p 口目 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： j 东北大学硕士学位论文摘要 微流控芯片空间温度梯度毛细管电泳系统检测 d n a 突变的研究 摘要 温度梯度毛细管电泳是近几年出现的一种新的基因突变检测方法，可在同一温 度梯度下，检测多个不同长度和不同突变的基因片断，是目前较为理想的突变检测 方法之一。本文提出了一种简单可靠、控制方便的空间温度梯度形成方法，采用芯 片温度梯度毛细管电泳技术对d n a 突变样品进行了检测。 论文第一章主要介绍了芯片毛细管电泳技术的特点、主要分离模式和进样方法， 并对毛细管电泳技术在d n a 突变检测中的应用以及温度梯度毛细管电泳的温度形 成方式进行了综述。 论文第二章建立了一种空间温度梯度芯片毛细管电泳d n a 突变样品分析系统。 制作了热阻呈梯度均匀变化的硅橡胶( p d m s ) 基片，利用热阻变化对热传导的影 响，在基片表面形成连续温度梯度，并考察了用该方法所形成的温度梯度的均匀性 与稳定性。将玻璃微流控芯片置于温度梯度加热器上，在芯片分离通道的长度方向 形成空间温度梯度，实现了芯片温度梯度毛细管电泳分离检测d n a 突变样品。选 用1 0 温度梯度条件，采用单因素法对电泳分离筛分介质的浓度、缓冲溶液的p h 值、分离电场强度等参数进行了优化。在选定的最佳实验条件下，d n a 突变标准样 品迁移时间r s d 为1 8 ( n = 7 ) ，理论塔板数为1 o 1 0 5 m ，单次样品分析时间为 8r a i n1 5s 。在9 5c m 长的分离通道上对2 0 9b p 的d n a 突变标准样品进行了检测， 成功检出了两例大肠癌患者的k r a s 基因突变。 论文第三章对本文建立的分析方法进行了总结，并对芯片温度梯度毛细管电泳 技术的发展进行了展望。 关键词：微流控芯片；毛细管电泳；温度梯度；基因突变 - i i l 0 东北大学硕士学位论文 a b s t r a c t am i c r o f l u i d i cc h i p - b a s e ds p a t i a lt e m p e r a t u r eg r a d i e n t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o rd n a m u t a t i o nd e t e c t i o n a bs t r a c t t e m p e r a t u r eg r a d i e n tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( t g c e ) i san e wm e t h o df o r s m d y i n gd n a m u t a t i o n s a tp r e s e n t ，i ti sa ni d e a lm e a n sw h i c hc a nd e t e c tg e n es e g m e n t s d i f f e r e n ti nl e n g t ha n dt y p e i nt h i sp a p e r , d n am u t a t i o ns a m p l e sw e r ed e t e c t e db y c h i p - b a s e dt g c e ，a n das i m p l e ，r e l i a b l e ，c o n v e n i e n ts p a t i a lt e m p e r a t u r eg r a d i e n ts y s t e m w a sd e v e l o p e d t h ef i r s tp a r to ft h ep a p e ri n t r o d u c e st h ec h a r a c t e r i s t i c s ，s e p a r a t em o d e sa n d i n j e c t i o nm e t h o d so fc h i p - b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，t h ea p p l i c a t i o no fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i si nd n am u t a t i o nd e t e c t i o na n df o r m a t i o nm e t h o d so ft e m p e r a t u r e g r a d i e n ti nt g c ew e r er e