（发育生物学专业论文）拟南芥一具亮氨酸拉链的转录因子的功能研究与表达分析.pdf

山东师范大学硕士学位论文 拟南芥一具亮氨酸拉链的转录因子的功能研究与表达分析 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 中文摘要 转录因子( h 锄s 嘶p t i o nf k t o r ，t f ) 又称反式作用因子，是一群能与真核基因 启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强 度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。当植物感受外界干旱、高盐、激素、 病害时，通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件 结合后，激活i u q a 聚合酶i i 转录复合物，从而启动特定基因的转录表达，最 后通过基因产物的作用对内、外界信号做出的调节反应。植物许多基因的表达 都是由特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用调控的。 转录因子根据表达的特点可以分为两种，一种是组成型转录因子，无论在逆 境还是正常状况下基因都表达。组成型转录因子的基因表达不受外界影响，但在 无逆境时蛋白成惰性状态或活性很低，逆境状态下其空间结构发生改变或将其磷 酸化，激发其下游靶基因启动子核心序列的结合活性，下游基因才能表达。另一 种是诱导型转录因子，只有在逆境下基因才会表达，绝大部分的转录因子都是这 种自身的反馈调节。诱导型转录因子是逆境诱导其表达，然后进一步启动其下游 功能基因的表达。但是，细胞如何感知外界逆境信号，如何进一步将逆境信号传 导给转录因子，转录因子如何调控其下游靶基因，目前仍然缺乏足够的信息和证 据来描述一个相对完整和清晰的植物转录因子应答胁迫的信号系统。1 。 b z i p 家族的转录因子是与植物逆境抗性相关的转录因子家族。植物碱性亮氨 酸拉链( b z ) 蛋白是一类重要的植物转录因子，b z i p 类转录因子识别核心序列 a c g t 的顺式作用元件为c a c g t g ( g 盒) 、c a c g t c ( c 盒) 、t a c g t a ( a 盒) 等，一些受a b a 诱导的基因的启动子区都含有这些元件”1 。其中g 盒元件普遍 存在于受a b a ，生长素，茉莉酸，水杨酸诱导的基因中，例如在拟南芥b z i p 家 族中，g 盒结合因子( g b f l 、g b f 2 和g b f 3 ) 有相似的a b a 丰富区，使它们 有相似的功能，而且三个b z p 蛋白之间还能形成异二聚体，异二聚体的多样性 为g b f 蛋白功能多样性提供了基础“1 。 酵母中发现了b z 口家族的转录因子与酵母的抗氧化性相关，植物中的转录因 山东师范大学硕士学位论文 子a t 3 9 5 1 9 6 0 与酵母中的这一转录因子在空间结构上有很高的同源性，为了验证 它在体内的功能，本实验构建了过量表达载体和沉默载体，利用花浸染法把农杆 菌携带的双元表达载体，p c a l b 1 a 3 3 0 1 ：a t 3 9 5 1 9 6 0 ，p c 舢订b t a 3 3 0 l ：a t 3 9 5 1 9 6 0 p m m o t 泖p c a 【b t a 3 3 0 1 ：a t 3 庐1 9 6 0 g f p 及p c a m b t a 3 3 0 1 ：a t 3 9 5 1 9 6 0 c d n a 转入拟南芥，通过多次筛选已经获得了转基因拟南芥的纯合植株，对获得的转基 因植株的表型分析发现，在过量表达a t 3 庐1 9 6 0 的转基因拟南芥中对胁迫的抗性 有一定程度的变化，因此推测a t 3 9 5 1 9 6 0 可能参与植物的抗性调节。 关键词：b z 口转录因子拟南芥过量表达基因沉默亚细胞定位组织定位 分类号：0 7 8 i i 山东师范大学硕士学位论文 t h ef h n c t i o n a la n de x p r e s s i o na n a l y s i so fal e u c i n ez i p p e r t r a n s c r i p t i o nf h c t o ro f 爿，口6 脚s 括 ( c o l l e g eo fl i f es c i e n c e ，s h a n d o n gn o r n l a lu n i v e r s i 劬，i n a n ，2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r co n eo ft h eg r o u p so fp m t e i n st h a tb i i l dt oc 括- a c t i n g d n a r c g i l l a t o r ye 1 锄e t su s 吨d n a b 越i n gd o m a i n s t h e yh c l pi i l i t i a t eap r 0 f 锄 o fi n c r e a s e do rd e c r e a s e dg e n et r a n s c 矗p t i o