（化学专业论文）蛋白质表面活性剂相互作用及酶催化反应的量热学研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 采用等温滴定量热法( i t c ) 研究了2 9 8 1 5 k - - 一3 1 8 1 5 k 温度范围内牛血清 白蛋白( b s a ) 与1 种阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠( s d s ) 和7 种阳离 子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 、十六烷基羟乙基二甲基溴化铵 ( c h d a b ) 、十六烷基二羟乙基甲基溴化铵( c d h a b ) 、十四烷基羟乙基二甲 基溴化铵( t h d a b ) 、十四烷基二羟乙基甲基溴化铵( t d h a b ) 、十二烷基羟 乙基二甲基溴化铵( d h d a b ) 和十二烷基二羟基甲基溴化铵( d d h a b ) 在 t r i s h c l 缓冲溶液( p h = 7 o ) 中的相互作用，由实验数据拟合出结合常数、结 合位点数以及热力学函数。结果表明：b s a 对s d s 、c t a b 、c h d a b 、c d h a b 、 t h d a b 及t d h a b 有两类结合位点，即高结合位点和低结合位点；高结合位 点是由表面活性剂的极性基团和蛋白质分子表面的氨基酸残基之间的静电作用 引起，有较高的结合常数，此过程为放热过程；低结合位点是表面活性剂的疏 水基团与蛋白质分子的疏水空腔的疏水作用造成的，有较低的结合常数，此过 程为吸热过程；b s a 与d h d a b 、d d h a b 只存在一个较高的结合位点。 b s a 与表面活性剂结合作用的g i b b s 自由能变均为负值，熵变均为正值。 结合常数随表面活性剂亲水头基个数的增加而减小，随温度升高而减小，相应 结合过程的焓变增大，熵变增大。对于高结合位点，结合常数随疏水碳链长度 的减小而减小；对于低结合位点，结合常数随疏水碳链长度的减小而增大，相 应的当碳链减小至c 1 2 时，低结合位点不明显，结合位点数可能只与碳链长度 有关，随亲水头基和温度变化不明显。 采用等温滴定量热法研究脲酶催化尿素的水解反应( 尿素浓度1 4 7 m m o l l ，脲酶浓度3 0 1 0 1m m o l l 一，p h = 7 0 磷酸缓冲溶液) 动力学，测定 了该反应在2 9 8 1 5 - - 一3 18 。1 5k 温度范围内的反应速率常数a l 和米氏常数等 动力学参数。结果表明：在实验条件下，脲酶催化尿素的水解反应符合m i c h a e l i s - - m e n t e n 机理；温度对砒的影响遵循阿累尼乌斯方程，表观活化能为1 6 6 k j m o l ；等温滴定量热法可有效地用于酶催化反应动力学参数的测定，是具有 应用前景的研究酶活性的方法。 采用等温滴定量热法尝试研究人体细胞色素c y p 3 a 4 ( 3 6 1 0 。7 m m 0 1 l d ) 催化药物2 - 氨基苯并咪唑和1 甲基2 氨基苯并咪唑( 5m m 0 1 l 。) 的催化反应 浙江大学硕士学位论文 ( p h = 7 4 磷酸缓冲溶液，31 0 1 5 k ) ，结果表明：在实验条件下，c y p 3 a 4 催化 药物反应放热量小，代谢作用不明显，与2 氨基苯并咪唑相比，1 甲基2 氨基 苯并咪唑与c y p 3 a 4 作用的放热量稍大，可能有一点的弱结合作用，即非特异 性结合作用，有待进一步研究。 关键词：等温滴定量热法；表面活性剂；b s a ：相互作用；酶；催化 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o no fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w i t ho n ea n i o n i cs u r f a c t a n t s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) a n ds e v e nc a t i o n i cs u r f a c t a n t sh e x a d e c y lt r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) ，n - c e t y l - h y d r o x y e t h y l d i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( c h d a b ) ，n - c e t y l d i h y d r o x y e t h y l m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e ( c d h a b ) ， n - t e t r a d e c y l h y d r o x y e t h y l d i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( t h d a b ) ，n - t e t r a d e c