v i e w e d i nt h es e c o n dp a r t ，as p a t i a lt e m p e r a t u r eg r a d i e n tf o rd n am u t a t i o nd e t e c t i o no f c h i p - b a s e dt g c es y s t e mw a se s t a b l i s h e d p d m s ( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ) s l a bw i t ht h e t h e r m a lr e s i s t a n c ev a r y i n gi ng r a d i e n tw a sm a d e ，a n dc o n t i n u o u st e m p e r a t u r eg r a d i e n t w a sf o r m e do ns l a bu s i n gh e a te x c h a n g ew h i c hw a si n f l u e n c e db yv a r i e dt h e r m a l r e s i s t a n c e t h eu n i f o r m i t ya n ds t a b i l i z a t i o no ft h et e m p e r a t u r eg r a d i e n tw e r ei n v e s t i g a t e d g l a s sm i c r o f l u i d i ec h i pw a sp u to nt h et e m p e r a t u r eg r a d i e n th e a t e r ，a n dt h e ns p a t i a l t e m p e r a t u r eg r a d i e n tw a s f o r m e da l o n gt h ec h a n n e l w i t ht e m p e r a t u r eg r a d i e n to fio 。c ， t h ec o n c e n t r a t i o n so fs i e v i n gm a t r i x ，p ho fb u f f e ra n df i e l ds t r e n g t h sw e r eo p t i m i z e db y u n i v a r i a t em e t h o d u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，2 0 9b pd n am u t a t i o ns t a n d a r d s a m p l e sw e r es e p a r a t e dw i t hm i g r a t i o nt i m ep r e c i s i o no f1 8 r s d ( n = 7 ) ，p l a t en u m b e r o f1 0 xl0 m ，a n a l y t i c a lt i m eo f8r a i n15s k r a sg e n em u t a t i o n sf r o mt w op a t i e n t sw i t h l a r g ei n t e s t i n ec a n c e rw e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e d i nt h et h i r dp a r t ，t h ea n a l y t i c a lm e t h o de s t a b l i s h e di nt h i sp a p e rw a ss u m m e du p ， a n dt h ep r o s p e c to f c h i p b a s e dt g c et e c h n i q u e sw a sd e s c r i b e d i i i 一 ，：。，- 东北大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；t e m p e r a t u r eg r a d i e n t ；d n a m u t a t i o n i v 东北大学硕士学位论文 目 录 目录 独创性声明i 摘要i i a b s t r a c t i 第1 章绪论1 1 1 引言1 1 2 芯片毛细管电泳l 1 2 1 芯片毛细管电泳的特点2 1 2 2 芯片毛细管电泳的分离模式4 1 2 3 芯片毛细管电泳的进样5 1 3 基因突变检测。