脱细胞血管基质的生物相容性研究.docx

2010芷 lo月首都医科大学学报 oct2010第3l卷 第5期 journal of capital medical universityvol31 no5【doi：103969jissn1006-7795201005027临床研究脱细胞血管基质的生物相容性研究董建德1张建2谷涌泉2黄金洪1高峰1 李春民3 (1首都医科大学教学医院北京电力医院心胸血管外科；2首都医科大学宣武医院血管外科， 首都医科大学血管外科研究所；3首都医科大学附属北京复兴医院血管外科)【摘要】 目的评估triton x100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞血管基质的生物相容性。方法分别采用体外细胞毒性试 验(直接接触法和mtt法)检测脱细胞血管摹质的细胞毒性，采用皮下植入试验来评估经脱细胞血管基质的免疫排斥反应。结 果l929细胞在预铺脱细胞血管基质的培养板内及不同浓度脱细胞基质浸提液内均生长良好，皮下植入试验显示2周后脱细 胞血管基质的炎性反应明显减轻。结论经triton x-100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞血管基质具有良好的生物相容性。【关键词】细胞外基质；细胞相容性；组织支架【中图分类号】r 543study for the biocompatibility of decellularized vascular scaffolddong jiandel，zhang jian2，gu yongquan2，huang jinhon91，gao fen91，li chunmin3(1department of cardiothoracic and vascular surgery，beijing electric power hospital，capital medical uaiversuy；2department of vascular surgery，xuanwu hospital，institute of vascular surgery，capital medical university；3department of vascular surgery，beijing fuxing hospital，capital medical university)【abstract】objective to evaluate the biocompatibility of decellularized vascular scaffold prepared with triton x一100 and trypsin memotis in vitro and in vivo tests were performed to evaluate the biocompatibility of the decellularized vascular scaffoldthe in vitro tests included direct-contact method and mit assayand the in vivo test was subcutaneous implant testresults 1929 cells grew well on the glass slide covered with decehularized vascular scaffold and in the solution of deceuularized vascular matrixthe patches implantedsubcutaneously in sd mice only caused slisht inflammatory reaction after 2 weeksconclusion decellularized vascular matrices prepared诵th triton x100 and trypsin had a good biocompatibility【key woims】 extracellular matrix；biocompatibility；tissue scaffold脱细胞血管基质由于去除了血管抗原的主要来源一 (5005)cm。胰蛋白酶，乙二胺四乙酸(edta)， 细胞及其碎片，保留了血管的三维形态结构及力学强度， triton x100，氢氧化铵，四甲基偶氮唑盐(mrifi，sigma 并且能够促进细胞的黏附和组织再生的特性，已经成为 公司，美国)，胎牛血清(fbs)和dmem培养液(gibco 血管组织工程支架的研究热点。理想的脱细胞血管基质 公司，美国)，ts一100脱色摇床(北京宾达英创科技有 应该具有良好的力学特征、细胞相容性及低免疫原性。 限公司)细胞培养箱(heracell 150型培养箱，heraus 本实验采用去垢剂一胰蛋白酶联合法对猪髂动脉进行脱 公司，德国)，倒置相差显微镜(olympus ixt0，日本)， 细胞处理，制备出具有合适力学强度和孔径的脱细胞血 免疫酶标仪(microplate manager 40，bio-radaborato-管基质，并对其进行细胞相容性和免疫原性检测，为进一 ties公司，美国)。步的组织工程血管构建提供合适的支架材料。 