y l d i h y d r o x y e t h y l m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( t d h a b ) ，n - d o d e c y l - h y d r o x y e t h y l - - d i m e t h y la m m o n i u m b r o m i d e ( d h d a b ) ，n - d o d e c y l d i h y d r o x y e t h y l - m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( d d h a b ) ，i nt h et r i s - h c lb u f f e rs o l u t i o n sq h = 7 o ) h a sb e e n i n v e s t i g a t e db yi s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y ( i t c ) a t2 9 8 15t o318 15 k t h e b i n d i n gs i t en u m b e r , b i n d i n gc o n s t a n ta n dt h e r m o d y n a m i cf u n c t i o nc h a n g ew e r e o b t a i n e db yf i t t i n gt h ee x p e r i m e n t a ld a t a t h er e s u l t ss h o w ：t h e r ew e r et w oc l a s s e so f b i n d i n gs i t e s o nb s am o l e c u l e sw i t hs d s c t a b c h d a b c d h a b t h d a b t d h a b ，h i g ha f f i n i t ys i t ea n dl o wa f f i n i t ys i t e t h eh i ：g ha f f i n i t yb i n d i n gw e r e c a u s e db ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no fs u r f a c t a n th e a dg r o u p s 、i t hi o n i cs i t e so nt h e p r o t e i nm o l e c u l e s t h eb i n g i n gc o n s t a n ti sl a r g e ro nv a l u ea n dt h eb i n d i n gp r o c e s si s c h a r a c t e r i z e db ye x o t h e r m i ce n t h a l p yc h a n g e s t h el o w a f f i n i t yb i n d i n gw e r ed u et o t h eb i n d i n go fa l k y ic h a i n so ft h es u f f a c t a n tt oh y d r o p h o b i cc a v i t i e so ft h ep r o t e i n m o l e c u l e s t h eb i n d i n gc o n s t a n ti ss m a l l e ro nv a l u ea n dt h eb i n d i n gp r o c e s sc a u s e s p o s i t i v et h e r m a le f f e c t b u tt h eb i n d i n gb s a 、析t ld h d a b d d h a bo n l yh a so n e h i g hb i n d i n gs i t e t h eg i b b se n e r g yf o rt h eb s a b i n d i n gt os u r f a c t a n t sa r ea l ln e g a t i v e ，b u tt h e e n t r o p ye f f e c t sa r ep o s i t i v e t h eb i n d i n gc o n s t a n td e c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s eo ft h e n u m b e ro fh y d r o p h i l eg r o u p si nt h es u r f a c t a n t s ，w h i l eb e c o m e ss m a l l e r 、斫t ht h e i n c r e a s eo ft e m p e r a t u r e ，w h i c hw o u l dl e a dt oi n c r e a s eo fe n d o t h e r m i cc o