7 1 3 1 电泳技术在基因突变检测中的应用8 1 3 2 温度梯度的形成方式1 0 1 4 本论文工作目的及设计思想11 第2 章芯片温度梯度毛细管电泳系统用于d n a 突变检测的研 究1 3 2 1 引言13 2 2 实验部分1 4 2 2 1 仪器和装置1 4 2 2 2 试剂和材料1 6 2 2 3 玻璃微流控芯片的制作1 8 2 2 4p d m s 基片的制作1 9 2 2 5 测温方法19 2 2 6 芯片的微通道结构2 1 2 2 7 实验步骤2 2 2 2 8 温度梯度毛细管电泳的分离原理2 3 2 3 结果与讨论2 5 2 3 1 筛分介质的选择2 5 2 3 2 通道结构的设计2 5 v 东北大学硕士学位论文 目 录 2 3 3 温度梯度的设计”z o 2 3 4 实验参数的优化3 7 2 3 5 分析性能4 1 第3 章结论4 4 参考文献4 5 致谢5 1 v i 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 2 0 世纪9 0 年代初，m a n z 和w i d m e r 首次提出了微型全分析系统( m i n i a t u r i z e d t o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，p t a s ) 的概念。它是通过分析化学、微机电加工、电子学、 生物学、医学等多学科的交叉，将化学分析装置微型化与集成化，最大限度地把分 析实验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、混合、反应、分离、检测等集成到便 携的分析设备中，甚至是方寸大小的芯片上。当前，微型全分析系统的核心技术是 以微流控技术为基础的微流控芯片，微流控芯片在装置上的主要特征是其容纳流体 的有效结构( 包括通道、反应室和其它某些功能部件) 至少在一个维度上为微米级 尺度。由于尺度的变化，使分析设备体积减小，从而高效、快速地完成试样的采集、 分离及分析，因此具有广泛的适用性。 随着人类基因组计划的完成，人类进入后基因组时代。单核苷酸多态性分析、 基因表达分析、基因变异分析正日益为人们所关注。突变基因的大规模筛查和临床 诊断要求d n a 分析技术具有高通量、高速、高重现性的特点，由于微流控芯片本 身具有快速、高效、高通量、低试剂消耗、大规模平行处理能力等特点，使其可能 成为后基因组时代的支持性技术，为基因分析【2 , 3 , 4 】、蛋白质分析【5 ，6 1 、细胞分析【7 ，8 】、 临床分析 9 , 1 0 】等提供强有力的技术后盾。温度梯度毛细管电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，t g c e ) 是近几年出现的一种新的基因突变检测方法，它具 有高的分辨能力，并且重现性好、操作简便快速、可在同一温度梯度下检测多个不 同长度和不同突变的基因片段，是目前较为理想的突变检测方法之一。 本章主要论述与本文研究内容有关的微流控芯片毛细管电泳技术、以及芯片毛 细管电泳技术在d n a 突变分析检测中的发展现状。 1 2 芯片毛细管电泳 芯片毛细管电泳( c h i p - b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 是以电场作为驱动力，以微 流控芯片上的微通道作为分离通道，借助于离子或分子在电迁移或分配行为上的差 异，对复杂试样中的多种组分进行高速分离分析的技术【1 1 】。图1 1 为最简单的芯片毛 - 1 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 细管电泳分离分析系统示意图，以简单十字通道进样电泳分析为例，先在进样通道 ( 图1 1 中2 - 3 ) 施加电压，试样从2 经十字交叉口流向3 ；然后将电压切换到分离通 道( 图1 1 中l - - - 4 ) ，储存在十字交叉口处的一段试样溶液进入分离通道进行分离，组 分经过检测点时，记录电泳谱图。在微流控分析系统发展的前十多年中，芯片毛细 管电泳是发展最快的一个领域，它具有分析效率高、分离速度快、样品消耗少、体 积小、成本低、分析过程自动化等优点，在核酸分析、氨基酸与蛋白质分析、细胞 分离分析、药物分析、p c r 芯片等领域有广泛的应用前景i l2 。 