蛹虫草固体培养基中虫草多糖、虫草素提取分离工艺研究优秀毕业论文 可复制黏贴.pdf

工 领域： 作者姓名： 指导教师： 企业导师： 天津大学研究生院 2 0 0 6 年1 月 鞫幽 中文摘要 固体培养方式目前已被广泛用于蛹虫草的培养，蛹虫草固体培养基中富含菌丝， 但因没有成熟的工艺对其中的有效成份进行提取分离，目前在培养结束后固体培养基 都被作为废物弃掉，不仅造成资源的浪费，对环境也造成一定的影响。随着蛹虫草培 养产业规模的不断扩大，对蛹虫草固体培养基如何加工、利用已成为一个迫切需要解 决的问题。 本文根据蛹虫草固体培养基有效成份的理化性质，以蛹虫草固体培养基为原料，对 影响有效成份提取的工艺条件进行了研究，通过对提取温度、提取次数、提取时间、 料液比应用正交实验设计，最终确定用水8 0 。c 提取三次，1 2 0 m i n 次，料液比为1 ：1 5 的工艺条件为虫草多糖最佳提取工艺条件，并分别采用s e v a g e 法、改良的s e v a g e 法 和澄清剂法去除虫草多糖粗品中蛋白，以及d e a e 纤维素和葡聚糖凝胶柱层析对虫草多 糖进行分离纯化。通过对溶剂浓度、提取次数、提取时间、料液比进行正交实验设计， 最终确定用7 5 7 , 醇超声波提取三次，4 0 m i n 次，料液比为i ：2 0 的工艺条件为虫草素 最佳提取工艺条件，并分别采用阴、阳离子交换树脂柱层析和硅胶柱层析对虫草素进 行分离纯化。通过采用苯酚一硫酸法和h p l c 对提取出的虫草多糖和虫草素进行含量测 定，确定了不同纯化方法之间的差异。 对虫草多糖和虫草素提取的工艺条件和路线进行分析，结合生产实际，在小试确定 的提取、纯化方法基础上进行以蛹虫草固体培养基为原料提取虫草多糖和虫草素的放大 实验，确定了综合提取的工艺条件和路线，即采用热水回流提取法进行初提，用醇沉法 分离虫草多糖并以s e v a g e 法除蛋白；以乙醚萃取，用阴离子交换树脂层析法分离、纯化 虫草素的工艺路线。经测定，除蛋白后的虫草多糖的纯度均大于5 0 ，虫草素精品的纯 度均大于9 7 。 本课题来源于生产实际，研究结论为相关企业对蛹虫草固体培养基的加工、利用提 供了技术依据。 关键词：蛹虫草固体培养基；虫草多糖；虫草素；提取分离；纯化 a b s t r a c t s o l i dm e d i u mm e t h o dh a sb e e ni m p l e m e n t e dw i d e l yi nt h ec u l t u r e 丘e l do fc o r d y c e p s m i l i t a r i s ml i n ki nr e c e n ty e a r s ，t h e r ea l el a r g ea m o u n to fm y c e l i u m sg r o wi nt h e5 0 l i d c u l t u r em e d i u mi nc u l t i v a t i n gp r o c e s s b u tf o rt h e r en os y s t e m i cp c o c c s st o 麟n a c tt h ea c t i v e e 翘n p o n e n t so f t h ec u l t u r em e d i u m , m o s to f t h e ma r eb e i n gr o c c t e df o rw a s t e , i tl e a dt ot h e w a s t eo fr e s o u r o e a n dt h r e a tt h ee n v i r o n m e n ts y n c h r o n o u s l y , b yt h ed e v e l o p m e n to f c o r d y c e p sm i l i t a r i s ml i n kc u l t i v a t i n gd o m a i n , i t sb e c a m eu r g e n t l yt op r o c e s st h es o l i d c u l t u r em e d i u mo f c o r d y c e p sm i l i t a r i s ml i n k f o c u so nd e v e l o p i n gs o l i dc u l t u r em e d i u mo fc o r d y c e p sm i l i t a r i s ml i n ka n dd i f f e r e n t p h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so ft h ea c t i v ec o m p o n e n t s , p r o c e s sc o n d i t i o n sw h i c h i n f l u e n c i n gt h ee x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o nw e r es t u d i e d o r t h o g o n