n t r i b u t i o n a n dr e d u c t i o no fe x o t h e r m i cc o n t r i b u t i o na n de n t r o p y f o rt h eh i g ha f f i n i t ys i t e s ， b i n d i n gc o n s t a n t d e c r e a s e sw i t ht h ed e c r e a s eo ft h ea l k y lc h a i nl e n g hi nt h e s u r f a c t a n t s ，b u tf o rt h el o wa f f i n i t ys i t e s ，b i n d i n gc o n s t a n ti n c r e a s e sa n da r en o t d i s t i n c tw h e nt h ea l k y lc h m ni sd e d o c y l t h eb i n d i n gs i t e sa r er e l a t e dt ot h ea l k 姐 浙江大学硕士学位论文 c h a i nl e n g h ，n o tf o rt h en u m b e ro fh y d r o p h i l eg r o u p sa n dt e m p e r a t u r e i s o t h e r m a lt i t r a t i o n c a l o r i m e t r y ( i t c ) h a s b e e n u s e dt oo b s e r v et h e e n z y m e c a t a l y z e dh y d r o l y s i sr e a c t i o no fu r e a t w o k i n e t i cp a r a m e t e r s ，t h ee n z y m a t i c c o n v e r s i o nr a t ec o n s t a n t ，a t ，a n dt h em a i c h a e l i sc o n s t a n t ，k m ，f o rt h eu r e a ( 14 7 m m o l l 。1 ) u r e a s e ( 3 o xlo m m o l l 。1 ) e n z y m a t i cs y s t e mi ns o d i u mp h o s p h a t e b u f f e ra tp h7 0a t 弘( 2 9 8 15t o318 15 ) ka r ed e t e r m i n e df r o mt h ei s o t h e r m a l t i t r a t i o nc a l o r i m e t r ye x p e r i m e n t a ld a t a t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eu r e a s e - c a t a l y z e d r e a c t i o ni sw e l l a p p r o x i m a t e db yt h em i e h a e l i s m e n t e ne q u a t i o nu n d e rt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h ee f f e c to ft h et e m p e r a t u r eo nt h ev a r i a t i o no ft h ev a l u e s o f a tc a nb ec o r r e l a t e dq u a n t i t a t i v e l yt ot h ea r r h e n i u se q u a t i o nw i t ht h ea p p a r e n t a c t i v a t i o ne n e r g yo f16 6k j 。m o l 一t h er e s u l t ss h o wag o o de x a m p l eo fe f f e c t i v e l y e v a l u a t i n gk i n e t i cp a r a m e t e r sf o re n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o nb yi t c i ti ss u g g e s t e d t h a ti t cs h o u l db es u i t a b l ea n dh a v es i g n i f i c a n tp o t e n t i a lf o rt h ek i n e t i cs t u d yo f e n z y m ea c t i v i t y i s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y ( i t c ) h a sb e e nu s e dt oo b s e r v et h eh u m a n c y t o c h r o m e c y p 3 a 4 ( 3 6 10 m m o l l 以) c a t a l y z e d r e a c t i o no f a m i n o b e n z i m i d a z o l ea n d1 - m e t h y l a m i n o b e n z i m i d a z o l e ( 5m m o l l 。