m i c r o f l u i d i cc h i p 图1 1 芯片毛细管电泳装置示意图 m i c r o f l u i d i cc h i p ，微流控芯片；s e p a r a t i o nc h a n n e l ，分离通道；d e t e c t i o n ，检测；p o w e rs u p p l y ， 电源 f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h es e t u pf o rc h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 1 2 1 芯片毛细管电泳的特点 1 2 1 1 芯片毛细管电泳的优点 ( 1 ) 高速、高效：高速和高效是芯片毛细管电泳的两个重要特点。在毛细管电 泳的分离过程中，分离速度与分离场强的平方成正比，所以要进行快速分离就必须 施加高的场强，但是高场强会产生过多的焦耳热，影响分离效率。常规的圆形截面 石英毛细管，由于通道的面积一体积比小，外表又涂覆有聚酰亚胺涂层，这使电泳 时产生的焦耳热不能很快地向周围逸散，就难以通过进一步提高场强来提高分离速 度。然而，芯片微通道的截面呈长方形或梯形，通道的面积一体积比大，而玻璃芯 片具有较好的散热性能，电泳时产生的焦耳热能得到有效的散发。这样，就能采用 较高的场强对试样进行快速分离l l 引。同样，分离场强的大小直接决定分离效率的高 低，芯片毛细管电泳可以施加高场强，因此能实现高效分离。j a c o b s o n 等【1 4 】在芯片 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 毛细管电泳的分离通道中施加5 3k v c m 的场强，实现毫秒级以下的高速分离，在 o 8m s 的时间内，实现了对两种荧光染料罗丹明b 和二氯荧光素的基线分离。可见， 微流控芯片良好的散热性能，使其可以施加高分离场强，从而实现高速电泳分离。 ( 2 ) 高通量：芯片毛细管电泳具有高通量的特点是因为可以在小的芯片面积上 加工高密度的阵列分离通道。人类基因组测序计划提前完成，得益于阵列毛细管电 泳高通量的分离分析技术，常规毛细管阵列电泳系统可以达到9 6 个分离通道，但并 列的毛细管数越多，毛细管阵列的宽度就越大，在制作、分离、检测等方面就越困 难。芯片毛细管电泳避免了这个不足之处，可以在有限的面积上加工平行的阵列通 道【15 1 ，也可以加工辐射状的圆形阵列通道【16 1 ，实现高通量分析。m a t h i e s 研究组【1 7 】 在圆盘形芯片上加工了3 8 4 个分离通道，实现了更高通量的分离分析。 ( 3 ) 低消耗：微流控芯片尺寸的减小使材料的消耗变小，也使试样和试剂的消 耗量大大降低，芯片毛细管电泳的典型进样量在皮升至纳升级，既降低了分析费用 以及贵重的生物试样的消耗，又减少了对环境的污染。 ( 4 ) 集成化、便携化：在芯片毛细管电泳分析系统中，可将多个部件与各种功 能单元集成在面积为数平方厘米的一个芯片上，柱前和柱后反应器、试样前处理、 酶反应器、检测系统等均可以和电泳分离系统集成在一起，完成全分析功能。在此 基础上容易制成功能齐全的便携式仪器，用于现场分析。 ( 5 ) 分离模式多：常规毛细管的分离模式在芯片上均已得到开发和应用，包括： 毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管等速电泳、毛细 管等电聚焦等。 1 2 1 2 芯片毛细管电泳的缺点 虽然芯片体积小，但多数检测器体积过大，实现集成化还有很多困难；芯片的 微通道尺寸减小，导致检测光程变短，需要开发更高灵敏度的检测器；微通道对其 表面物理和化学性质的变化十分敏感，要时刻注意一些因素给分离带来的影响：虽 然进样量少，但微升以下的试样难以操纵，实际使用的试样量在数微升甚至数十微 升；芯片的通道狭窄，容易造成系统的堵塞，操作中要更加小心；芯片的制作成本 还很高，难以满足推广应用的要求。 目前，芯片毛细管电泳已在很多方面得到应用，随着研究的不断深入，以及相 关技术的不断发展，芯片毛细管电泳技术会更加成熟，在生命科学中的应用会更加 广泛。 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 1 2 2 芯片毛细管电泳的分离模式 1 2 2 1 芯片毛细管区带电泳 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是芯片毛细管电泳中应用 最早而且最广泛的一种分离方式【1 8 】，它的分离机理是基于各被分离物质的电泳淌度 不同而实现分离。c z e 常用的介质为电解质水溶液，根据实际情况可加入不同有机 溶剂或其它添加剂。现在已发展到可不加支持电解质，直接用乙睛、甲醚胺、甲醇 等作溶剂来进行非水c z e 1 9 】。这种分离模式所用的分离介质简单，分离速度快，对 于离子型化合物有很好的分离能力。r o d r i g u e z 等【2 0 1 以c z e 作为分离模式，对常规 毛细管、短毛细管和芯片通道中的电泳分离分析性能作了很有意义的对比研究。 