n a ss u c h ，t l l e ya r ev i t a lf o rm a l l y i m p o n a n tc e l l u l a rp m c e s s e s r e s p o n d i n gt ot l l ee l l v i m m e n t a ls t i m u l is u c h 觞d m u 曲t s ，h i 曲一s a l i n i t ya 1 1 d h o r m o n c ，s e r i a l so fs i g n a l i n gp a m w a y si np 1 舭t sa r ca c t i v a t c d t a n s c r i p t i o nf k t o r s a c td o w n s n 锄o fs u c hs i g n a l i n gc a s c a d e s 柚db i n d 印e c i f i cd n ar e 百o nt oc o m r o l 血e 仃a n s c p t i o no fs p e c i 丘cg e sb yi n c r e 船i n go rp r c v c n t i n gt h ep r e s e n c eo fr n a p o l y m e r 舔ei i a f i e r 打a l l s l a i i o n ，t h en e w l ys y t l c s i z e dg e n c t i cp r o d u c t sh e l pc e l l s r c s p o n dt oi n t e r c e l l u l a ro re 1 1 v i r o m e m a ls i g n a l s b 船e do nt h ee x p r e s s i o nc l m c t e r i s t i c s ，订a n s c r i p t i o nf k t o r sc a i lb eo fm o c l a s s e s ：c o n s t i m t i v ea 1 1 di n d u c i b l 6 a l t h o u 曲c o n s t i t u t i v e 仃a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r e e x p r e s s e dl l n d e rb o mn o m l a la n ds t r e s s f l l lc i r c u m s t a n c e s ，m e ya r eu s u a l l yi ni n e r t s t a t ea n do fl o wa c t i v i t yu n d 盯s t r e s s f h lc o n d i t i o n s ， t l l ec o n f o m a t i o no r p h o s p h o r y l a t i o ns t a t eo fm e s e 仃a n s c r i p t i o nf 如t o r s 、i nc h a i l g ea 1 1 dg e t a c t i v a t e d m o s to ft h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r sf h n c t i o na st h ei n d u c i b l e ，w h i c ha r ee x p r e s s e do n l y i nt h ep r e s e n c eo fs 仃e s s ，a n dc a i lb es e l f - r e g l l l a t e db yf b e d b a c km e c h a n i s m w en o w h a v ea 百i m p s eo f h o wc e l l sc a nr c s p o n dt os i 印a l s ，b u t h o wc e l l ss e m es i 口a l s ，h o w m es i 印a l sa r ct r a n d u c e dt ot r 柚s c r i p t i o nf 如t o r sa i l dh o wt r a n s c r i p t i o n sf 沁t o r s r e g i l l a t e t 1 1 e e x p r e s s i o n o fg e n e ss t i l lr e m a i nt ob eu n c o v e r e d at b o m u 曲 u n d e r s t a n d i n go f p l a l l ts i 弘a lt r a i l s d u c t i o nn e t v v o r ko f t r a n s c r i p t i o nf 犯t o r si nr c s p o n s e t os t r c s sw i l lr e q u i r ea n s w e r st ot h ea b o v eq u e s t i o n s t h eb z 口f