1 ) a t310 15 k ( p h = 7 4p bb u f f e r ) t h er e s u l t si n d i c a t e t h a tt h ee x o t h e r m i cc o n t r i b u t i o no f c y p 3 a 4c a t a l y z e di st o os m a l lc t m d e rt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，m e t a b o l i z i n g r e a c t i o n i s n o t d i s t i n c t ，t h e e x o t h e r m i c c o n t r i b u t i o no f 1 - m e t h y l a m i n o b e n z i m i d a z o l e c a t a l y z e db y c y p 3 a 4i s l a r g e t h a n a m i n o b e n z i m i d a z o l e ，b i n d i n gi n t e r a c t i o n ( n o n s p e c i f i cb i n d i n g ) i sl i k e l yt oo c c u r a n dw es h o u l dd ot h er e s e a r c hp r o f u n d i t y k e y w o r d s ：i s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y ( i t c ) ；s u r f a c t a n t s ；b s a ；i n t e r a c t i o n ； e n z y m e ；c a t a l y z e d 浙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江太堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名3 承鲅致签字日期 沁x 年f 月p 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解笾选盍堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝逛太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：窍乏醪。 ， 签字日期：脚6 年f 月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 9 3 导师签名： 签字日期：少一沙年 电话； 邮编： ，o 日 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在 导师指导下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学 系，受国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形 式公开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系 人，未经导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何 其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人完全 意识到本声明的法律责任由本人承担。 日期：年 学位论文作者签名 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 前言 表面活性剂，是指能显著降低溶剂( 一般为水) 的表面张力( 或界面张力) 、 改变体系表面或界面状态，从而产生一系列独特的物理化学性质的化合物。表面 活性剂【1 】是一种两亲分子，通常由非极性的疏水基团和极性的亲水基团分别处于 两端，形成不对称结构，疏水基团主要是碳氢长链，一般碳氢链结构不同，有一 定差异，一般包括直链烷基、支链烷基、烷基苯基、烷基萘基等，亲水基团种类 繁多，性质差异较大；表面活性剂可分为离子型( 包括阴离子型、阳离子型、两 性型) 和非离子型两大类。表面活性剂具有润湿或反润湿、乳化或破乳、起泡或 消泡、以及增溶等诸多作用，是洗涤剂、化妆品等日用化学工业的重要原料，也 可广泛运用于石油、煤炭、矿冶、机械、纺织、医药、环境等工农业生产中【2 1 。 蛋白质是一类重要的生物高分子，是生命科学的重要研究对象。从动植物各 种生命活动中，可以看到蛋白质在起着重要的作用。蛋白质是细胞的重要成分， 是生命的基本物质。