a ld e s i g nw a sb eu s e dt o a s s 嚣st h ei n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r e , t i m e s c y c l et i m ea n dr a t i oo ft h el a wm a t e r i a la n d w a t e r , f i n a lo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o re x t r a c t i n ge x o p o l y s a c c h a r i d ew a se s t a b l i s h e d , e x t r a c t e d3t i m e sb y1 5t i m e so fw a t e r , a n de x t r a c t1 2 0r a i n se a c ht i m eo n8 0 0 cf u r t h e r s e w a g em e t h o d , d e v e l o p e ds e v a g em e t h o da n dc l a r i f i e rm e t h o dw e r eu s e dt os e p a r a t et h e p r o t e i n , d e a ec e l l u l o s ec h r o m a t o g r a p ha n dp o l y s a c c h m j dg e l a t i nc h r o m a t o g r a p hw e r e e x p e r i m e n t e d t op u f f ye x o p o l y s a c c h a r i d e f o c u so nr e s e a r c ht h eo p t i m i z e dp r o c e s s c o n d i t i o n st oe x t r a c tc o r d y c e p i n , o r t h o g o n a ld e s i g nw a sa l s ob eu s e dt oa s s e s st h ei n f l u e n c e o ft h ec o n c e n t r a t i o ne t h a n o l ，c x t r a e t i n gt i m e s ，c y c l et i m ea n dt h er a t i oo ft h el a wm a t e r i a l a n ds o l v e n t , f i n a l l ye x c e l l e n te x t r a c t i o np r o c e s sc o n d i t i o no fc o r d y c e p i nw a se s t a b l i s h e d , u s i n gu l t r a s o n i ct oe x t r a c t3t i m e si n2 0t i m e so f7 5 e t h a n o ls o l u t i o i l ，a n dl a s t4 0m i r a e a c ht i m e ，f u r t h e ri o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p ha n ds i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p hw e r eu s e dt o p u r i f yc o r d y c o p i mp u r i f i c a t i o na n a l y s i so ne x o p o l y s a c c h a r i d ea n dc o r d y c e p i nh a da l s ob e e n l a u n c h e dr e s p e c t i v e l y , p h e n o l s u l f u r i ca c i dm e t h o da n dh p l cw o f u s e dt oq u a l i f i e dt h e d i f f e r e n c eo f s e v e r a lp u r i f y i n gp r o c e s s s ， b a s e do nt h er e s u l t so ft h el a br e s e a r c h e s ，f o c u so nt h es y n t h e t i c a l l ye x t r a c t i o no f e x o p o l y s a c c h a r i d ea n dc o r d y c o p i n s o l i dc u l t u r em e d i u mo fc o r d y c e p sm i l i t a r i s m l i n k ，t h r e