a m i l yo f 协m s c r i p t i o nf a c t o r si sc l o s e l yr c l a t e dt op l a mr e s i s t a n c et o e t l v i r o n m c n t a ls n s s b z pp r o t e i n sg a t h e ra ta c ( 汀c o r ee l e m e n t s ，s u c ha sg - b o x ( c a c g t g ) ，c - b o x ( c a c g t c ) a i l da - b o x ( t a c g t a ) ，咖i t h a sb e c ns h o w n t 1 1 a t i i i 些奎堕垫查堂堡主兰垡堡壅 p r o m o t e r sc o n t a i l l i n gt l l ea c g t c o r ee l e m e m sa r en e c e s s a r yf o rt 1 1 ea b a - i n d l l c e d g e n ee x p r e s s i o n 知n o n gt h e mi sg b o x ，谢1 i c he x i s t si ng e n e sw h o s ee x p r e s s i o ni s i n d u c e db ya b a ，g r o 州hh o m o n e ，j a s m 伽i ca c i d 卸ds a l i c y l i ca c i d g - b o xb i n d i n g t o r s ( g b f ) ，g b f l ，g b f 2a n dg b f 3 劬m m 6 f d 删括b z 疋i l ya 1 1 c o m a i n a b ar i c hr e g i o na n dh a v es i i l l i l a r 舳】c t i o i l s t h et h r e eb z 口p r o t e i n sc a f 0 珊v 嘶e d h e t e r d 曲e r sw i t hd i s t i n c t i v e 血n c t i o n s r e s e a r c 】b sf b ms ，删括缸eh a v ef b u n dt h a tb z dp r o t e i n sp l a yam l ei ny e a s t 柚t i o x i d a t i o n a t 3 9 5 1 9 6 0 ，m e 仃a i l s c p t i o n f k t o rf o u n di np l a m s ，i s “曲1 y h o m 0 1 0 9 0 u st o t h a to fy e a s t t oe x 咖i 1 1 e 也e 加w v dr o l eo fa t 3 9 5 1 9 6 0 ，t h e o v e r e x p r e s s i o na i l ds i l e l l c i n gv e c t o r sw e r ec o n s t n l c t e d 础驴e c t i v e l y b yu s i n g 玎o w e r d i p d y e ， m e b i n 哪唧r c s s i o nv e c t o r s ，p c a m b t a 3 3 0 1 ： a t 3 9 51 9 6 0 孤d p c a m b t a 3 3 0 l ： a t 3 9 5 1 9 6 0 p r o m o t e r ， 船w e l l船v e c t o r s p c a m b t a 3 3 0 l ： a t 3 9 5 1 9 6 0 g f p a n dp c a t a 3 3 0 1 ：a t 3 莎1 9 6 0 c d n aw c r e 打a i l s f o 衄c d t o 爿6 恸捃b ya 朋乞廊c f 蹦s t h et m s g e n e t i ch o m o z y g o l l s 一6 f d 唧妇s t m i n sh a v e b e 饥d e r i v e da f c e rs c r e e n i n g a n a l y s i s o n血e s es m n sr e v c a l st h a ts t r 面n s o v e r e x p r e s s i n ga t 3 9 5 1 9 6 0g e n eh a v e1 1 i g h e rl e v e lo fs 仃e s sr e s i s t a l l c e ，i m p l y i n ga r o l e o f a t 3 9 5 1 9 6 0i np l a n ts t r c s sr c g u l a t i o n k e yw o r d s ：b z i p tt 啪s 谢p t i o nf a c t o r ，a r a b i d o p s i s ，o v e re x p r e s s i o n ，g e n e s i l e n c i n g ，s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ，0 r g a i l i z a t i o nl o c a l i z a t i o n c a t e g o r y ：q 7 8 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 边套炒 学位论文版权使用授权书 导师签字： 交易矸 ， 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权数可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 蝓糁 签字日期：瑚0 8 年华月7 日 矸日 瓤轰朋 噬 谚 晰 唧 期字整 山东师范大学硕士学位论文 文献综述 高等植物营固着性生活，因此外界环境的各种胁迫对植物而言是一个不可逃 避的事伊5 1 。植物的生长发育需要从土壤中吸取水分，然而由干旱、盐渍化、低 温等非生物胁迫造成的缺水胁迫严重制约着植物的分布和产量【5 ，6 】。影响农作物生 长和产量的最主要因素是环境胁迫，其中又以盐胁迫和干旱胁迫最为严重。解决 这一问题最直接、最有效的途径是利用基因工程手段、培育耐盐作物品种。 许多研究围绕提高粮食作物的耐盐性进行，但植物耐盐性是非常错综复杂的 问题。土壤中过高的盐浓度导致植物离子失衡和过高的渗透胁迫，初级伤害的结 果导致次级伤害时有发生，如氧化性损伤6 7 1 等。而对于具有一定耐盐能力的植 物来说受胁迫诱导调控的耐逆途径会给我们更多的提示，可以在作物耐逆的角度 上缓解胁迫的危机。 在长期的进化过程中植物已经进化了许多不同的生理生化机制以适应和对 抗由各种非生物胁迫因子造成的胁迫【9 ，1 0 ，1 1 ：1 ) 光合途径的改变13 】：盐土植物 冰叶日中花( 朋甜硎6 r 娜 肪踟“c n 堪衄抽“m ) 在非盐条件下利用c 3 途径固定 二氧化碳进行光合作用，而在高盐的环境中则转变成c 舢讧途径进行光合作用， 以减少体内的水分丧失；2 )特殊的形态结构【1 4 】：大米草属植物( 跏加d 幻w 淞e h 砌) 的盐腺可以把体内多余的盐分分泌到体外；3 ) 离子的积累和区隔化 【2 1 ，2 2 ，2 3 】：藜科植物碱蓬( s “d p 如j d 路口) 液泡膜上的n a + 门 i + 反向转运蛋白可将n a 十区 隔在液泡中，以避免n a + 对胞质酶类产生毒害作用：4 ) 细胞中积累可溶性渗透 溶质：在胁迫条件下大多数植物都可以通过积累脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、渗透调 节蛋白、后期胚胎发生富集蛋白等物质增加胞质溶液浓度以维持渗透平衡；5 ) 细 胞壁结构的改变【2 1 0 2 03 】：细胞壁角质和蜡质组成成分以及亚显微结构的改变，可 防止植物的过度失水。 植物耐盐碱胁迫无论从分子机制上，实验室研究及应用到产业上都已取得了 长足进展。现已开展的主要研究包括两大类：一是成功克隆了相当数量的逆境相 关物质基因；另一类研究则是在逆境胁迫的条件下，基因之间通过信号传导作用， 启动某些相关基因的适时表达，从而达到抵抗逆境、保护细胞正常活动的目的。 本文主要介绍拟南芥中与胁迫相关的转录因子的一些研究进展，以及b z 口家族 山东师范大学硕士学位论文 转录因子与植物耐逆性的相关研究。 1 转录因子简介 基因转录有正调控和负调控之分。如细菌基因的负调控机制是当一种阻遏蛋 白( r 印r e s s o rp r o t e 抽) 结合在受调控的基因上时基因不表达：而从靶基因上去除阻 遏蛋白后，m 叮a 聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达，这是正调控。 这种阻遏蛋白是反式作用因子。转录因子( t r a l l s 硎p t i o nn l c t o r ) 是起正调控作用的 反式作用因子。转录因子是转录起始过程中r n a 聚合酶所需的辅助因子。真核 生物基因在无转录因子时处于不表达状态，r n a 聚合酶自身无法启动基因转录， 只有当转录因子( 蛋白质) 结合在其识别的d n a 序列上后，基因才开始表达。 作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域： d n a 结合域( d n a b i n d i 职d o m a 血) ，d n a 结合域是指转录因子识别顺式 作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型的转录因子d n a 结合域氨基 酸序列较为保守，多由6 0 1 0 0 个氨基酸残基组成的几个亚区组成。转录因子d n a 结合域的特定氨基酸序列决定它们与顺式作用元件识别及结合的特异性。 转录激活域( a c t i v a i i n gd o m 如) ，常由3 0 1 0 0 氨基酸残基组成，这结构 域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，以酸性结构域最 多见。 连接区，即连接上两个结构域的部分。