中医课题标书

附件2 省中医药科技计划项目申请书 2008yA006项目名称：温补肾阳法对哮喘小鼠骨髓CD34+祖细胞分化的干预研究 （此页不可另行附页）三、项目研究前景分析（包括国内外同类项目研究现状，市场需求情况，研究开发意义，可附主要参考文献）支气管哮喘(哮喘)是一种以嗜酸粒细胞 (Eos)浸润为主的气道反应性炎症和以气道高反应性 (airway high reaction，AHR)为特征的疾病。当今世界上约有1.6亿哮喘病患者，发病率呈逐年增长趋势。但其发病机制尚未完全明确。目前认为，气道炎症是哮喘AHR的基础，而Eos是其关键的效应细胞。Eos被激活后，能释放EOS阳离子蛋白(ECP)、主要碱基蛋白(MBP)、血小板活化因子(PAF)和白三烯(LT)等，还能促使肥大细胞释放组胺、5-羟色胺、LT及趋化因子，并建立“自身维持环” (serf-sustaining cycte)吸引更多EOS聚集到炎症反应部位气道，从而形成一种周而复始的持续性(慢性)炎症反应，再释放ECP、MBP、PAF和缓激肽，这些细胞因子分布到气道，对气道黏膜上皮细胞产生毒性破坏作用，上皮成簇地脱落，将上皮细胞下的感觉神经末梢C纤维暴露，从而形成气道反应性增高。近年来着眼于嗜酸粒细胞在哮喘气道中的浸润和凋亡的研究较多，但关于哮喘骨髓嗜酸粒细胞分化的研究较少。Eos来源于骨髓CD34+祖细胞。一般情况下，Eos祖细胞(Eos/B祖细胞)在骨髓分化成熟为Eos，后者在骨髓中存储数日后被释放至血循环，并在1h内进入组织1。哮喘患者体内诱导CD34+细胞分化为Eos的刺激物增多，结果导致Eos从骨髓中释放增多，随后其在粘附分子等因子的作用下移出循环系统，并在其特异性的趋化物如Eotaxin等作用下向肺组织局部浸润。IL-3、IL-5、IFN-等均可影响骨髓嗜酸粒细胞的分化、增殖及迁移。研究表明，变应原吸入后5小时IL-3应答的嗜酸粒细胞祖细胞显著增加，变应原吸入后1224小时IL-5应答的嗜酸粒细胞祖细胞显著增加，变应原吸入后48小时，骨髓IFN-水平也显著增加，说明变应原吸入后骨髓多种细胞因子水平以时间依赖的变化方式调节和控制着骨髓嗜酸粒细胞祖细胞的分化、增殖及迁移活动2。其中IL-5是关键的嗜酸粒细胞生成因子。IL-5能特异作用于嗜酸粒细胞，不仅可远距离地作用于骨髓嗜酸粒细胞祖细胞促进其繁殖、分化，维持并延长成熟嗜酸粒细胞的生存期，引起嗜酸粒细胞趋化和黏附3。GM-CSF是刺激骨髓嗜酸粒细胞分化、增殖和抗嗜酸粒细胞凋亡的细胞因子4。此外，嗜酸细胞活化趋化因子Eotaxin也可在不依赖IL-3、IL-5、GM-CSF的情况下诱导嗜酸粒细胞从脐带血CD34+祖细胞的分化5。信号转导子和转录激活子-5（STAT-5）也具有明显的促CD34+嗜酸粒细胞分化、增殖作用6。现代研究发现哮喘动物骨髓CD34+祖细胞表明IL-5R及Eotaxin受体CCR3表达升高。现代医学研究表明：糖皮质激素泼尼松、强的松可抑制哮喘小鼠骨髓内CD34+造血细胞的增殖分化及迁移至外周血。但哮喘治疗需坚持长期应用激素，对人体副作用大。目前，西医尚无另外成药抑制哮喘骨髓Eos分化。因此，寻找一种代替激素能够降低哮喘骨髓Eos生成并且毒副作用少的药物，具有巨大的市场潜力。而祖国医学治疗哮喘有上千年的历史，积累了丰富的临床经验，其中温补肾阳法是治疗缓解期哮喘的经典治法之一，疗效确切，毒副作用少。现代医家对肾阳虚在哮喘发病中的作用也有深刻认识。柯新桥7认为无论何时期，肾虚(尤其是肾阳虚)是本病最根本的病理机制，并提出防治哮喘发作当以补肾温阳纳气为要。沈自尹8在用以温补肾阳药为主的温阳片治疗哮喘的基础上，发现肾虚为哮喘患者的基本体质。倪伟等9通过对缓解期哮喘患者肾阳虚与气道炎症的研究表明肾阳虚是哮喘缓解期的主要病机。实验研究也表明，温补肾阳法能对抗哮喘气道炎症，改善气道痉挛，调节有下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴等作用。如：张炜等10研究发现喘可治(巴戟天、仙灵脾等)可降低患者Eos绝对计数、IgE水平，消除气道炎症。张惠勇等11通过实验发现喘可治(巴戟天、仙灵脾等)雾化吸人能通过影响IFN-和IL-4的含量来调节Th1Th2细胞比例，纠正免疫失衡，抑制气道炎症。许建华等12研究发现补肾阳(鹿角片、肉苁蓉、巴戟天、鹅管石、熟附片、肉桂)可使哮喘大鼠2受体mRNA明显上升。还发现13补肾定喘汤（鹿角片、肉苁蓉、巴戟天、鹅管石、熟地、山药、山萸肉、茯苓、丹皮、泽泻、熟附片、肉桂)能使肺组织过高的GR水平下降，可升高血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇（CORT)水平，兴奋垂体一肾上腺皮质系统。