1 2 2 2 芯片凝胶电泳 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 是8 0 年代后期发展起来的 一种分离技术。它是在毛细管区带电泳中增加了凝胶或其它筛分介质。筛分介质形 成了网络结构，对被分离物质有不同的排阻作用，起到分子筛的作用，并且溶质的 分子越大，阻碍作用越强。由于凝胶粘度大，流动性差，可减少管壁对分子的吸附， 还能抑制电渗流，具有很高的分离能力。常用于蛋白质、核糖核酸( r n a ) 、脱氧核 糖核酸( d n a ) 的片段分离和测序以及聚合酶链反应( p c r ) 产物分析川。w o o l e y 等【2 2 】 制成了9 t 的线性聚丙烯酰胺凝胶筛分介质，用此凝胶毛细管电泳芯片做d n a 测 序。 1 2 2 3 芯片胶束电动毛细管色谱 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 是在电泳缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶 束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束假固定相，通过被 分离物质在水相和胶束相之间的分配系数不同而实现分离。胶束电动毛细管色谱最 突出的优点是不仅能分析离子化合物，还能分析不带电荷的中性化合物。拓宽了毛 细管电泳的应用范围，主要应用于氨基酸和多肽的分离2 3 1 。w a l l e n b o r g 等【2 4 】在6 5c m 的直分离通道上，在1m i n 内分离了1 4 种炸药混合物中的1 0 种成分。c u l b e r t s o n 等在1 1 9c m 的多边盘形通道中1 6 5s 内分离了1 9 种荧光标记氨基酸。 1 2 2 4 芯片等速电泳 等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 1 2 6 , 2 7 1 使用两个缓冲溶液系统，是在由前导电解 质和尾随电解质所组成的非连续介质中进行电泳的分离技术。可用于各种离子的分 离，如无机离子、有机离子、核苷酸、氨基酸、蛋白质等。i t p 的最大特点是能将 4 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 分离后的组分压缩为一个个很窄的区带，可作为柱前浓缩方法用于富集样品，来解 决毛细管电泳中浓度、灵敏度不高等问题。 1 2 2 5 芯片等电聚焦 等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) 是用两性电解质建立p h 梯度，具有不同等 电点的蛋白质和肽等两性离子在电场作用下迁移到p h 值与其等电点p i 相同的位置， 聚焦成一个个按等电点次序排列的区带【2 8 1 。i e f 已成功地用于测量蛋白质的p i 值、 蛋白异构体的分离，以及其它方法难以分离的蛋白的分离。 1 2 2 6 芯片毛细管电色谱 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 是将众多的固定相微粒填 充到毛细管中或涂覆在毛细管壁上，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制， 以电渗流为流动相驱动力。它是c e 与h p l c 的有机结合，既有c e 的高柱效，又 有h p l c 的高选择性，利用涂层还可有效减少生物大分子如蛋白分子在毛细管壁的 吸附，改善峰形，提高选择性，是一种很有发展前景的模式。 1 2 3 芯片毛细管电泳的进样 由于芯片毛细管电泳的分离通道短，分析速度快，分子扩散对理论塔板高度的 贡献小，所以进样速度以及进样时的试样带长度会对分离速度和分离效率等产生很 大的影响1 3 】。这就需要在芯片毛细管电泳时采用适当的进样方法。常规毛细管电泳 中常用的压力、虹吸和电动进样法大多需要复杂的机械操作，不适于微流控系统的 进样操作。电渗驱动溶液，可以进行无阀微流体流向切换操作，己在芯片毛细管电 泳进样中得到广泛应用。 芯片毛细管电泳的进样方式主要有两种，即定容进样和定时进样2 9 1 。定容进样 包括简单电动进样、夹流电动进样以及压力定容进样，其中以夹流进样法的应用最 为广泛；定时进样包括t 形通道电动进样、电动门式进样、压力定时进样等，其中 以门式进样法应用为最广泛。下面介绍夹流进样和门式进样两种方法。 1 2 3 1 夹流进样 1 9 9 4 年，j a c o b s o n 等【1 1 1 首先提出了夹流进样( p i n c h e di n j e c t i o n ) 方法。