不与d n a 直接结合的转录因子没 有d n a 结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用于转录复合体而影响转录 效率。 与d n a 结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与d n a 结合的功能域 常见的有以下几种： 螺旋- 转角螺旋( h e l i x t u m - h e l i x ，h t h ) 及螺旋一环- 螺旋( h e l i x 1 0 0 p - h e l i x ， h l h ) 这类结构至少有两个a 螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这 样的m o 骶结构以二聚体形式相连，距离正好相当于d n a 一个螺距( 3 4 岫) ，两 个螺旋刚好分别嵌入d n a 的深沟。 锌指( z i n cf m g e r ) 每个重复的。指”状结构约含2 3 个氨基酸残基，锌以4 个配价键与4 个半胱氨酸、或2 个半胱氨酸和2 个组氨酸相结合。整个蛋白质 分予可有2 9 个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入d n a 双螺旋 2 山东师范火学硕士学位论文 的深沟，接触5 个核苷酸。例如与g c 盒结合的转录因子s p l 中就有连续的3 个锌指重复结构。 碱性亮氨酸拉链( b a s i cl e u c i l l ez i p p c r ，b z p ) 这结构的特点是蛋白质分 子的肽链上每隔6 个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都 在a 螺旋的同一个方向出现。两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结 合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与d n a 双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对d n a 的亲和结合力 明显降低。 2 真核生物的转录因子 真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一种蛋白质是不是转录 机构的一部分往往是通过体外系统看它是否是转录起始所必须的。一般可将这些 转录所需的蛋白质分为三大类： ( 1 ) r n a 聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。 ( 2 ) 某些转录因子能与r n a 聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合 酶的成分。 ( 3 ) 某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合。如果这些顺序存在于启 动子中，则这些顺序因子是一般转录机构的一部分。如果这些顺序仅存在于某些 种类的启动子中，则识别这些顺序的因子也只是在这些特异启动子上起始转录必 须的。 以上所述的因子是一般转录都需要的，似乎并没有什么调节功能。另一些转 录因子则可以调控一组特殊基因的转录。热休克基因就是一个很好的例子。 植物体内存在大量的转录因子，仅含2 70 0 0 个基因的拟南芥( 胁6 埘猡缸 抽d f f n n 4 ) 就有5 6 的基因是编码转录因子的【2 4 】。典型的转录因子含有d n a 结合区 ( d n a _ b i n d i n gd o m a i n ) 、转录调控区( a c t i v a t i o nd o m a i n ) 、寡聚化位点 ( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 以及核定位信号区( n u c l e a r1 0 c a l i z a t i o ns i g n a l ) 等功能区域。这 些功能区域决定转录因子的功能和特性25 1 。在对植物逆境信号转导的研究中发 现，转录因子是一个很关键的因素，在胁迫刺激下它们不断合成，并将信号传递 和放大，调控下游基因的表达，从而引起植物生理生化的改变。这些转录因子根 据与d n a 结合区域的特点可以分为若干个家族，其中和植物逆境抗性相关的主 山东师范大学硕士学位论文 要有5 类：b z 口类、w r k y 类、a p 2 e r e b p 类、m u ；类和n a c 类f 2 6 】。 3 转录因子作用的分子机理 3 1 转录因子的调控机理 转录因子根据表达的特点可以分为两种，一种是组成型转录因子，如大麦 ( 月d ，如“m 辔n 旭) 圈，c 引叼( c r 印e a r eb i n d i n gf k t o r2 ) 。”，无论在逆境还是正 常状况下基因都表达：一种是诱导型转录因子，只有在逆境下基因才会表达，绝 大部分的转录因子都是这种自身的反馈调节。 组成型转录因子的基因表达不受外界影响，但在无逆境时蛋白成惰性状态或 活性很低，逆境状态下其空间结构发生改变或将其磷酸化，激发其和下游靶基因 启动子核心序列的结合活性，下游基因才能表达。诱导型转录因子是逆境诱导其 表达，然后进一步启动其下游功能基因的表达。