温补肾阳法能使哮喘患者外周血或肺泡灌洗液中Eos数目降低，但其降低Eos的机制尚未见有深入研究报道。Eos的产生，受骨髓微环境中的细胞、调节因子和细胞外基质调节。中医理论认为肾主骨生髓，故应用相关中药调控骨髓造血微环境，可能有减少哮喘时Eos生成的作用。本研究选用临床应用颇为有效的温补肾阳方（由生熟地各15g，菟丝子15g，补骨脂15g，仙灵脾20g，巴戟天15g等组成，以下简称补肾方）进行研究，探讨温补肾阳法对哮喘小鼠骨髓中Eos祖细胞向Eos分化及其调节因子的干预作用机制，具有较大理论意义，有助于临床选方用药。1. Giembycz MA, Lindsay MA. Pharmacology of the eosinophil. Pharmacol Rev, 1999, 51: 213- 340.2. Dorman SC, Sehmi R, Gauvreau G M, et a1. Kinetics of bone marrow eosinophilopoiesis and associated cytokines after allergen inhalation. Am J Respir Crit Care Med, 2004,169(5):549-550.3. 江荣林, 沈华浩. IL-5、Eotaxin与支气管哮喘. 国外医学呼吸系统分册,2004,24(1):l8-20.4. Shen ZJ, Esnault S, Malter JS. The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 regulates the stability of granulocyte microphage colony-stimulating factor mRNA in activated eosinophils. Nat lmmunol，2005,6(12):l280-l287.5. Bouchaib L, Soussi GA, Qutayba H, et al. The CCR3 Receptor Is Involved in EosinophilDifferentiation and Is Up-Regulated by Th2 Cytokines in CD34+ progenitor Cells. The Journal of Immunology, 2002, 169: 537547.6. Buitenhuis M. Baltus B. Singal transducer and activator of transcription 5a(STATSa)is required for eosinophil differention of human cord bloodderived CD34+ cells. Blood, 2003, 101(1): 134-l42.7. 柯新桥补肾防喘述要湖北中医杂志，1997，19(6)：38. 沈自尹中西医结合防治支气管哮喘的探讨中国中西医结合杂志，1995，15(7)：4269. 倪伟，于素霞，王宏长，等缓解期哮喘患者肾阳虚与气道炎症关系的研究：附175例病例分析中国中医基础医学杂志，20017(6)：6010. 张炜，毕小利温补肾阳法治疗成人支气管哮喘急性期20例辽宁中医杂志2002，29(12)：72011. 张惠勇，倪伟，张金福，等喘可治注射液雾化吸入对调节支气管哮喘大鼠免疫失衡的实验研究上海医学200326(12)：90412. 许建华，吴敦序，方肇勤，等不同补肾法对哮喘大鼠肺组织p2肾上腺素能受体mRNA的影响上海中医药大学学报，2001，15(3)：3813. 许建华，范忠泽，吴敦序，等补肾定喘汤对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体及血浆皮质酮、ACTH 的影响中国中医基础医学杂志，2003，9(1)：27 （可另行附页）四、项目研究内容（包括方法、技术路线、拟解决的关键问题及预期研究目标等）研究方法：1.实验动物与分组本实验将健康10周龄的雄性BALB/c小鼠随机分为6组，即正常对照组、模型组、补肾方高剂量组、补肾方中剂量组、补肾方低剂量组和阳性对照组（地塞米松）6组，每组10只。2.复制模型采用卵白蛋白(OVA)雾化吸入致敏激发法复制哮喘小鼠模型。实验第1d，将小鼠一次性腹腔注OVA混悬液lml（OVAl00mg，氢氧化铝100mg，灭活百日咳杆菌菌苗6X109个）以致敏，第15d起，将小鼠分别置于304040cm3大小的玻璃容器中，以2%OVA生理盐水溶液按最大雾化量进行超声雾化，小鼠自然吸入20min，诱发哮喘。