ee n l a r g e db a t c he x p e r i m e n t sw e r ev a l i d e dt o e x t r a c te x o p o l y s a c c h a r i d ea n d c o r d y c e p i n , t h ep r o c e s sc o n d i t i o na n dr o u t ew e r ec s t a b l i s h e d ，t h em u t ei s ，c i r c u m f l u e n c e p r e - e x t r a e t i o nb yw a t e r , d e p o s i te x o p o l y s a c c h a r i d eb ye t h a n o la n ds e p a r a t ep r o t e i nb y s e v a g em e t h o d ，e x t r a c t i o na n dp u r i f yc o r d y c e p i nb ya e t h e ra n dn e g a t i v ei o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h t h ep u r i f i c a t i o no fe x o p o l y s a c c h a r i d e ( p r o t e i ns e p a r a t e d ) a r eb e y o n d5 0 a n dc o n t e n to f p u r i f i e dc o r d y c o p i nw e r eb e y o n d9 7 t l l i ss t u d yc o m e sf r o mt h ep r a c t i c eo ft h ec u l t u r ef i e l df o rc o r d y c e p sm i l i t a r i s ml i n k , t h er e s u l t sw o l l l db ep r o u d e da st e c h n i c a ls u p p o r tf o rr e l a t i v ee n t e r p r i s e s k e y w o r d s ：s o l i dc u l t u r em e d i u mo fc o r d y c e p sm i l i t a r i s ml i n k , e x o p o l y s u c c h a r i d e ， c o m y c p i n , e x t r a c t i o n , p u r i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：口口f 年工月刀日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨叠盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 签字日期：声z 年1 月1 日 导师躲丸匏 签字日期文弼年莎廖7 日 刖置 蛹虫草是一种名贵的中药和高级滋补品。性味甘平，益肺肾，补精髓，止血化痰， 用于肺结核、老人虚弱、贫血虚弱等，具有重要的药用价值。因近年来国内外市场对蛹 虫革需求的增加，导致对野生蛹虫草开采过度，目前野生资源已十分匮乏。为了满足社 会需求，近年来，对人工蛹虫草的培养研究及其提取产物的研究与开发日益重视。并已 取得了很大的进展。 在人工培养蛹虫草的起初阶段，采用的寄生体多为家蚕、蜱蛹等，近几年来蛹虫草 的体外培植技术发展迅速，主要有液体发酵方式和以大米为基质的固体培养方式等。因 蛹虫草固体培养方式所需投资较小、简便易行，因此目前已在国内许多地区得到应用。 同时国内对于蛹虫草液体培养过程中虫草多糖与虫草素等成份的提取也已进行了较深 。入的研究，但对于蛹虫草固体培养过程中的附属产物富含菌丝体的固体培养基，还没 有进行系统的研究和利用，固体培养基目前仍当作废物弃掉，造成资源的浪费。 着眼于充分利用资源，本论文以蛹虫革固体培养基( 陕西泾阳食药用菌研究基地提 供) 作为研究对象，采用正交试验设计等方法对利用蛹虫草固体培养基提取虫草多糖与 虫草素的各种工艺条件进行分析并确定出可行的提取方法，并根据虫草多糖与虫草素的 分子量和化学性质的不同，经柱层析等方式使其得到分离纯化和鉴定。并依据实验室研 究结论，分析虫草多糖与虫草素综合提取所需的工艺条件，进行综合提取虫草多糖与虫 草素的放大实验，为从蛹虫草固体培养基中分离、提纯虫草多糖与虫草素的工业化生产 提供依据及工艺路线。 目前，随着生活节奏的加快和思想观念的转变，人们越来越注重自身保健，虫草多 糖具有抗肿瘤、降糖、抗肝纤维化及提高免疫功能，虫草素具有抗菌，消炎、抗氧化、 调节人体内分泌和增强人体免疫功能等显著作用，虫草素、虫草多糖等蛹虫草成份提取 物在医药市场的前景良好。同时随着人工培养蛹虫草产业规模的不断扩大，企业对于如 何将培养过程中的产物变废为宝、提高投入产出比的需求越来越迫切，因此该研究课题 具有良好的市场基础和开发前景，其产业化必然会带来良好的社会效益、经济效益和环 境效益。 