但是，细胞如何感知外界逆境信 号，如何进一步将逆境信号传导给转录因子，转录因子如何调控其下游靶基因， 目前仍然缺乏足够的信息和证据来描述一个相对完整和清晰的植物转录因子应 答胁迫的信号系统。 3 1 1 翻译后修饰 翻译后修饰对调节转录因子的活性起着非常重要的作用。转录因子的翻译后 修饰主要表现在蛋白质的磷酸化修饰上，它不仅调节转录因子进入细胞核的过 程，也可以改变转录因子的活性或与d n a 结合能力上。磷酸化能抑制豌豆a t 一1 和 a t b p 一1 d 对d n a 的结合能力啪3 。去磷酸化后，a t 一1 被活化，a t 一1 因子就能结 合在r b s 一1 基因的5 一上游的调控区。另外，转录因子的糖基化作用也是调控活 性的重要途径。糖基化作用常发生在丝氨酸和苏氨酸的残基上，而丝氨酸和苏氨 酸残基也是磷酸化的位点，因此糖基化和磷酸化这两种修饰是相互排斥的1 。 3 1 2 细胞核定位， 转录因子是在细胞核内对基因表达起调控作用，因而对其进入细胞核过程的 调控非常重要。转录因子进入细胞核的过程是受核定位信号区( n l s ) 的调控。 n l s 首先与受体蛋白n 】弹的相互作用于位于核孔处的亲核蛋白并与之结合，然后 借助于亲核蛋白的转移功能通过核孔复合体。没有n l s 的转录因子则靠与具有 n l s 区的转录因子相互作用进入细胞核。此外转录因子进入细胞核的过程还受到 磷酸化修饰及分子间相互作用的影响。 4 山东师范大学硕士学位论文 3 1 3 二聚体化作用 转录因子的活性还受到与其他蛋白质问相互作用的影响。不同转录因子通过 寡聚化区发生相互作用，对它们与d n a 结合能力、结合方式以及在细胞中的位 置进行调节。“。 3 2 转录因子作用形式的复杂性 虽然每种转录因子有各自主要的功能，但是同一个胁迫事件可以有多种转录 因子的参与，同一个转录因子也可以参与多个胁迫事件。有的一种基因启动子序 列存在好几个顺式作用元件，如足d 2 鲥，同时存在d r e b 和a b i 也元件，r d 2 她 有一个a b r e 元件和一个m y b 元件，任何一个转录因子顺式作用元件的缺失都 会引起基因表达的降低”。因此，胁迫诱导的基因表达是受多重顺式作用元件顺 序调控的。另外，a b a 依赖的基因表达调控途径和a b a 不依赖的基因表达调控 途径之间也并非是完全独立的”。 4 与逆境抗性相关的转录因子 4 1 b z p ( b a s i c _ r e 百o nl e u c i n e z i p p 神蛋白 b z i p 蛋白广泛存在于真核生物中，都含有一个可结合d n a 并形成二聚体 的结构域。该结构域由两个保守区域组成：一个是由一个富含碱性氨基酸残基的 约2 5 个氨基酸序列组成，它紧靠亮氨酸拉链结构域的n 末端，能与专一的d 眦a 序列相互作用：另一个区域是由亮氨酸拉链序列组成，亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ) 是由伸展的氨基酸组成，每7 个氨基酸中的第7 个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏 水性氨基酸，排列在螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2 个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。在 “拉链”式的蛋白质分子中，亮氨酸以外带电荷的氨基酸形式同d n a 结合亮氨 酸拉链形成一个两亲性的螺旋，该结构为b z 蛋白与d n a 结合之前形成二聚 体所需。”。 这类转录因子都以双分子形式与d n a 靶位点相结合形成同二聚体 ( h o m o d i m e r ) 或异二聚体( h e t e r o d i m e r ) 。不同的二聚体，能进一步产生多样化的 转录调节机制啪1 。除此之外，某些植物的b z i p 蛋白还分享其他的保守结构域， 如谷氨酰胺、脯氨酸以及酸性氨基酸丰富的结构域，这些特性可能与它们各自的 功能专一性有关1 。 山东师范大学硕士学位论文 植物碱性亮氨酸拉链( b z 口) 蛋白是一类重要的植物转录因子，b z i p 类转录因 子识别核心序列a c g t 的顺式作用元件为c a c g t g ( g 盒) 、c a c g t c ( c 盒) 、 t a c g t a ( a 盒) 等，一些受a b a 诱导的基因的启动子区都含有这些元件。“。干旱、 高盐或外源脱落酸能诱导内源脱落酸的合成，b z 口类型的转录因子也随之被激 活，并结合在a b r e ( a b ar c s p o n s i v ee l e m e n t ) 上啪1 。a b r e 存在于许多a b a 诱导基 因的启动子序列中，含有结合b z i p 蛋白的结合序列，它们的相互作用使下游许多 抗性基因得以表达。用酵母o n e h y b r i d 的方法已经从拟南芥中分离出逆境诱导的 4 种b z i p 蛋白，分别称做a b f l ( a b r eb i n d i n gf a c t o 订) 、a b f 2 a r e b l 、a b f 3 和 a b f 4 a r e b 2 ”1 。