每天1次，共持续7天。以烦燥、挠鼻、抓身、咳嗽、喷嚏、呼吸急促深快及点头运动等症状的出现为激发成功。3.药物干预致敏后第22天开始给药，一日一次。补肾方组给药按高、中、低剂量分别为6g/kg、3g/kg、1.5g/kg灌胃，地塞米松组给予地塞米松5mg/kg腹腔注射，正常对照组和模型组给予生理盐水5mg/kg灌胃。第29天，在给药同时，每日2%OVA生理盐水溶液雾化一次，持续7天。4.标本采集 于末次激发后，用腹腔注射2%戊巴比妥钠2.3ml/kg麻醉小鼠，下腔静脉取血，收集至抗凝管中。取小鼠后肢股骨，用肝素化生理盐水(100u/m1)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔呈白色，轻轻吹散细胞后过400目滤网使成单细胞悬液。待作流式细胞仪分析、细胞计数、制备细胞甩片及原位杂交结合免疫组化检测。肺组织以10%甲醛固定，以备病理检测用。5.指标检测（1）观察给药前后小鼠引喘潜伏期变化、烦燥、挠鼻、抓身、咳嗽、喷嚏、呼吸急促深快及点头运动等症状，判定哮喘症状轻重程度。（2）抗凝血直接涂片；骨髓悬液42000rpm离心10min，取沉淀物涂片，瑞氏-姬姆萨染色，进行白细胞和Eos计数。（3）固定后的肺组织常规脱水，石蜡包埋，切片，行常规HE染色，观察肺中Eos浸润情况。（4）骨髓悬液离心后上清液用ELISA法检测IL-5和Eotaxin。（5）流式细胞仪检测骨髓CD34+造血祖细胞及CD34+/CCR3+细胞比例。取骨髓悬液,加入磷酸盐缓冲液(PBS)后离心去上清，调整体积为100l，加入CD34-PE和CCR3-FITC单抗10l；室温避光孵育20 min，加人500l红细胞裂解液，旋涡振荡器充分混匀；室温静置20min，加入PBS500l充分混匀，再静置20 min后上机检测。（6）原位杂交结合免疫组化方法测定骨髓细胞IL-5RmRNA及CD34的表达。骨髓细胞涂片经常规预杂交、杂交等操作后，采用链亲合素-生物素复合物-碱性磷酸酶显色系统，用5-溴4-氯-3吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)显色，阳性可见胞浆呈紫蓝色。杂交成功后立即行免疫组化染色，显色系统为过氧化物酶连接的链亲合素-生物素复合物，二氨基联苯胺(DAB)显色，阳性胞膜显示为棕黄色。6.统计分析：对上述所得实验数据采用SPSS12.0软件进行统计分析。技术路线BALB/c小鼠60只空白对照组模型组补肾方高剂量组阳性对照组(地塞米松)NS致敏NS雾化OVA+ Al(OH)3+百日咳灭活杆菌致敏 2%OVA雾化激发7天补肾方低剂量组补肾方中剂量组NS灌胃7天 末次激发后甲醛固定HE染色肺组织Eos浸润情况抗凝血Eos计数原位杂交免疫组化离心、瑞氏-姬姆萨染色；ELISA骨髓悬液Eos计数IL-5、EotaxinCD34+造血祖细胞CD34+/CCR3+比例IL-5R mRNACD34表达流式细胞仪NS灌胃7天NS雾化7天NS灌胃7天OVA雾化7天灌胃7天OVA雾化7天灌胃7天OVA雾化7天灌胃7天OVA雾化7天腹腔注射7天OVA雾化7天NS灌胃7天灌胃7天灌胃7天灌胃7天腹腔注射7天拟解决的关键问题1.哮喘小鼠模型的复制。2.流式细胞仪检测骨髓CD34+造血祖细胞及CD34+/CCR3+细胞比例。3.原位杂交结合免疫组化方法测定骨髓细胞IL-5RmRNA及CD34的表达。4.ELISA方法检测骨髓上清液中的IL-5和Eotaxin。预期研究目标1. 温补肾阳法能减轻小鼠哮喘症状。2. 温补肾阳法能降低骨髓中Eos数目，从而降低外周血和肺组织中Eos数目。3. 温补肾阳法能降低骨髓中分化产生Eos的CD34+/CCR3+造血祖细胞。4. 温补肾阳法能降低促进CD34+造血祖细胞分化的调节因子IL-5和Eotaxin水平。5. 温补肾阳法能降低骨髓CD34+造血祖细胞IL-5R mRNA和CCR3表达。6. 形成完整的研究报告，并在国家级或省级杂志发表学术论文至少2篇。 （可另行附页）五、年度研究计划及主要考核指标2008.07-2008.09复习文献，制备药物，准备实验用品及仪器设备，作好实验准备。考核指标：是否准备就绪。2008.10-2009.02购置所需要试剂盒、药品等。进行预实验，以OVA、氢氧化铝、灭活百日咳杆菌菌苗悬浊液腹腔注射致敏，OVA雾化吸入诱发小鼠哮喘模型。考核指标：实验条件完善与小鼠哮喘模型的成功建立。2009.03-2009.06进入正式动物实验，并收集抗凝血、骨髓悬液并制作肺组织标本。考核指标：能否获得符合要求的骨髓悬液和肺组织标本。