第一章文献综述 第一章文献综述 蛹虫草 c o r d y c e p sm i l i t a r l s ( l f r ) l i n k ，别名北冬虫夏草，属于真菌门( g u s y c o t a ) 、 子囊菌纲( 4 s c o m y c o t i n a ) 、肉座目( c l a v i d p i 船l e s ) 、麦角菌科( c l a v i c i p i t a c e a e ) 、虫草属 ( c o r c e p s ) 。国内外学者认为蛹虫草的无性阶段是头抱菌( c e p h a l o s p o r i u m ) 或拟青霉 ( p a e c i l o m y c e s ) 在我国，蛹虫草主要生长在吉林、辽宁、河北、陕西、广西、广东、云 南、四川、贵州、湖北、湖南等省区【l 】。 虫草菌是药用真菌的一个大类，其种类较多，世界上报道的有3 5 0 多种，而截止到1 9 9 3 年共报道了中国产虫草属已有6 0 多种，主要包括冬虫夏草，完全型的其他属虫草， 不完全型的虫草( 蝉花、蜘蛛棒囊霉、长虫草等) ：冬虫夏草别名虫草、冬虫草、夏草冬虫， 隶属真菌门、子囊菌纲、肉座菌且、麦角菌科，虫草属。是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙 蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾幼虫上所形成子座( 即草部分) 与菌核( 即昆虫的尸体部分) - - 部分的复合体，经干燥而得，故简称虫草。冬虫夏草多集中分布于土地排水良好的向阳 丘或丘顶之上，坡度在1 5 3 0 0 之间，地形为丘状高原、高山地区。海拔在3 5 0 0 - 4 7 0 0 m 左 右，地面常有1 0 - 2 0 c m 的草根盘结层。土壤是冬虫夏草及其寄主虫的重要生活场所之一。 其寄主主要是虫草蝙蝠蛾的幼虫，多分布在高原草甸土中，其土壤草根盘结层发达而紧 密，常超过2 0 e m 厚。土壤结构多为石砾或粉状小块及碎屑结构质地为砂壤或轻壤土。由 于冬虫夏草严格的寄生性及特殊的生长地理环境，产量非常有限，近年来我国一直致力 于虫草代用品的开发。蛹虫草为寄生于夜蛾科幼虫体内而形成的干燥虫体及子座，又被 称为北革虫或武氏虫草，新华本草纲要记载性平，味甘，有益肾，补精髓，止血化 痰”。蛹虫草产地广，所含药用成分和多种药效可与虫草媲美。蛹虫草性味甘平，益肺肾， 补精髓，止血化痰，用于肺结核、老人虚弱、贫血虚弱等，是种名贵的中药和高级滋 补品。具有极高的医药经济价值。主要成分有：虫草多糖、甘露醇( 也称虫草酸) 、虫草素、 腺嘌呤、尿嘧啶、p 谷甾醇、麦古甾醇、生物碱、多种氨基酸、无机盐和维生素等。其 中虫草素、虫草多糖是蛹虫草的重要组成部分。 1 1 蛹虫草中的化学成分 1 1 1 虫草多糖类 虫草属真菌的子座、僵虫体、菌丝体及发酵液中均含有多糖，李晓明等对虫草菌发 酵液中多糖研究表明，其组分摩尔比为甘露糖：半乳糖：葡萄糖= 1 1 5 ：0 8 5 ：1 【2 】m i y a z a l d 等 研究发现冬虫夏草子座经热水提取的水溶胜胞外多糖c s 1 ，是一种高分支半乳甘露聚糖， 由含甘露糖原和含有分支的半乳糖低聚物组成【3 】删0 得另一种多糖c t - 4 n ，分子质量 为2 3 0 0 0d a ，是一种含少量蛋白质的半乳甘露聚糖【4 】。y a m a 瞄人从大团囊虫草中得到 2 第一章文献综述 的一种水溶性葡聚糖c o 1 ，分子质量为4 1 2 0 0 0d a ，由( 1 3 ) 连接的p n 吡喃葡萄糖组成 骨架【5 ) 。蛹虫草菌丝体培养液中提取的水溶性粗多糖经分离纯化，得到一种含有少量蛋 白的半乳甘露聚糖c m - i ，分子质量为2 7 0 0 0d a ，糖组成摩尔比为半乳糖：甘露糖- - 6 ：5 嘲。 1 1 2 氨基酸类、糖醇和甾醇类 不论是天然虫草还是人工虫草菌丝，均含有丰富的氨基酸。张甲生等人的研究结果 显示，柞、桑蛹虫草与冬虫夏草3 种虫草中1 7 种游离氨基酸总量分别为每1 0 0 克中含有 4 2 5 5 7 m g ，1 6 0 8 5m g 和1 8 7 5 5n a g ，比王浆高1 9 6 8 倍，其中1 1 种人体必需、半必需氨基 酸和l o 种药用氨基酸含量较耐7 1 。蛹虫草含有1 8 种氨基酸，种类齐全，且含量很高，每 1 0 0 克中总量可达1 1 1 4 5m g 。每种氨基酸含量也较高，最高的是谷氨酸和天门冬氨酸，其 中人体必需的8 种氨基酸含量较高，比例适当嗍。 1 9 5 7 年c h a t c r i j c c 等报道从中国虫草分到甘露醇m 锄丑i t 0 1 ) 例，冬虫夏草虫草酸( 即m 甘露醇) 的含量大约为7 2 9 【l o 】，不同生长期的冬虫夏草子座中甘露醇的含量不样。 从冬虫夏草及人工虫草发酵物中共分离鉴定到9 个甾醇及其衍生物，其中包括麦角甾醇、 麦角甾醇过氧化物、胆固醇、b 谷甾醇【l l 】等。从人工虫草中分离得到3 ，麦角甾醇、胡 萝卜甙、菜油甾醇、二氢菜籽甾醇【1 2 1 。 