干旱、盐胁迫和a b a 处理能够使这4 种转录因子大量表达，然 后这些转录因子又可以诱导a b a 的过敏感以及其他表现型，使植物体内的糖积 累，内源a b a 合成，耐盐和耐早等诸多抗性相关基因的表达增强。 4 2w r k y 类转录因子 w r k y 蛋白是鉴定只存在于植物中的一类转录因子。仅拟南芥就含有1 0 0 多 种、r k y 成员，每种都含有一个或两个w r k y 结构域。w r k y 结构域是一个含 6 0 个氨基酸的序列，n 端包含了极为保守的氨基酸序列w r k y g q k 和一个锌指结 构域。w r x y 结构域能特异性识别与其互作的顺式元件w 一盒，w 一盒中t o k c 核心序列非常保守，w 盒存在于许多与植物防御反应相关的基因启动子中，介导 了病原物来源的激发子诱导的转录反应。病毒、细菌和真菌激发子的侵染以及 信号物质如水杨酸的处理，能够诱发w r k y 转录因子的m r n a 和蛋白质的合成， 而且也能增强它与d n a 的结合活性。 k a l d e 等h 0 3 用不同的病原菌侵染拟南芥突变体诱导第三组w r k y 基因瞬时表 达，根据所参与的不同防卫反应信号途径，将第三组w r k y 基因分为4 类，并发 现有很高比例的w r k y 基因在整个防卫反应过程中表达。l i 等“”最近研究发现， 拟南芥w r k y 7 0 是s a 和j a 信号途径的共同调控元件，也是两个彼此拮抗的信号 途径交叉点，超量表达a t w r k y 7 0 能增强转基因植株抗病能力，并使一些s a 诱 导的基因组成性表达。在逆境下起作用的转录因子还有：烟草n t w r k y s “”以及 马铃薯s t w r k y “。 4 3a p 2 e r e b p 类转录因子 a p 2 e r e b p 是植物所特有的一类转录因子，含a p 2 e r e b p 的转录因子广泛 山东师范大学顾十学位论文 存在于拟南芥、玉米、番茄 妒d p b 坩 州所嚣删把h m 埘) 、烟草和水稻等许多植物 中，而且参与植物多种基因的表达。这个家族的成员都含有由6 0 个左右氨基酸残 基组成的非常保守的d n a 结合区( 即a p 2 ，e r e b p 结构域) 。a p 2 亚家族、r a v 亚家 族和e i 也b p 亚家族是这一家族的两三大分支1 。a p 2 亚家族含有两个a p 2 区域， r 1 和r 2 ，而e r e b p 亚家族仅含有一个a p 2 区域。a p 2 亚家族主要在植物发育中起 作用，e r e b p 亚家族主要在植物对生物和环境的胁迫中起作用，包括c b f 类、 d r j m 类、e r f 类等。 4 3 1d i 也b 类转录因子 拟南芥d r 髓基因是一个小型的多基因家族。从干旱诱导基因尼d 毖4 的启 动子中确定d r e ( d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m c n t ) 顺式作用元件：t a c c g a c a t “” 在低温诱导基因中确定出一种c r t ( c r 印e a t ) 元件，这个元件在干旱中也可以诱 导出。d r e 和c r t 元件都包含了核心序列c c g a c ，它们普遍存在于干旱、高 盐或低温胁迫应答基因的启动子中，统称d r e c r t 元件，对在这些胁迫条件下 的基因诱导表达起调控作用。l i u 等“利用脚鲥基因启动子的d r e 元件和酵 母单杂交方法，从低温处理的拟南芥c d n a 文库中克隆了3 个与d i 也元件结 台钓辕录因子，定名为d r e b j 刖c b f 3 、d r e b i b c b f i 秘d r e b j c ，c b f 2 ；同时 从干旱处理的拟南芥c d n a 文库中克隆了2 个与d r e 元件结合的转录因子， 定名为d r e b 2 a 和d r e b 2 b 。 c 占尉是d i u b 1 家族中的第4 个成员，同样，c b f 4 在拟南芥中的超表达 能引起c o r 和r d 的活化。和其他成员不同的是，它被干旱和a b a 所诱导，但 不被低温所诱导“”。s a k u m a 等“”又相继分离出d 砒狙家族的几个新成员： d r e b l d 、d r e b l e 、d r e b l f 、d r e b 2 c 、d r e b 2 d 、d r e b 2 e 、d r e b 2 f 、d r e b 2 ( j 和d r e 8 2 h ，它们在逆境抗性中的作用都不是十分明显。 4 3 2e r f 类转录因子 e r f 转录因子是a p 2 e r e b p 的一个子家族，对植物来说是特有的。e r f 类转 录因子分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关。当e r f 超表达时可与c 啪r e 元件结合，能提高植株的抗逆性“。 该类转录因子在拟南芥中有1 2 4 个成员，每个成员均含有一个由5 8 5 9 个 氨基酸残基构成的保守区域，可以和g c c 盒结合。g c c 盒存在于许多 7 山东师范大学硕士学位论文 p r ( p a t h o g e n e s i s - r e l a l e d ) 基因启动子区域。