12方法1材料和方法 1)猪髂动脉脱细胞血管基质的制备 将猪髂动脉用蒸馏水浸泡l h，剥除外膜，结扎动11实验材料 脉分支。将血管放入含1triton x一100和01氢 新鲜屠宰猪的髂动脉，外径(4005)mm，长度氧化铵的pbs中，放置于脱色摇床上(30 rrain)，于基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2006aa02a134)资4条件下，进行脱细胞处理72 h，每24 h更换1次助项目，supposed by the national high technology research and develop- 脱细胞液。将血管放入pbs中振荡冲洗72 h，每24 hmerit program(2006aa02a134)corresponding authoremail：dongjiande99200126oom更换1次pbs。将血管放人到含025胰蛋白酶-万方数据首都医科大学学报 第3l卷002edta的pbs中，37水浴箱中再分别处理液中固定，送病理检查。15 min，1 h，2 h，3 h和4 h。将血管放入pbs中振荡13统计学方法冲洗1 h。脱细胞血管放人装有pbs的离心管中用1数值资料用均数标准差(豆s)表示，经spss 射线消毒，消毒后的脱细胞血管保存在4冰箱中。115统计分析包处理，多组间比较采用方差分析，2)脱细胞血管基质的鉴定及生物力学检测方法p005为差异有统计学意义。 参见文献1。2结果3)体外细胞毒性试验(1)直接接触法21直接接触法 取培养传代第3天生长旺盛的l929细胞，配成 实验组l929细胞黏附在脱细胞血管基质表面生浓度为1104个ml细胞悬液，接种于16孔培养板长(图1。由于脱细胞血管基质不透光，因此观察靠近边 内，实验组预先置人预铺脱细胞血管基质片，空白对缘部分)，细胞形态良好，呈梭形，细胞突充分伸展。随 照组不放置任何材料，培养液为含10fbs的着时间的延长，细胞数量增加。在各观察点，实验组和 dmem培养液，每组重复3孔，置于37、5co，恒 空白对照组相比，细胞形态及数量均无明显差别。 温细胞培养箱内培养，23 d换液1次。逐日于倒置显微镜下对各组细胞进行形态学观察并摄像对比。 细胞形态学标准参照文献2。(2)m1tr法脱细胞基质浸提液的制备：将脱细胞基质按1 cm2试样表面积加10 ml浸提介质比例在37恒 温箱中浸提24 h。浸提介质是含10胎牛血清的 dmem培养液，配制成50和100浓度的脱细胞基 质浸提液。细胞增生率测定：将l929细胞悬液接种于96 孔板内，每孔接种3104细胞。先用含10胎牛血图1 直接接触法所显示的l929细胞在脱细胞清的dmem培养24 h，细胞贴壁后，弃去培养液，分别 血管基质表面黏附生长情况加入0(空白对照)、50和100脱细胞基质浸提液。fig1 the adhesion and growth of l929 cells ondecellularized vascular scaffold by培养3 d，采用mtr法测定各组570 nm波长的吸光 direct-contact method(10)度。(a)值在酶标仪上以570 nm波长测定光吸收值22细胞增生率测定 a(入)值，取平均值。通过下面的公式计算相对增在第2、4与7天，空白对照组、100和50浸提生率(rgr)，rgr=(实验组吸光度值空白对照组吸液组的平均相对增生率分别为100、10109和 光度值)100。10232，评分脱细胞基质总的细胞毒性为0级；在4)皮下植入实验相同时间各组的光吸收值a，加差异无统计学意义(表取sd大鼠12只，体质量在30 g左右，实验组1)，提示l929细胞增生与脱细胞基质的浸提液的浓 和对照组各6只；度无显著性相关。水合氯醛按3 mlkg腹腔注射麻醉，腹部正中23皮下植入实验 纵行切开，长约15 cm，切开皮肤和皮下组织，钝性分1)肉眼所见：全部sd大鼠术后均存活，切i=l愈合 离皮下组织和腹壁肌肉的间隙，实验组植入脱细胞血良好，没有感染征象，所有的埋植标本均被周围组织 管基质(约10 mm10 mml mm大小，y射线消包裹。 毒)，对照组植入未脱细胞处理的自然血管。4#丝线间断缝合皮下组织及皮肤，送动物实验室继续饲养。2)he染色：皮下植入1周时，未脱细胞的自然血l周，2周和4周后，实验组和对照组各处死2管标本(图2a)和脱细胞血管基质(图2b)周围均有只，取出植入的血管片，连带周围组织，10甲醛固定明显的炎性细胞浸润，以淋巴细胞和多形核白细胞为万方数据第5期 董建德等：脱细胞血管基质的生物相容性研究651表l用mtt法检测的各组光吸收值(a)及相对增生率(rgr)主，二者无明显区别；2周时可见脱细胞基质(图2d)tab1 optical absorption(a)and relative growth rate(rgr) 周围仍然有炎细胞浸润，但较1周时炎性细胞明显减assayed by mtt method for each group少，脱细胞基质内可见成纤维细胞和毛细血管，而未脱细胞的自然血管标本(图2c)周围仍然有较多的炎 细胞浸润，以淋巴细胞为主。4周时脱细胞基质(图2f)周围无明显的炎性细胞浸润，脱细胞基质内可见 成纤维细胞，脱细胞基质结构(包括内弹力膜，中膜和 外膜)基本完整；而自然血管(图2e)管壁内仍有较多 的淋巴细胞浸润，基本无法辨别管壁的结构。