1 1 3 核苷类化合物 至今己从虫草及发酵菌丝中分离鉴定有1 1 个核营类化合物，是其活性成分。包括腺 嘌呤、腺苷，尿嘧啶、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶【1 3 1 4 1 。在5 0 年代自蛹虫 草人工培养液的菌丝分离出虫草素( c o r d y c e p i n ) ，化学结构为3 脱氧腺苷( 3 - - d e o x y a d e n o s i n e ) ”l 。虫草不同部位的核普类化合物含量不同，西藏产冬虫夏草水溶性核 着成分主要集中在子座部分，僵虫体部分含量甚低【1 7 1 。 1 1 4 肽类及维生素类 姜泓等从人工蛹虫草子实体中分离出虫草环肽a ( e o r d y c e p e t i d ea ) 【1 5 1 。具免疫和抗真 菌作用。 每1 0 0 克冬虫夏草中含v b n o 1 2 p g , v 2 9 1 9l a g 、v c1 1 6 0 3 烬，每1 0 0 克人工培养菌丝 含v b l 2 0 2 7 1 t g ，且含、，b 1 v e 2 、v c1 2 p 8 。张显科等测出蛹虫草含有多种重要的维生素， 其中v e 和v b 6 含量最高，v b l 和v b l 2 也较高闱。 1 1 5 无机元素及其他类 虫草所含微量元素十分丰富，已检出3 7 种元素，而蛹虫草已检出3 6 种，以p 的含量为 最高，其次为n a , i 【，m g ，m n , f c ，c u , z n 。天然虫草比虫草菌丝体还多稼、钒、锆3 种【1 8 】。 此外，张显科等测出蛹虫草含有超氧化物歧化酶( s o d ) 5 8 40 9 m g p r o 【8 】 第一章文献综述 1 2 蛹虫草的药理作用及临床应用 蛹虫草性平味甘，具有保肺、益肾、止血、化痰等功效，能治疗肺结核病等：它可作 为强壮剂、镇静剂、用于虚疹病后虚弱症，肺结核吐血，老人衰弱的畸形咳喘、盗汗、 自汗、贫血等症。其虫草素能干扰r n a , d n a 的合成，对蚕蛹虫草进行药化药理分析测 定，指出人工培育的蚕蛹虫草不仅无毒而且具有明显的镇静、抗疲劳、抗肿瘤、抑制癌 细胞及雄性激素作用，可增强机体免疫力等功能。长春中药厂( 1 9 9 0 ) 从蛹虫草菌培养中分 离得到虫草素单体( 3 脱氧腺苷) ，具有抗病毒、抗真菌、抗癌、抑制疟原虫生长等作用， 是蛹虫草及人工培养物的有效成份之一。总的来看，虫草的具体药理作用如下： 1 2 1 对免疫系统的增强作用 虫草及虫草菌丝制剂对小鼠免疫器官具有明显的作用【l _ 丌，可使肝、脾增大，胸腺缩 小能促进肝枯否氏细胞吞噬功能增强及吞噬细胞增殖，并在激活小鼠腹腔吞噬细胞，增 强吞噬功能的同时，可能使巨噬细胞内酸性磷酸酶活性也提高，两者呈正相关。从虫草 中提取的虫草多糖，对网状内皮系统及腹腔巨噬细胞有明显的激活作用，能促进淋巴细 胞的转化，使血清培g 及血浆皮质酮升高。但是，虫草多糖的免疫作用与分子大小有关【1 9 1 ， 当多糖不同程度酸水解时，多糖分子量下降，分支减少，对巨噬细胞吞噬功能的促进作 用亦有下降趋势，分子量为1 2 0 0 0 的级分对巨噬细胞吞噬功能无促进作用。应用扫描电镜 可以观察到，虫草和虫草菌丝制剂能够使小鼠胸腺皮质增厚，细胞增多，提高细胞增殖 率，使损坏的胸腺孵育细胞( t n c ) 得到恢复。但用较大剂量的虫草液与淋巴细胞共同温育， 能改变t 细胞的功能而影响细胞免疫。通过试验显示，不论虫草还是虫草菌丝均能增强巨 噬细胞的吞噬功能和提高血清溶菌素的活性，尤其对细胞或体液免疫功能低下的动物n 式 验动物模型1 作用更为明显。 1 2 2 抗肿瘤作用 虫草真菌培养液中含有虫草素，体内外试验例证明其能抑制小鼠肿瘤细胞系的核酸 合成，即能起到抑制肿瘤细胞m r n a 的作用。试验证明，从虫草中提取的虫草多糖与虫 草水剂抗癌作用相似，对s 抑制率为2 8 3 0 ，虫草皮下注射抑制率为3 0 - 4 0 ，腹腔注射抑 制率为4 3 ，但出现毒性反应。虫草能增强环磷酰胺的抗癌作用，虫草水剂还可增强6 - 巯基嘌呤的抗癌作用。虫草水提物抑瘤率为6 7 ，虫草菌丝水提物抑瘤率为5 9 - 6 6 。关 于虫草抗肿瘤的机理，多数学者认为，虫草中含有大量的d - 甘露醇及多糖类物质，而此 类物质是一种非特异性免疫增强及调节剂，它可激活机体的免疫活性细胞，尤其是丁淋 巴细胞及其淋巴因子、单核一巨噬细胞系统及n i 嘲胞等，从而攻击靶细胞发挥其抗肿瘤 作用。除此之外，虫草菌中的虫草素能干扰砌吼谛d n a 的合成，从而影响蛋白质的合 成，这种机制可能与虫草素的抗肿瘤作用有关。 4 第一章文献综述 1 2 3 对心脑血管的作用 虫草醇提物可明显对抗乌头碱和氯化钡引起的麻醉大鼠心律失常，能提高豚鼠心脏 哇巴因中毒的耐受量，能使麻醉大鼠和豚鼠心律减慢，并能降低离体豚鼠心机收缩力， 但对右心房的自动节律性和左心房的功能不应期均无明显影响。虫草菌丝提取物还具有 明显增加麻醉犬心输出量，冠脉血流量，增加心脑供血，降低冠脉、脑及外围血管阻力 的作用。楼雅卿【2 l 垮用人工虫草菌丝体醇提取物和发酵液进行了麻醉兔和大鼠及离体兔 心房试验。