其原理如 图1 2 所示，夹流进样采用十字形通道，在充样阶段，除试样废液池s w 接地外， 试样池s 、缓冲液池b 和废液池w 均施加正电位，电势的分配应使液池s 、b 、w 处的电势v s 、v b 、v w 大于十字交叉口处的电势v j ，而液池s w 处的电势v s w 小于 v j ，此电势分配的结果使得各通道中的电渗流方向如图1 2 ( a ) 中的箭头所示。这样b 、 w 通道中的缓冲溶液也在电渗流作用下挤入s w 通道，与试样液流形成同向并行的 - 5 东北大学硕士学位论文笫1 章绪论 三路层流。由于层流间没有对流作用，且层流液流刚开始接触时，它们之间的扩散 效应很少，因此，液流之间可保持清晰的相间界面，降低或消除了试样泄漏效应。 在进样一分离阶段，液池s 、s w 、b 、w 处的电势同时切换，使v b 大于v j ，v s 、 v s w 小于v j ，v w 更小于v j 。在这种情况下，电渗流的方向如图1 2 ( b ) 所示。于是， 来自缓冲池的缓冲液流将充样阶段截流在十字交叉口处的试样以三角形状态推入分 析通道，同时，将残留在左右两侧试样通道中的试样分别推向试样池和试样废液池， 避免了试样溶液与流经十字交又口的缓冲液接触。采用此方法既消除了充样时试样 带的扩展，又避免了注样时试样的泄漏，提高了分离效率。 采用夹流进样，可以准确重现地控制进样体积，且进样体积与充样时间无关， 容易获得重现的分析结果：可以克服进样时的谱带扩展，避免分离时的试样泄漏， 使分离结果有稳定的基线和更低的检出限，并可以获得更高的分离效率。 夹流进样方法除了具有上述优点外，也带来了一些不利的影响，为了完成充样 过程，进样时问较长。尽管有人提出了改进方法【30 。，在一定程度上解决了上述问题， 但却使系统变得更加复杂，操作可靠性下降。 s b s s w ( b ) 图1 2 夹流进样法操作示意副1 3 】 ( a ) 充样阶段；( b ) 注入阶段；s ，试样池；s w ，试样废液池；b ，缓冲溶液池；w ，废液池；箭 头表示液流流动方向；图中小黑圆点表示电场下迁移速度快的离子，大黑圆点表示电场下迁移 速度慢的离子。 f i g 1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fp i n c h e di n j e c t i o ns c h e m e ( a ) s a m p l el o a d i n g ；( b ) s a m p l ei n j e c t i o n ；s ，s a m p l er e s e r v o i r ；s w , s a m p l ew a s t er e s e r v o i r ；b ，b u f f e r r e s e r v o i r ；彤w a s t er e s e r v o i r ；a r r o w si n d i c a t et h ef l o wd i r e c t i o n ；s m a l lb l a c kd o t si n d i c a t et h ei o n s m o v i n gf a s ti ne l e c t r i cf i e l d ；b i gb l a c kd o t si n d i c a t et h ei o n sm o v i n gs l o w l yi ne l e c t r i cf i e l d 1 2 3 2 门式进样 门式进样的试样体积大小由时间长短决定，可以通过调整进样时问控制进样体 一6 - w 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 积，且进样时间短，更适合对试样进行快速地分离分析。 j a c o b s o n 等1 3 1 】于1 9 9 4 年提出了门式进样法( g a t e di n j e c t i o n ) 。其原理如图1 3 所示。进样前 见图1 3 ( a ) ，缓冲液池b 的电势大于试样池s 的电势，而试样废液 池s w 和废液池w 的电势为零。此时，缓冲液以较大的流量从缓冲液池b 出发，流 经十字交叉口时，大部分向下流入分析通道，有小部分向右流向试样废液池；而试 样从试样池s 出发，流经十字交叉口时，由于电场的导向及缓冲液流的挤压作用向 右流向试样废液池，从而确保在此阶段无试样溶液泄漏到分析通道。进样时，只需 使缓冲液池b 悬空( 不加任何电势) ，试样溶液在电场作用下，经十字交叉口一部分 仍流向试样废液池，另一部分向下流入分析通道 见图1 3 ( b ) 】。进样结束后，各液 池所加电压恢复到进样前的状况 见图1 3 ( c ) 】。这种进样方式的进样量不由十字交叉 口处的死体积所控制，是通过调节进样时间长短来控制，可以保持试样始终在十字 交叉口处，在不问断分离的条件下连续进样，所以进样速度快。 