a rt=6 for each group图2脱细胞血管基质大鼠皮下植入he染色fig2 he staining of decellularized vascular scaffold implanted subcutaneously in ratsa-c and e were native vessels implanted for 1，2 and 4 weeks，and b。d and f were decellularized vascularscaffolds implanted for 1，2 and 4 weeks(200)万方数据首都医科大学学报第3l卷652可能来自种属间的差异。本研究采用皮下植入实验比3讨论较了自然血管和脱细胞血管基质的免疫排斥反应，结组织脱细胞的原理是利用物理(主要为振荡处 果发现2周后脱细胞基质的炎性反应明显减轻，并且 理)、化学(包括酸碱、去垢剂等)或酶学(包括胰蛋白 出现新生肉芽组织，表明脱细胞处理能够明显减轻其 酶和核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)等方法，将组织 免疫排斥反应，并且能够向自体组织方向转化。 中的细胞成分破坏并清除，而保留基本完整的细胞外本研究采用体外细胞毒性试验与皮下植入实验 基质。经脱细胞方法制备的血管脱细胞基质是血管检测经triton x-100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞 组织工程很有前途的一种支架材料，因为：(1)经适当 血管基质的生物相容性。结果显示，该方法制备的脱 的脱细胞方法处理后，主要的抗原来源的细胞及其细 细胞血管基质具有良好的生物相容性。胞碎片被清除，细胞外基质成分如胶原和弹性蛋白基4参考文献本保留下来，目前的研究”叫认为细胞外基质成分在种属间差异不大，能够为异种受体所接受；(2)研1董建德，张建，谷涌泉，等脱细胞血管基质和间充质干究l5刮发现，脱细胞基质的生物力学特性如爆破强度，细胞构建组织工程血管j中华外科杂志，2009，47：14911494缝合耐受强度及顺应性等与自然血管差别不大；(3)2郝和平医疗器械牛物学评价标准实施指南m北京：脱细胞血管基质具有和自然血管相似的三维结构。中国标准出版社，2000但由于脱细胞过程所使用的去垢剂大部分都有细胞3bernard m p，chu m l，myers j c，et a1nucleoride se毒性，如果残存于脱细胞基质内，则会对种植到其上quences of complementary deoxyribonucleic acids for the pro的种子细胞造成破坏作用一j，因此，需要对其进行细alpha l chain of human type i procollagenstatistical evalu胞毒性检测，此外，血管脱细胞基质仍属于异体或异ation of structures that are conserved during evolutionj种蛋白，需要进行免疫排斥反应的检测。biochemistry，1983，22：52135223体外细胞毒性试验是检测材料毒性的有效手段，4bernard m p，myers j c，chu m l，et a1structure of it方法包括直接接触法和mtt法。直接接触法是将细胞edna for the pro aipha 2 chain of human type i procoua-与材料直接接触，通过观察细胞的形态检测材料的细gencomparison with chick edna for pro alpha 2(i)idenrifles structurally eo蹴rved features of the protein and the胞毒性，具有敏感性高的特点，可以检测出材料的微弱细胞毒性。在本实验中，细胞种植到铺有脱细胞血管genejbiochemistry，1983，22：1 1391 1455roy s，silaeei p，stergiopulos nbiomeehanieal properties基质的培养板上后，细胞迅速黏附、铺展，其形态与接of deeellularized porcine common carotid arteriesjam j种到预铺明胶的培养板的细胞相似，表明脱细胞血管physiol heart cire physiol，2005，289：h15671576基质经处理后，没有明显的细胞毒性，细胞可以在其表6murase y，narita y，kagami h，et a1evaluation of tom面黏附生长。miti法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸for pliance and stiffness of deceiiularized tissues ag scaffolds脱氢酶能使外源性的mt转化为难溶性的蓝紫色结晶tissue-engineered small caliber vascular grafts using intra- 物并沉积在细胞中。二甲基亚砜(dmso)能够溶解细vascular ultrasoundjas