证明其具有负性频率作用，能明显降低小鼠异丙肾上腺素引起的耗氧量增加， 能提高小鼠常压心机耐缺氧能力，对垂体后叶索引起的兔急性心机缺氧及甲状腺素加去 甲肾上腺素引起的大鼠应激性心机梗塞有一定的保护作用；具有一定的抗心率失常作用： 能够增加心脑供血量；明显对抗胶元和a d p 钠盐诱发的兔血小板聚集作用；明显延长乌头 碱诱发的大鼠心率失常发生时间减心律失常的程度和缩短乌头碱，氯化钡引起的心律失 常持续时间。 1 2 4 对血小板的作用 虫草和虫草菌丝制成水提液，对小鼠肌肉注射表明，小鼠血小板数在给药后较给药 前明显增高( p 0 0 5 ) 。有试验证明，虫草水剂能提高正常小鼠白细胞( 6 1 4 0 士1 8 2 4 至8 5 6 0 士3 0 7 9 个r i m 3 ) ， 但不能防i e c y 弓l 起的白细胞减少，还能使小鼠骨髓粒一单祖细胞增殖，对抗三尖杉酯碱 ( h a ) 抑制作用。但也有试验认为，虫草提取物对血小板能引起聚集，而虫草菌丝提取物 则抑制聚集。 1 2 5 广谱抗菌性 程显好等 2 2 1 菌丝体及发酵液中的抗菌活性物质进行了定性测定及初步分离，发现菌 丝体及发酵液对细菌有广谱抗性，对原核生物甲的革兰氏阴性及阳性菌、对芽饱菌和非 芽抱菌，对放线菌种的链霉菌都可以拮抗，对酵母及丝状真菌没有抗性，对枯草杆菌有 抑菌作用。同时还发现对须疮癣菌、石膏样小花胞菌、羊毛状小芽袍菌、絮状表皮癣菌、 肺炎球菌、链球菌、鼻痘杆菌、猪出血性败血症杆菌等有不同程度的抑菌作用，但对金 黄色葡萄球菌及溶血性链球菌无抑制作用。此外，虫草还能对由二甲苯诱发小鼠耳部炎 症、蛋清诱发大鼠足趾炎症有抗炎作用。 1 2 6 对肺气管的作用 虫草具有镇咳、松弛气管、祛痰( 强度超过桔梗) ，对肾上腺素引起的小鼠急性肺水肿 有保护作用，对离体豚鼠支气管有显著的收缩和扩张作用。对乙酰胆碱诱发豚鼠哮喘， 虫草和虫草菌丝l d 5 0 i 2 0 的量，均可明显增大引喘潜伏期差值，表明有平喘作 用；l d s o l 2 0 的量可协同氨茶碱平喘作用，能使支气管平滑肌松弛的作用。 5 第一章文献综述 1 2 7 降血糖作用 人工虫草菌丝经热水提取，乙醇沉淀等一系列的处理得到多糖精品，口服给予 剂量在5 0 0m g k g 的多糖精品时，对正常小鼠无明显的降血糖作用，而腹腔给予剂量在1 0 0 m g k g f g l 5 0 m g 6 9 的多糖精品时，对正常小鼠、四氧嘧啶糖尿病模型小鼠和链尿佐菌素糖 尿病模型小鼠均有显著的降血糖作用。正常小鼠血糖水平最多可降到6 0 左右，而糖尿 病模型小鼠最多可降到约4 0 ，精多糖对高血糖小鼠的作用强于正常小鼠，且高剂量组 下降的幅度大于低剂量组，并呈现一定的量效关系。此外虫革提取物能降低胆固醇和甘 油三酯含量。 1 2 8 延缓衰老作用 李连德团】对虫草发酵液提取的1 4 种虫草进行生物活性试验，果蝇抗衰老试验表明： 不同来源的虫草多糖对果蝇有不同程度的延缓衰老作用，有的效果很好，其中a t - 0 1 效果 最好，而且随纯度增大抗性提高。不仅如此虫草还具有解毒作用、抗流涎作用和多种保 护作用。近几年来，利用冬虫夏草制成胶囊已有报道i 矧，例如，江西国药厂制成的金水 宝胶囊，主治高脂血症、性功能减退、慢性支气管炎，慢性肾炎和肾衰等。杭州第- - $ 0 药厂制成的宁心宝胶卖，主治各种心律失常和房室传导阻滞等，保定制药厂制成的心肝宝 胶囊，治疗慢性肝炎( 伴肝硬化) 。陕西大同制药厂产的至灵粉辅助治疗癌症，能改善 症状，阻止白细胞减少，对己减少者有提升作用。南通生化制药厂产的虫草菌胶囊。能 改善肝炎后硬化状态，回升血浆白蛋白。桃仁提取液复方制剂能治疗杀除血吸虫后的肝 硬化，促进胶元分解代谢。吴家蓉等瞵】应用虫草菌胶囊对2 5 例慢性阻塞性肺病进行临床 治疗，服用3 4 个月后，能改善症状，减少感冒及疾病发作次数：试验结果：血浆c a m p c g m p 值得到调整，血清溶菌酶增加，淋巴细胞转化率升高，部分患者肺功能有所改善刘慰祖嘲 等应用人工虫草治疗慢性肾功能衰竭1 8 例，肾功能好转率5 0 左右，贫血也有一定程度 改善，效果与天然虫草相似。陈以平等【2 7 】将天然虫草与江西国药厂出品的人工虫草菌丝 体胶囊对慢性肾功能衰竭作了疗效比较，组间无显著差异( p 0 0 5 ) ，治疗前后的c l b u n , h b ，r b c 及淋巴细胞转化率有显著差异。李佩璋等【3 刀将“宁心宝”胶囊i 临床应用2 0 0 例 心律失常患者，以2 周为一疗程，每日3 次，每次2 粒口服；结果显效4 1 5 ，有效3 3 ， 总有效率7 4 5 ；在本组病例中，8 0 以上为慢性难治性心律失常，病程长，用过多种药物 而无效者，而服用“宁心宝”疗效满意，并无发现毒副作用。邵耕等【3 8 1 用双盲随即安慰剂 对照法，观察用江西国药厂出品的人工虫草菌丝体胶囊治疗高脂血症2 7 3 例，结果总胆固 醇平均下降总有效率6 1 2 ( p o 0 0 5 ) ，甘油三脂平均下降9 9 3 ( p ) 0 0 5 ) ，总有效率5 6 7 0 0 0 1 ) ，高密度脂蛋白醇上升2 7 1 9 ( p o 0 5 ) ，未发现 严重副作用。除此之外，周良楣等【2 8 谰于治疗慢性乙型病毒肝炎。中医验方中己将虫草 6 第一章文献综述 配以其它中草药，如天门冬、枇杷叶、白果和白芨等，用于肺痨的治疗。