2009.07-2009.12 进行外周血Eos计数；肺组织一般病理学检查，骨髓悬液Eos计数，测定IL-5和Eotaxin；测定骨髓CD34+造血祖细胞IL-5RmRNA和CCR3表达。考核指标：实验数据与病理图片的获得。2010.01-2010.05 实验数据统计分析，对资料进行总结，形成学术论文、参加学术交流等。考核指标：论文是否能发表或参加学术交流。2010.06-2010.07形成完整的鉴定材料，完成课题鉴定。考核指标：课题鉴定是否通过。 （可另行附页）六、现有技术基础（包括与本项目相关的已完成的研究工作情况、专利申请等）本课题组多年来一直从事呼吸系统疾病的科研和临床工作，对呼吸系统疾病的研究有丰富的理论基础、临床经验和实验技术能力。已经主持、参与完成多项呼吸系统疾病的省部级科研课题，并多次获奖。课题组主要成员均获取硕士学位或博士、硕士研究生在读，有着较强的科研能力和实验动手能力。与本项目相关的已完成的研究工作情况：1.芍甘胶囊止咳平喘作用的实验和临床研究（浙江省卫生厅课题），2004年浙江省中医药科学技术创新奖二等奖。2.椒枝软胶囊平喘作用的研究（浙江省中医药管理局课题，20002003年），2004年5月获浙江省政府科学技术奖三等奖和浙江省中医药科技创新奖三等奖。3.平喘颗粒剂在哮喘阶梯治疗中增效作用的研究（浙江省中医药管理局课题，19971999年），2000年5月获浙江省中医药科技进步奖三等奖。4.哮喘阶梯式治疗中医清肺补肾法增效作用的研究（浙江省中医药管理局课题），2000年获浙江省卫生厅科技进步三等奖。5.麦冬多糖防治哮喘的实验研究（浙江省卫生厅课题），1998年获浙江省卫生厅优秀奖。6.甘利欣针对哮喘鼠肺组织肾上腺皮质激素受体影响的实验研究（浙江省中医药管理局课题）。7.益气补肾清热活血法对哮喘抗炎作用的实验研究（浙江省中医药管理局课题）。8.芍药甘草汤调节哮喘大鼠气道上皮细胞信号转导子和转路活化子6的表达与IL-13关系的研究（浙江省中医药管理局）。 （可另行附页）七、现有工作条件（包括与本项目研究相关的研究设备、仪器情况等）仪器设备名称、规格已有租借协作需购置（经费）WH-2000超声波雾化器已有BX840-2 单人双面垂直净化工作台已有FSH-2 可调高速匀浆机已有DKZ-2 JH电热恒温振荡水槽已有-70超低温冰箱已有电泳仪和转膜仪已有Westernblot免疫印迹检测系统已有PCR仪已有GDS8000型凝胶成像及分析系统已有Bio550酶标仪已有Eppendorf台式高速离心机已有YDS-30B-50mm 30L 液氮容器已有AG245型电子天平已有YXQ.SG41.280B型手提式高压消毒器已有CPS-I型超声粉碎仪借用OLYMPUS光学显微镜已有WH-2000超声波雾化器已有 （可另行附页）八、经费预算（包括详细开支计划及年度用款安排、自筹及要求资助的年度计划）详细开支计划及年度用款安排（1）调研 0.1万（2）查新检索 0.1万（3）药物制备 0.1万（4）实验动物 0.25万（5）实验动物饲养 0.2万（6）ELISA试剂盒 0.8万（7）实验试剂 0.8万 （8）指标检测 0.7万（9）实验用品 0.3万（10）发表论文、著作 0.2万（11）学术交流 0.2万（12）专业资料印刷 0.05万（13）课题鉴定 0.2万合计：4万年度2008 年2009 年2010年资助金额0.3万1.4万0.3万自筹金额0.3万1.2万0.5万九、项目负责人承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成人员将严格遵守浙江省中医药科研计划的有关管理规定，切实保证研究工作的时间及质量，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 项目负责人（签名）： 2008年1月15日十、合作单位承诺 同意参加合作研究，并保证对参加合作研究人员在时间及工作条件上给予的支持，督促其按计划完成所承担的任务并提交科学可靠的研究总结材料和原始实验记录。合作内容： 技术合作负责人签名： 合作单位1（公章） 合作内容： 技术合作负责人签名： 合作单位2（公章）十一、项目申请单位意见1、 申请单位学术委员会评议意见哮喘的发病率逐年上升，目前西医对哮喘的预防和治疗主要依赖吸入激素，但是存在激素减量困难，长期吸入有副作用等诸多问题。因此中医药在哮喘中的联合防治作用成为目前科研研究的热点课题之一。本课题选题正确，设计合理，思路清晰，指标先进。本课题的完成将揭示中医温肾补阳药防治哮喘的作用机理，为中西医联合防治哮喘提供理论依据。 同意申报。