它在生物体内的形式和作用是多样化的【3 j ，构成生物体的结 构物质( 如肌肉的蛋白质) 、调节生理功能的肽类激素、运输氧和二氧化碳以及传 递铁离子的载体( 如血红蛋白和铁载体蛋白) 、促进体内化学反应的生物催化剂( 称 酶) 、抵抗病菌的抗体等，其本质都是蛋白质。此外，谷类、豆类和其它植物种 子也都含有或多或少的蛋白质。总的来说，人类的生存离不开蛋白质，生命是蛋 白质的存在形式，没有蛋白质就没有生命现象。 蛋白质的基本结构单元是氨基酸，在蛋白质中出现的氨基酸共有2 0 种。氨 基酸以肽键相互连接，形成肽链。氨基酸分子数目、排列次序以及肽链数目和空 间结构的不同，形成的蛋白质的性质也就不同。蛋白质的分类方法有很多，依分 子形态可分为球状蛋白和纤维状蛋白；依溶解性可分为水溶性、盐溶性、酸和碱 溶性、醇溶性蛋白和硬蛋白；依化学组成可分为单一蛋白和结合蛋白；依生物功 能又可将其分为活性和非活性蛋白质。 蛋白质具有十分复杂的结构。这种复杂性与生物分子有序性的高度统一，集 中反映在蛋白质分子的结构具有丰富的层次。1 9 5 2 年林诺斯特伦朗首次使用一、 二、三级结构的名称来粗略划分蛋白质分子的化学和空间结构。后来在三级结构 以上又发展了四级结构，如图1 1 所示。随着科学技术的迅猛发展，蛋白质结构 浙江大学碗士学位论文 检测的研究方法也日新月异，主要有x 射线晶体衍射、核磁菸振技术、质谱、 计算机模拟合电子显微技术等等。 - - 3 ( p r i m a r ys t r u c t u r e ) ：是指多肽链的氨基酸残基的排列顺序，也是蛋 白质虽基本的结构。蛋白质的一级结构是一个无空间概念的一维结构，二硫键的 定位也是一级结构的重要内容； 二级结构( s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) ：是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具 有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构( 构象) ，它们是完整肽链构象的 结构单元，是蛋白质复杂的空间构象的基础，故也可称为“构象单元”。主要有 ( 1 - 螺旋( 廿h e l i x ) 、p - 折i i ( 1 3 - s h e e t ) 、p - 转角( p - t u m ) 和无规则卷曲几种形式； 三级结构( t e r t i a r ys t r u c t u r e ) ：主要针对球状蛋白质而言，它是指整条多肽链由 二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相 互关系，骨架和侧链在内的所有原于的空间排列。蛋白质特定的空间构象由氢键、 离子键、偶极与偶极间的相互作用、疏水作用等作用力维持，疏水作用是主要的 作用力； 四级结构( q u a t e r n a r ys t r u c t u r e ) ：是指在亚基和亚基之间通过疏水作用等次级 键结合成为有序排列的特定的空间结构。它被看作是蛋白质一级、二级和三级结 构的延伸，主要涉及亚基种类和数目以及各亚基或原聚体在整个分子中的空问排 布，包括亚基间的接触位点和作用力； ? 驾裟“一“一崔：富“”“镕拘b = # 熟誊 罔1 1 蛋质结构不意幽 f i g 1 1p l o to fs t r u c t u r eo f p r o t e i n 多年来对蛋白质的组成、结构及其与小分子相互作用的研究以及生命现象 浙江大学硕士学位论文 的进一步探索，一直是科学工作者倍感兴趣的研究课题。蛋白质可以与许多小分 子配体相结合，这些配体可以是金属离子、染料探针，也可以是药物、胆红素， 还可以是表面活性剂等两亲分子。 表面活性剂和蛋白质的相互作用的特性被广泛应用，如食品、化工、制药等 领域的生化反应和分离过程中，如反胶团萃取、泡沫分离、蛋白质复性和有机相 酶催化【4 。1 1 】等。蛋白质和表面活性剂的相互作用的研究是长期以来的一个研究重 点，蛋白质与表面活性剂的复合物结构的研究，界面的竞争吸附相互作用【1 2 。4 1 ， 静电引力、亲水疏水力起到了增溶、置换作用，同时也促进蛋白质与表面活性剂 结合过程中的构象转换，结构转变。由于表面活性剂的种类、浓度和环境不同， 可以起到稳定或者破坏蛋白质结构的效果，改变蛋白质的功能【l 孓1 6 1 。 血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质，一般由一条单独的氨基酸多肽链 构成，其三级结构主要为a 一螺旋结构，其中包含3 个结构域【1 7 1 8 】，即s i t ei 、 s i t ei i 和s i t e l i i 。其中s i t ei 和s i t ei i 两个结构域【1 9 。2 1 1 与许多小分子化合物具有较 强结合能力，能储存和转运内源性物质和外源性物质，可与许多化学物质( 如脂 肪酸、氨基酸、激素、药物及污染毒物等) 以不同方式结合，并携带着这些物质 通过血液在体内进行转运、运输、分配和代谢。由于血清白蛋白具有重要的生理 意义和临床意义，且易于分离、提纯常被作为模型球蛋白来研究。 牛血清白蛋1 2 2 - 2 3 1 ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 血浆含量为3 8 9 1 0 0 m l ， 分子量6 8 k d 。