甚至武以人参、 枸杞、黄芪等作成冲服的速溶茶，作为防病耐老益气延年药。曾宪可【2 9 】研究冬虫夏草对 小鼠免疫性肝损伤有保护作用：临床观察的结果认为，虫草具有激活机体免疫功能的效 应，在体内参与一系列生化反应，有明显的双相调节作用，从而增强人体正气而扶正祛 邪，重建或增强人体免疫系统功能。 1 - 3 虫草多糖的研究概况 虫草多糖作为虫草中含量最高的生物活性物质，引起了人们对它的极大兴趣和广泛 关注。大量医学实验证实，虫草多糖可活化巨噬细胞刺激抗体产生，提高人体免疫能力。此 外，虫草多糖的抗肿瘤活性也逐渐被人们公认。我国科学工作者自2 0 世纪七八十年代开 始对虫草多糖的分子进行鉴定，深层发酵技术、生理活性研究纷纷展开。利用虫草菌生产 出的保健品也陆续上市，它以全面提高人体免疫力，抗癌，抗衰老等生理功能而备受消费者 青睐。 1 3 1 虫草多糖提取纯化技术 根据多糖的性质，易溶于水而不溶于有机试剂，大多采用水提取法。虫草多糖包括 胞外多糖和胞内多糖。于溢等1 3 0 】在对蛹虫草胞外多糖的提取和纯化试验中，发现将发酵 液以4 0 0 0 r m i n - 1 离心1 5 r a i n , 上清液加3 倍9 5 乙醇沉淀1 0 1 1 , 此时胞外多糖提取率达最 大。赵明文等【3 1 】将发酵结束后，离心去除菌丝体，上清液浓缩至原来体积的三分之一，加3 倍体积9 5 乙醇沉淀6 0 0 c 烘干至恒重得到虫草多糖粗品，也属一种胞外多糖。 姚桂卿等【3 2 】取无杂菌的冬虫夏草发酵物压滤，将菌丝体与发酵液分开，菌丝体加5 倍 体积的水，9 0 9 5 。c 浸煮1 0 1 1 , 浸煮液抽滤，浸煮4 5 次，滤液合并，减压浓缩至一定体积，离 心弃去滤渣，向上清液中加3 倍体积9 5 7 , 醇沉淀过夜，离心，收集沉淀，加丙酮、乙醚反复 洗涤，然后置真空干燥器中抽真空干燥得粗多糖黄色粉末。李汴生等【3 3 对虫草菌丝体做 了各种溶菌破壁实验，得出如下结论：采用高压均质和纤维素酶结合处理或者超声波和纤 维素酶结合处理可达到很好的破壁效果，菌丝明显断裂，利于有效物质的提取。需要指出 的是，上述方法得到的仅是粗多糖，要得到纯化多糖甚至单组分多糖还必须有纯化步骤，如 活性炭脱色、流水透析、乙醇分级沉淀、d g 5 2 柱层析等方法才可得到【卅【3 5 1 。 1 3 2 虫草多糖的结构分析 龚敏等1 3 6 用s e p h a d e x o 7 5 柱( 1 6 c m * 1 0 6 c m ) 分析从c o r d y c e p s i n e n s i s ( s e r k ) s a c c 中 得到的冬虫夏草多糖c s8 1 0 0 2 ，测得其多糖分子量为4 3 0 0 0u ；单糖组成为甘露糖：半乳 糖：葡萄糖= 1 0 3 ：3 6 ：l 的多分支杂多糖。盖新杰掣3 7 1 对1 株蛹虫草多糖的结构作了鉴 定，得出该虫草多糖的单糖组分为半乳糖：甘露糖：6 ：5 ，是含少量蛋白有高度分支结构 的杂多糖，它以瞰l + 2 ) 连接的甘露糖为主干，支链由较大量的敝l 一6 ) 半乳糖和较大量的 7 第一章文献综述 瞰l 2 ) 呋喃半乳糖构成，分别连接在主干的o 4 和o 6 上。m i y a z a k i 等【3 8 】从冬虫夏草 子囊果中得到水溶性高分子多糖c s - i 和c s - i i ，其单糖组分为m 半乳糖：d 甘露塘 = 1 ：l 。c s i 是用热水提取的一种水溶性胞外多糖，是一种高度分支的半乳甘露聚糖。陈 安平【卯】从亚香棒虫草( c o r d y c c p s h a w k c s i ig r a y ) 中也分离出一种水溶性多糖，组分分析得其 单糖比为葡萄糖：甘露糖：半乳糖= o 1 ：l ：0 4 7 。t a d a s h i 等报道从蝉花的碱溶性提取物 中分得一水溶性葡聚糖c i - 6 p , 测定其分子量为2 1 0 0 0 , 该葡聚糖具有多分支结构，并具有抗 s 1 8 0 活性：从蛹虫草菌丝体培养液中提取水溶性粗多糖分离纯化，得一种含少量蛋白的半 乳甘露聚糖c m - i , 分子量2 7 0 0 0 ，具有高度分枝结构，其以p ( 1 - 2 ) 连接的甘露糖为主干，枝链 由大量的争( 1 蛔半乳糖和p - o - 2 ) 呋喃半乳糖构成；李晓明对冬虫夏草菌发酵滤液中多 糖的研究结果表明虫草菌滤液中的多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖、木糖组成。邓岚等 】在固体发酵虫草菌拟青霉中分离提纯得糖含量为5 6 的虫草菌多糖，经薄层层析、气相 色谱分析组成单糖分别为：阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，物质的量的比为 l ：2 ：1 ：3 ：3 ，与有关文献报道的均有不同经s e p h a d c x0 - 7 5 凝胶柱分离纯化得糖含量 为7 2 的主峰和- - d , 峰2 组分：用s c p h a r o s e4 1 3 凝胶柱测定分子量分别为5 7 0 0 0 和4 0 0 0 0 1 3 3 虫草多糖药理功能 我国和日本对虫草多糖研究的最多虫草多糖脂质体和虫草多糖的药理功能逐渐被 医学界认可。 