b sss w ( a ) w ( b ) w ( c ) 图1 3 门式进样法操作示意刚1 3 1 ( a ) 进样前；( b ) 充样；( c ) 注样；s ，试样；b ，缓冲液；s w ，试样废液；箭头表示液流流 动方向；图中小黑圆点表示电场下迁移速度快的离子；大圆点表示电场下迁移速度慢的离子。 f i g 1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo fg a t e di n j e c t i o ns c h e m e ( a ) b e f o r es a m p l i n g ；( b ) s a m p l el o a d i n g ；( c ) s a m p l ei n j e c t i o n ；s ，s a m p l er e s e r v o i r ；s w , s a m p l ew a s t e r e s e r v o i r ；b ，b u f t e rr e s e r v o i r ；w ，w a s t er e s e r v o i r ；a r r o w si n d i c a t et h ef l o wd i r e c t i o n ；s m a l lb l a c kd o t s i n d i c a t et h ei o n sm o v i n gf a s ti ne l e c t r i cf i e l d ；b i gb l a c kd o t si n d i c a t et h ei o n s m o v i n gs l o w l yi n e l e c t r i cf i e l d 1 3 基因突变检测 人类基因组测序计划工作完成以后，人们进人了基因组研究工作的下一个重点 阶段，即对遗传物质d n a 序列多态性的研究。如今，单核苷酸多态性( s i n g l e 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 的筛选及其检测成为研究者们广泛关注的焦点。 单核苷酸多态性是指遗传密码的单碱基突变，它是人类可遗传变异中最常见的 一种，在人类基因组3 0 亿对碱基中，平均每1 0 0 0 个碱基对中就有一个以上的s n p s 【32 。， 整个人类基因组中共有3 0 0 万以上的s n p s 。现在s n p s 和基因突变的检测在疾病的 预防研究、临床诊断和癌症研究、药物开发等领域中均有广阔的应用前景【3 3 1 。目前， 对s n p s 和基因突变的检测方法多种多样。由于d n a 测序的高敏感性，它被认为是 进行s n p s 检测和基因突变检测的标准，但测序技术费时、昂贵，不能满足对突变 进行大规模筛查的需要。目前普遍采取的方法是，先对大量待测样本进行已知或未 知突变的筛选，然后再对确定发生突变的样本进行针对性很强的d n a 测序，最终 确定突变的具体序列，从而可以节省大量的时间并降低操作成本。 1 3 1 电泳技术在基因突变检测中的应用 目前，检测s n p s 的电泳方法有很多种。在电泳分离之前，普遍先采用p c r 技 术进行d n a 片段扩增，如果把野生型和突变型d n a 片段的扩增产物进行变性和复 性，就会形成同源双链和异源双链。由野生型d n a 单链和突变型d n a 单链形成的 异源双链在碱基错配处会形成泡状结构或者突起【3 4 】，从而使同源双链和异源双链的 空间构象不同，导致它们电泳迁移率产生差别1 3 5 。 1 3 1 1 单链构象多态性 单链构象多态性( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 是检测基 因突变最流行的方法之一。其原理是基于单链d n a 在中性条件下易形成二级结构， 这种二级结构依赖于其碱基组成。当d n a 链上单个碱基发生变化时，会使单链d n a 空间构象发生变化。在非变性条件下，野生型和突变型单链d n a 具有不同的淌度， 根据它们的电泳淌度不同而得以鉴别。野生型突变能检测到两条单链d n a ，对于突 变型基因，原则上可以检测到四条单链d n a 。s s c p 分析与毛细管电泳相结合的技 术已成为一种基因突变检测新方法，具有灵敏度高、花费低、简单、快速的优点。 t i a n 等【3 6 1 将p c r s s c p 分析与芯片电泳相结合，用于检测乳腺癌易感基因常见的3 个点突变，依据正常和突变序列电泳淌度的变化来判断突变，每个突变的分析时间 仅为1 2 0s 。 