学术委员会主任（签章）年月日2、申请单位审核意见已对申请书内容进行审核，保证在项目获得立项后做到以下几点：保证对研究计划实施所需的人力、物力和时间等条件给予支持，严格遵守浙江省中医药科研基金的有关管理规定；保证所申请项目研究内容真实可靠；督促项目负责人和本单位项目管理部门按规定及时报送有关材料，并保证其科学性和真实可靠性。需要说明的其他问题：单位负责人（签章）：单位（公章） 年月日十二、上级主管部门审核意见： 负责人签名： 单位（公章）负责人签名： 单位（公章）负责人签名： 单位（公章）G13 regulates methacholine-induced contraction of bronchial smooth muscle via phosphorylation of MLC20 References and further reading may be available for this article. To view references and further reading you must purchase this article.Song Jin Leea, b, 1, Woo Hyung Leea, 1, Sung Hwan Kia, Young-Mi Kima, Seung Jin Leea, c, Chang Ho Leed and Sang Geon Kima, , aInnovative Drug Research Center for Metabolic and Inflammatory Disease, College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, Seoul 151-742, South KoreabYuhan Corp., Daebang-dong, Dongjak-gu, Seoul 156-754, South KoreacInstitute for Innovative Cancer Research, ASAN Medical Center, Seoul 138-736, South KoreadDepartment of Pharmacology and Institute of Biomedical Science, College of Medicine, Hanyang University, Seoul 133-791, South KoreaReceived 25 November 2008; accepted 26 January 2009. Available online 2 February 2009. AbstractReversible airway constriction is induced by an increase in airway smooth muscle contractility in response to methacholine likely as a bronchospastic stimulus. Despite the finding of G12 and G13 up-regulation in airway hyperresponsive animals, their functional role of contraction in airway smooth muscle has not been directly explored. This study investigated the differential regulatory role of G12/G13 in methacholine-induced contraction of trachea and bronchus in G12 or G13 gene knockout mice after ovalbumin sensitization and challenges. Organ bath assays and videomicroscopy revealed that G13 deficiency delayed methacholine-induced contractile response of bronchiolar smooth muscle, but not that of tracheal smooth muscle. In primary bronchial smooth muscle cells, knockdown of G13 blocked methacholine-induced phosphorylation of 20kDa regulatory light chain of myosin II (MLC20), a prerequisite