马雄等 4 2 , 4 3 1 在冬虫夏草多糖脂质体( c p l ) 抗肝纤维化的实验研究中发现：c p l 能明显 减少肝脏的胶原沉积，并能抑制型i ，i i 前胶原基因的表达，有效地防止肝纤维化发生。在 对虫草多糖的研究中发现虫草多糖( c p ) 可以增强患者细胞免疫功能，改善肝功能。何雅军 等研究发现，c p l 能显著降低肝损伤小鼠血清中谷丙和谷草转氨酶活性，对d 半乳糖 所致小鼠肝损伤有保护作用。季晖等【4 5 】对人工虫草菌丝多糖生理功能的研究中发现，虫草 多糖( c p ) 对正常小鼠与四氧嘧啶糖尿病和链脲佐菌素糖尿病的模型小鼠均有显著的降血 糖作用。且有一定量效关系。王根维等f 4 6 ，4 7 】在实验中采用相同浓度不同剂量冬虫夏草水提 取物灌胃小鼠，结果表明冬虫夏草水提取物可促进特异性抗体的产生，增强机体体液免疫 能力，此外小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数也明显高于对照组。另有研究报道【郫】，虫草多糖可 降低血液中三油甘酯和胆固醇的含量。 虫草多糖具抗肿瘤、抗辐射、诱生干扰素等作用，也相继报道【4 9 捌。宾文等【鲥】对人 工培养蛹虫草多糖抗炎和免疫作用的研究中发现：虫草多糖对小鼠耳肿胀及毛细血管 通透性增高均有抑制作用，抑制小鼠溶血素的生成；对免疫器官重量、碳粒廓清功能、 d t h 等免疫作用无明显影响。徐廷万等【5 2 】对人工蛹虫草胞外多糖对受抑制的免疫功能的 影响及抗疲劳作用进行了研究，结果发现人工蛹虫草胞外多糖可增强免疫功能被抑制的 非特异性免疫功能和体液免疫，同时人工蛹虫草胞外多糖还能显著延长负重小鼠的游泳 第一章文献综述 时间，具有抗疲劳作用。俞丽露等瞪3 】研究了虫草多糖的不同组分对小鼠免疫功能的影响， 结果虫草多糖不同组分对单核一巨噬细胞吞噬能力均有较显著的增强作用，并可明显增 加经地塞米松免疫抑制作用后的胸腺和脾脏的重量，提高脏器指数。 姚思宇掣蚓在虫草多糖降血脂作用的动物试验研究中发现3 个虫草多糖试验组的 t c 和t g 于3 0 d 的含量明显低于高脂对照组；而h d i l c 含量明显高于高脂对照组，说明人 工培育的蝙蝠蛾拟青霉虫草多糖有降血脂效果。汤新强等f 5 5 l 研究人工蛹虫草胞外多糖对 治疗剂量卡铂抗小鼠的实验性肿瘤作用的影响以及对毒性剂量卡铂骨髓抑制作用的影 响，发现人工蛹虫草胞外多糖与治疗剂量的卡铂合用，可增强卡铂的抗肿瘤作用；人工 蛹虫草胞外多糖与毒性剂量的卡铂合用，可对抗卡铂引起的血小板减少，其对抗机制与 减轻卡铂抑制骨髓造血细胞的g s h - - p x 活性，增强抗自由基引起的脂质过氧化性损伤有 关。 1 3 4 虫草多糖研究的展望 综合虫草多糖的上述药理作用，虫草多糖不仅有抗肿瘤、降糖、抗放射、抗肝纤维 化作用，还能够提高免疫功能及治疗肝的病毒性感染f 5 6 】。从最近报道的资料显示，虫草 多糖能有效地治疗肝病，尤其是肝纤维化，它与公认具有较好效果的抗肝纤维化药物秋 水碱疗效相似且安全，其中虫草多糖对型胶原与转化生长因子b i 受体表达的影响更 为显著。此外，从国外的临床资料报道显示，将虫草多糖结合其它真菌中提取的多糖， 能有效地治疗肝的病毒性感染，从而促进乙型肝炎病毒e 抗原的阴转。因此，虫草多糖 对治疗肝病估计有较大的市场前景，可观的经济效益和社会效益。 1 4 虫草素的研究概况 1 9 5 1 年，c u n i n g h a m 等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，随后从中分离到 一种腺苷类活性物质，命名为虫草菌素( c o r d y c e p i n ) ，确定其结构式为 o 譬 在此之后k a e a k a 等嘲从无冠构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 中亦分离出这种物 质，这是迄今在虫草属真菌以外惟一报道分离出虫草菌素的菌种。此后在虫草属其它一 9 第一章文献综述 些种中也检测到虫草菌素的存在。 虫草菌素又称虫草素、蛹虫草菌素，3 脱氧腺苷，它是第一个从真菌中分离出来 的核苷类抗菌素。其分子式为c 1 0 h 1 3 n 5 0 3 ，分子量为2 5 1 2 4 ，熔点2 3 0 - - 2 3 1 c ，溶于水、 热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为2 5 9 n m t 5 7 , 5 s 1 。k r e d i c h 等( 1 9 6 1 ) 首先对虫草素的生物合成机理作了研究，表明虫草素的合成是以腺苷为直接前 体。1 9 6 0 年，t o d d 和u l b d c h t 首先完成了3 脱氧腺苷的全化学合成；1 9 6 4 年我国南 京药学院也人工合成了虫草裂5 9 1 。 1 4 1 虫草素的提取纯化研究 1 4 1 1 提取方法 根据虫草素溶于水、热乙醇和甲醇的性质，对虫草素一般采用水、5 0 乙醇、乙醇 和甲醇等溶剂进行提取，虫草素除用上述溶剂直接进行提取外，还可先用乙醚脱脂，再 用乙醇提取。 虫草素的提取方法主要有浸提法、超声法，索氏提取法和回流法四种方