等电点4 8 。含氮量1 6 ，含糖量o 0 8 ，仅含已糖和已糖胺，含 脂量只有0 2 。b s a 由5 8 1 个氨基酸残基组成，其中3 5 个半胱氨酸组成1 7 个 二硫键，在肽链的第3 4 位有一个自由巯基，其中二硫键中有8 对组成交叉二硫 键，只有接近n 端的是一个单个二硫键。b s a 可与多种阳离子、阴离子和其他 小分子物质结合，在血液中的主要起维持渗透压作用、p h 缓冲作用、载体作用 和营养作用等。 1 2 表面活性剂与蛋白质相互作用的研究进展 由于表面活性剂与聚合物，特别是与水溶性聚合物混合体系表现出单一表面 活性剂体系或者聚合物体系所不具有的奇特性质2 4 1 ，因此，表面活性剂与聚合物 之间的相互作用、表面活性剂与聚合物复配体系形成的有序聚集体的研究也受到 浙江大学硕士学位论文 越来越多的重视，其研究领域不断拓宽，研究深度不断深化；而且水溶性聚合物 特别是聚电解质与表面活性剂相互作用近年来深受众多研究者的关注，因为它与 两亲分子自组装及生命科学中很多现象有关。 蛋白质实质上也是一类带有疏水基的两性聚电解质，因此蛋白质一表面活性 剂混合体系实际上属于表面活性剂一聚合物体系的一种。人们对表面活性剂与聚 合物之间相互作用的研究起源于生物化学中蛋白质与表面活性剂之间的相互作 用，早在二十世纪初人们就己经开始研究天然大分子蛋白质和天然脂类分子的聚 集；后来四、五十年代又对蛋白质与合成表面活性剂体系进行了较为广泛的研究， 发现了由于蛋白质与阴离子型表面活性剂的相互作用导致体系表现出许多独特 的性质，随后对蛋白质和表面活性剂相互作用的研究也越来越多。蛋白质一表面 活性剂混合体系在药物、化妆品、生物及食品等诸多领域中具有广泛而重要的应 用【2 引。例如，人发和羊毛就是经常暴露于表面活性剂中的两种蛋白质底物；表面 活性剂对皮肤的刺激作用就是表面活性剂与皮肤角质层中角质蛋白发生作用的 结果；一些食品配方中常常同时含有蛋白质和表面活性剂。 但是蛋白质又是一类具有特殊结构的两性聚电解质，存在等电点，随着溶液 p h 的不同，分子的荷电性质发生很大变化；尤其是蛋白质具有二级和三级结构， 明显不同于其它类型的聚电解质，因此，蛋白质与表面活性剂的相互作用又具有 许多独特之处，而且更为复杂。这种复杂的相互作用能导致蛋白质的构象发生变 化，甚至导致蛋白质变性。 随着现代科学技术的不断发展，表面活性剂与蛋白质相互作用的研究方法日 益完善，表面活性剂对蛋白质性能的影响、蛋白质存在时表面活性剂的界面活性 和体相聚集行为的变化规律以及表面活性剂在蛋白质大分子上的结合机理，主要 涉及蛋白质和离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂的相互作用，表面活性剂 类型不同，它们之间的作用方式也不相同【2 6 】，最重要的相互作用是静电作用和疏 水作用，如图1 2 所示。 4 鼙m 由l 搴 扑e b “艇作月 4 班自成目矗十d 巍话性剂相互作甩 箩一黪 稿$ f t 删 珥水佧用 b 量自厦# 非膏予世衰话性抑的相互作用 图1 2 不同类型表面活性剂与蛋白质的作用方式 f i g 1 2 t h e t y p e so f i n t e r a c t i o n b e t w e e ns u r f a e t a n t a n dp r o t e i n 1 2 1 表面活性剂一蛋白质混合体系体相性质的研究 蛋白质一表面活性剂混合体系体相性质的研究涉及很多方面且较为复杂，通 过溶液微环境、蛋白质构象、水动力学半径、热力学参数、聚集数及结合量的测 定等等，可以推断出蛋白质和表面活性剂相互作用的本质、体系相行为的变化以 及蛋白质一表面活性剂形成复合物的结构模型。 结合等温线是研究表面活性剂一蛋白质相互作用最常用的方法之一。它是蛋 白质与表面活性剂相互作用及其结合程度的直观反映，并体现出了二者相互作用 的特征。研究方法大多采用平衡渗析、表面活性剂选择性膜电极和表面张力等温 线测定等。图1 3 是典型的表面活性剂与蛋白质的结合等温线，它显示了以游离 的表面活性剂浓度的对数为函数关系，平均每个蛋白质分子上结合的表面活性剂 数目。随着表面活性剂浓度的增加，结合等温线通常分为四个区域2 7 l ：( a ) 特定 结合( s p e e i f i eb i n d i n g ) ，即表面活性荆结合在蛋白质的高亲和位；( b ) 非协同作用 结合( n o n - c o o p e r a t i v eb i n d i n g ) 即高能位全部被结合后，产生沉淀；( c ) 协同作用 结舍( c o o p e r a t i v e b 砌血曲，沉淀又被溶解，在该区域发生蛋白质分子的伸展或去 折叠，导致更多的结合位暴露及大量表面活性剂分子的结合；( d ) 结合饱和 ( s a t u r a t i o n ) ，溶液中开始形成表面活性剂的自由胶束。 