1 3 1 2 变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 是利用双链 d n a 分子在含有浓度递增的变性剂( 如尿素和甲酰胺) 的凝胶上电泳时，随着d n a 的迁移，低解链温度区的双链渐渐打开，这种部分的解链将会导致迁移率迅速下降， 8 - 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 野生型d n a 和突变型d n a 分子之间即使只有一个碱基对的差异时，也会在不同时 间发生部分解链，从而被分离成两条带。为了增加可分析的区段，在p c r 的引物末 端加上一个3 0 - - 4 0 b p 的g c 结构，即g c 夹【3 7 】，g c 夹的引入会在d n a 序列上产 生一个高温变性区，而将原来的整条d n a 片段置于低温变性区而便于检测，g c 夹 的应用使更多的突变可被d g g e 检测到。g o r a k s h a k a r 3 8 】利用d g g e 技术检测了罕 见的1 3 地中海贫血症突变。d g g e 的优点是如果突变发生在最先解链的d n a 区域 中，则其检出率可以达到1 0 0 ，其检测的片段可以达到lk b ，尤其适用于1 0 0b p 5 0 0 b p 的片段分析。 1 3 1 3 温度梯度凝胶电泳 温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 是近几年 出现的一种新的基因突变检测方法【39 1 ，它与变性梯度凝胶电泳的检测原理相同。野 生型和突变型d n a 分子经变性复性后所形成的异源双链和同源双链具有不同的碱 基组成，导致它们的解链温度( t m ) 不同，当d n a 分子置于线性温度梯度凝胶中进 行电泳时，异源双链由于存在碱基的错配，先解链，而同源双链后解链，未解链的 和部分解链的d n a 分子在毛细管电泳中具有不同的电泳迁移率，进而得到有效分 离。t g g e 方法无需事先了解突变类型，只要突变发生在所设置的温度梯度范围内， 便可以对已知和未知突变进行有效检测。该技术的最大特点就是具有高分辨能力， 能够1 0 0 检出2 0 0 9 0 0b p 内的d n a 片断，并且重现性好、操作简便快速，所以 这种方法出现以后很快就得到广泛的应用。k n e b a 等【4 0 】采用p c r t g g e 结合d n a 测序成功扩增鉴定淋巴瘤患者和白血病患者的t 细胞抗原受体y 链v - n j 序列的结 构特征。g e l f i 4 1 】等发展了t g g e 方法，他们利用毛细管中焦尔热效应产生温度梯度， 可根据毛细管的内径和长度、电场和分离介质的电导调节毛细管中的温度，这种方 法已用于c f t r 及人的1 3 球蛋白基因突变分析。h o m 【4 2 j 采用t g g e 方法对i 型神 经纤维瘤( n f l ) 患者进行普查，发现了n f l 基因的3 个新突变。b u c h 4 3 j 等在p c 芯 片上集成微加热器和温度传感器，采用温度梯度凝胶电泳实现了在片基因突变检测。 通过集成在p c 芯片分离通道上的微加热器和温度传感器阵列对温度的控制，沿分 离通道( 4c m 长) 形成7 0 c 至7 5 c 的温度梯度，以4 5 p v p 为筛分介质，在分离场 强1 5 0v c m 条件下，电泳分离突变基因经p c r 扩增后形成的四种同源双链和异源 双链片段。s h 旬i 等【4 4 】利用t t g e ( t e m p o r a lt e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 对1 3 球蛋白基因突变和多态性进行了快速、灵敏、高通量的分析。 1 3 1 4 恒定变性凝胶电泳 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 恒定变性凝胶电泳( c o n s t a n td e n a t u r a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c d g e ) 是通过d g g e 改进而成，该法通过预实验或者计算，事先确定待测d n a 片段的解链温度，然后 采用单一变性浓度的凝胶进行电泳，简化了d g g e 的操作。h o f s t r a 等【4 5 】使用了g c 夹板修饰p c r 产物，进行双重d g g e 和c d c e ，电泳时在凝胶的两端使用尿素甲 酰胺浓度梯度，用来检测哈尔氏病人的r e t 和g d n f 基因突变情况。 1 3 1 5 构象敏感性凝胶电泳 构象敏感性凝胶电泳( c o n f o r m a t i o ns e n s i t i v eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c s g