step for the contractile initiation of actin and myosin. G13-dependent MLC20 phosphorylation was confirmed in murine embryonic fibroblasts. After ovalbumin sensitization and challenges, wild type mice exhibited methacholine-induced bronchial contraction of lung tissue. Heterozygous absence of the G13 gene abrogated methacholine-induced contractions, whereas homozygous absence of the G12 gene failed to do so. Our findings indicate that G13, but not G12, specifically regulates cholinergic bronchial contraction in airway responsiveness via controlling phosphorylation of MLC20 by methacholine.Graphical abstractKeywords: Bronchiolar smooth muscle; Methacholine; G12 family; G13; MLC20Abbreviations: GPCRs, G-protein-coupled receptors; G-proteins, GTP-binding proteins; MEF, murine embryonic fibroblast; BSMC, bronchial smooth muscle cell; WT, wild type; KO, knockout; KD, knockdown; MLC, myosin light chain; PCR, polymerase chain reaction; SMA, smooth muscle actin; siRNA, small interference RNAArticle Outline1. Introduction 2. Materials and methods 2.1. Ovalbumin immunization 2.2. Airway responsiveness 2.3. Tracheal or bronchiolar contraction 2.4. Cell culture 2.5. Polymerase chain reaction 2.6. Immunoblot analysis 2.7. Small interference RNA (siRNA) knockdown 2.8. Measurement of Rho activity 2.9. Measurement of Ca2+ influx 2.10. Immunocytochemistry of myosin heavy chain 2.11. Histochemical analyses 2.12. Statistical analysis3. Results 3.1. Methacholine-dependent bronchiolar contraction 3.2. G13 regulation of methacholine-dependent MLC20 phosphorylation 3.3. G13-specific regulation of airway responsiveness 3.4. Histological alterations after ovalbumin sensitization4. Discussion Competing interests Acknowledgements Appendix A. Supplementary data ReferencesFig. 1.Methacholine contraction of tracheal or bronchiolar smooth muscle. (A) Genotyping by PCR. DNA extracted from mouse tail was amplified with the primers specific for wild type or G12/G13 gene. (B) Methacholine-dependen