渐江大学碰十学位论文 图1 3 表面活性剂与蛋白质的结合等温线 f i g 1 3p l o to ft h en u m b e ro fb o u n ds u r f a c t a n t sp e rp r o t e i nm o l e c u l e ( v 、a saf u n c t i o no f l o g a r i t h mo f t h ef r e es u r f a c t a n t sc o n c e n t r a t i o n 表面活性剂一蛋白质复合物结构的研究早期基于聚合物和表面活性剂相互 作用研究基础，提出蛋白质一表面活性剂复合物的结构与聚合物一表面活性剂复 合物一样存在3 种结构模型陋圳：项链模型、棒状模型和柔软的螺旋状模型，如 图i4 所示。 鳓 ( 4 1 项链幔 c = = = 互二= 【b ) 摊状艇 c ) 蠕艇桃* 图1 4 聚台物一表面活性剂复台物结构示意固 f i g1 4 p r o p o s e ds t r u c t u r e o f p r o t e i n s u r f a e t a n tc o m p l e x e s n i c h o l a s 等f 3 1 1 采用芘为探针，运用稳卷荧光技术分别测定含有与不含有b s a ( 阡t s a - i ) 创js d s 溶液的荧光发射光谱，由不同条件下第三峰与第一峰强度的比 浙江大学硕士学位论文 值( 1 3 1 1 ) 随s d s 浓度的变化，推断出复合物的结构符合“项链”状模型。同时， 通过测定芘的基激缔合物衰减曲线求得聚集体的聚集数，进一步证实“项链”状 模型的存在。 n i c h o l a s 等【3 1 1 采用h 1 n m r 技术对亲水基0 【碳氘代s d s ( 1 ，1 2 h 2 s d s ) f c l j 黾 基碳氘代s d s ( c 1 2 2 h 1 2 0 s 0 3 n a ) 两种表面活性剂与蛋白质形成的复合物进行了测 定。结果表明，形成复合物后，表面活性剂头基的移动性减弱而尾基移动性不变。 由此说明，复合物形成后将表面活性剂的头基包裹起来。项链状模型结构为图 1 5 中( a ) 所示。 m a r i l e n a 等吲用荧光技术系统地研究了球形蛋白分别与阴离子型、阳离子型 和非离子型表面活性剂所形成的复合物的结构。实验结果支持了复合物为项链状 结构的结论，如图1 5 。 l 蛋白质龟囊着驳束鳓股柬成接警蛋自j 藐酶藏球位上 图1 5 项链复合物可能的结构示意图 f i g 1 5t w op o s s i b l e “n e c k l a c ea n db e a ds t r u c t u r e s o fp r o t e i n - s u r f a c t a n tc o m p l e x e s 随着n m r 、光散射、荧光和电子自旋共振( e s r ) 技术等的应用，对复合物 的结构和结合过程有了更深入的认识。同时，表面活性剂对蛋白质结构的影响也 进行了一定的研究【2 9 。们。 1 2 2 表面活性剂一蛋白质混合体系的界面吸附 蛋白质一表面活性剂体系相互作用的研究多集中于蛋白质与离子型表面活 性剂。早期的理论认为非离子型表面活性剂与蛋白质问由于缺乏静电引力而不能 发生相互作用。但近来的研究表明非离子型表面活性剂与蛋白质也存在相互作 用，这种作用极大地影响吸附层的性质，对乳液的稳定性尤为重要。因此，蛋白 质与表面活性剂在界面吸附的研究逐渐引起了人们的注意【3 3 。5 1 。 蛋白质一非离子表面活性剂混合体系的界面行为与蛋白质一离子型表面活 7 浙江大学硕士学位论文 性剂显著不同。图1 6 示出了非离子型表面活性剂与蛋白质在界面上的作用方式： 一方面，蛋白质与非离子型表面活性剂通过疏水力发生相互作用，从而使蛋白质 亲水性增加，活性降低；另一方面，由于蛋白质分子复合结构的体积增大。使界 面膜的紧密性下降，界面膜的强度降低。当表面活性剂的质量分数进一步增大时， 表面活性剂可将复合物置换下来，最后界面主要由表面活性剂所组成。 辨= 堞 图1 6 蛋白质一非离子表面活性剂在界面上的吸附 f i g 1 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h ea b s o r p t i o no fp r o t e i n - n o n i o n i es u r f a c t a n ts y s t e mi n t h eo i l - w a t e ri n t e r f a c e d i c k i n s i o n 3 6 。3 7 】在总结大量实验事实的基础上提出了蛋白质一表面活性剂混 合体系界面吸附的2 种机理： ( 1 ) 增溶机理。分散在表面的蛋白质分子与水溶性的表面活性剂形成蛋白质 一表面活性剂复合物，从而使蛋白质分子以复合物的形式进入水相。此时，表面 活性剂与被吸附的蛋白质有强烈的相互作用。 ( 2 ) 置换机理。由于表面活性剂与表面的相面上分散的蛋白质被表面活性剂 置换下来。此时，表面活性剂必须强烈地吸附于表面。 一般离子型表面活性剂与蛋白质混合体系是增溶机理，而非离子型表面活性 剂与蛋白质的混合体系主要是置换机理。 蛋白质与表面活性剂相互作用的研究从最初的以提取蛋白质为目的向更高 的目标发展。酶作为一种具有生物活性的蛋白质在表面活性剂的反胶束溶液中所 表现出来的生物活性，给蛋白质一表面活性剂的研究又注入了新的内容。生命物 质如蛋白质、核酸和d n a 等与表面活性剂相互作用的研究都会为表面活性剂的 发展带来新的契机。同时，新型表面活性剂的不断出现和应用也为这一领域的发 展创造了更大的空间，近几年含氟表面活性剂与蛋白质的研究得到很大的发展。 因此，表面活性剂与蛋白质的相互作用的研究不仅具有重要的理论意义，而且具 有极大的应用价值。 浙江大学硕士学位论文 1 3 研究蛋白质与表面活性剂的相互作用的研究方法 研究表面活性剂与蛋白质相互作用的方法很多p 8 彤】，最早使用的有表面张 力、电导、离子选择性电极和粘度法等，目前研究最多、应用最广的有光散射、 光谱法以及新发展起来的小角x 射线散射、小角中子散射、b r e w s t e r 角显微镜、 圆二色谱法、电子自旋共振光谱法、量热法等方法。 1 3 1 紫外吸收光谱 蛋白质之所以能产生紫外吸收光谱，其主要原因是色氨酸( t r p ) 和酪氨酸( t y d 残基的侧链基团对光的吸收，其次是苯丙氨酸( p h e ) 、组氨酸( h i s ) 、半胱氨酸( c y s ) 残基的侧链基团对光的吸收，此外还有肽键对光的强烈吸收。其中，t r p 、t y r 、 p h e3 个残基，由于其生色基团的不同而有不同的紫外吸收光谱。t r p 和t y r 在 2 8 0n n l 波长附近有一个吸收峰；p h e 在2 5 7n n l 波长附近有一个吸收峰；肽键在2 2 5 n l t l 波长附近给出一个特征吸收峰。当向蛋白质溶液中加入表而活性剂后，往往 导致蛋白质生色基团紫外吸收光谱的变化【5 4 巧5 1 ，据此便可了解氨基酸残基微环境 的变化，从而推断蛋白质分子在溶液中的构象变化。 p o m b o 等【5 6 】通过紫外吸收光谱研究t 2 5 。c 、p h = 1 0 0 时阳离子表而活性剂， n 一烷基( c 1 0 - - 。c 1 6 ) - - 甲基溴化铵诱导牛胰岛素构象的变化。以2 7 5n l t l 处的吸光度 与表面活性剂浓度绘图求得了n - 烷基三甲基溴化铵一牛胰岛素复合物在水中的 g i b b s 自由能变化( g w ) 和疏水环境中g i b b s 自由能变化( g i l 。) 。实验结果研究 表明，g w 值为( “8 1 8 ) g j m o l 一，该值与烷基链的长度无关并且与n 烷基( c l o c 1 6 ) 硫酸盐牛胰岛素复合物的g w 数值5 3 】接近。由此可以推断，两类表面活 性剂诱导牛胰岛素构象变化的机理类似；当链长从c 1 0 增加到c 1 6 时，g l l 。从8 8 k j m o l 。1 降低到1 0 0 k j m o l 。而从瓯。对n 烷基三甲基溴化铵的烷基链长和n 烷基硫酸盐的烷基链长作图所得的两条曲线基本重合可知，g i l 。与表而活性剂 头基的性质无关。通过g h 。的变化趋势可以断定牛胰岛素分子上所带的正、负 电荷密度基本相同( 牛胰岛素分子含有6 个阳离子氨基酸残基和6 个阴离子氨基酸 残基) 。 9 浙江大学硕士学位论文 1 3 2 荧光光谱 荧光光谱技术在表面活性剂与蛋向质相互作用研究中的作用已经有大量报 道 5 8 - 6 5 】。通过荧光光谱不仅可以测量胶束的聚集数，体系的微极性和微粘度，还 可以研究表而活性剂与蛋白质的结合常数等。常见的方法有内源荧光、外源荧光 和非辐射能量转移等。 1 3 2 1 内源荧光 蛋白质分子中的t r p 、t y r 和p h e 残基能够吸收2 7 0 3 0 0n l n 的紫外光而发出紫 外荧光。t r p 、t y r 和p h e 由于其侧链生色基团不同而产生不同的荧光光谱，其荧 光峰( k 瓤) 分别位于3 4 8 、3 0 3 和2 8 2n 1 ，其中，t r p 的荧光强度最大，p h e 的荧光 强度最小。因此蛋白质的内源荧光主要是由t r p 和t y r 残基所发射。当蛋白质溶液 中加入表面活性剂时，表而活性剂和蛋白质之间的相互作用会导致蛋白质荧光的 猝灭，利用此猝灭现象可以确定蛋白质的荧光猝灭机理以及它们的结合常数等。 荧光猝灭作用可分为动态猝灭和静态猝灭作用，可分别用动态猝灭常数凰v ( 即 s t e m v o l m e r 猝灭常数) 和静态猝灭结合常数鼠b 来描述荧光物质分子与猝灭剂分 子之问相互作用的程度和猝火作用的性质。 l i s s i 等【6 6 】通过内源荧光的测定研究了牛血清蛋白( b s a ) 和烷基吡啶盐的相 互作用，得到了烷基毗啶盐碳链长度对b s a 内源荧光猝灭的影响规律。八烷基吡 啶盐对b s a 的荧光猝灭严格遵循动态猝灭方程f o f = i + k q t 0 c q = l 坻v c o ( 其中凡 是为未加猝灭剂时荧光分子的荧光强度，为猝火剂浓度为c o 时荧光物质的荧光 强度，k q 为双分子猝灭过程的速率常数，1 0 为不含猝灭剂时荧光分子的平均寿命， 憨v 是s t e m v o l m e r 猝火常数，即双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比 率) ，在水溶液中并i 8 m o l l - 1 尿素存在时其动态猝火常数分别为3 1 0 和2 8 0m o l l l 。 十二烷基吡啶盐和十六烷基吡啶盐是b s a 的有效猝灭剂，其动态猝灭曲线向上弯 曲，说明体系同时存在动态和静态猝灭。由烷基吡啶盐在b s a 上的结合常数变化 推断，它们之问的相互作用主要是疏水力所致，静电相互作用是次要的。 1 3 2 2 外源荧光 对于蛋白质的研究不仅可以利用其内源荧光，而且可以通过外源荧光性质研 l