植物受到病原菌的侵染会产生防卫反 应，几丁质酶、葡聚糖酶和渗调蛋白等病程相关( p r ) 蛋白质的积累是抗病反应 的标志，乙烯处理植物同样能诱导这些基因的表达。h a o 等1 对这些基因的启动 子进行分析确定了含有1 1 个碱基对的乙烯应答元件t a g a a g c c g c c ， a g c c g c c 是g c c 盒的核心序列。乙烯和病害诱导e r f 类转录因子的基因表 达，它们和g c c 盒的相互作用提高了植物的耐盐以及抗病能力。 4 3 3c b f 类转录因子 c b f 类转录因子c b f 类转录因子含有a p 2 e r e b pd n a 结合域，能识别 c o r 基因中的c r t 仍r e 元件并与之结合，故命名为c b f l ，即c m r e 结合因 子。c r t d r e 元件或其核心序列普遍存在于冷诱导和脱水诱导基因的启动子 中，c b f l 在酵母系统中可激活含有c r t d r e 作为上游激活子序列的报告基因 f 5 2 o g 等“”和x u e 陆4 1 对大麦、小麦、水稻、玉米、油菜、烟草和高粱( 踟僧 “州 e 即mp e r s ) 等的c b f 相似物和拟南芥c b f 作了氨基酸序列同源性的分析，发 现它们除了均含保守的a p 2 结构域以外，还含有其他保守的氨基酸序列。j a g l o 等也发现水稻、小麦、油菜和马铃薯( 勋肠n “mm 施，“卅l ) 等的c b f 相似物 和拟南芥c b f 氨基酸序列具有较高的同源性，而且在低温下作用途径也极为相 似。因此，c b f 介导的低温传导途径在植物体内极为保守。 4 4m y b 类转录因子 m y b 类转录因子是指含有m y b 结构域的一类转录因子，m y b 结构域是一段 约5 1 5 2 个氨基酸的肽段，其中含有3 个色氨酸残基，这3 个残基被1 8 、1 9 个氨基 酸残基隔开，组成一个疏水核，包含一系列保守的氨基酸残基和间隔序列，使 m y b 结构域折叠成螺旋一转角一螺旋结构。m 是植物中最大的转录因子家族， 拟南芥中大约有1 8 0 个成员，玉米中大约有2 0 0 个成员。通过对拟南芥干旱、高 盐和a b a 诱导基因的启动子区域进行分析，鉴定出了m y b 结合位点的核心序列 为t a a c t g ，当m 类转录因子和下游靶基因启动子的t a a c t g 核心序列结合 后，即诱导抗胁迫基因的表达“”。组合调控是真核基因表达调控的重要方式，主 要通过多种转录因子间的相互作用来实现对靶基因的精密调控。”。 4 5n a c 类转录因子 山东师范大学硕士学位论文 a i d a 等呻3 首先报n a c 结构域，发现在矮牵牛n a m 基因和拟南芥a t a f l 2 和c u c 2 基因编码的蛋白n 端包含一个保守的氨基酸序列，命名为 n a c 。已经发现n a c 类转录因子在植物抗逆和防卫反应中起重要作用。n a c 转 录因子的c 端是转录激活功能区，具有高度的多样性，该端的共同特点是一些 氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸重复出现的频率高。n a c 转录因子 可与m y c 1 i k c 元件结合，该元件的核心序列( c a t g t g ) 在拟南芥e r d l 干 旱诱导反应应答过程中起重要作用5 ”。 t r a l l 等“”已经发现一些n a c 基因能被病原菌和其他一些非生物胁迫因子 所诱导。拟南芥的三个不同的n a c 基因( a n a c 0 1 9 ，a n a c 0 5 5 和a n a c 0 7 2 ) 表达受干旱、高盐和a b a 的诱导，超量表达能显著增强转基因植株的耐旱能力。 a n a c 0 7 2 参与a b a 介导的逆境信号传导途径，超量表达能显著增强转基因植 株对a b a 的敏感性，并发现a b a 和逆境因子诱导的基因在转基因植株上被调 控。另外，s e l t h 等”“的研究表明，番茄n a c 转录因子s 1 n a c l 能与番茄卷叶病 毒蛋白互作而使寄主产生抗病毒性，说明n a c 在植物的多种抗逆信号途径之间 起作用。 5 拟南芥中b z i p 家族的转录因子 转录因子( t f s ) 在几乎所有的生命活动中都起关键作用。拟南芥中b z i p 基 因大约是人、酵母、蠕虫的四倍m ，对a m z d 家族转录因子的遗传及分子研究 发现它们调节多种生理过程，例如：抗病，光和胁迫的信号传导，种子成熟及花 的发育等。拟南芥基因组包含有7 5 个b z 口家族转录因子的成员，其中大约有 5 0 个在文献中未曾提到，为方便，我们给每一个6 z 伊基因一个基因名： 一曲z 朋吖一拍z ，p 乃。一舰口家族转录因子据共有结构域可以分为1 0 组嘲。 5 1 拟南芥b z 口家族转录因子的复杂性 爿f b z i p 蛋白据其结构基元的序列相似性分组。之后，用m e m e 寻找彳f b z 口 蛋白共有的结构域，把有相似结构基元及其他保守基序的b z 弹分到一组，共分 1 0 组，同一组的蛋白还具有其他共同点，如亮氨酸拉链的大小。其中有三个 4 m z m 蛋白不适合任何一组。 9 山东师范火学硕士学位论文 n x 7 - 剐k 一舄- l - ) ( 6 一l 一) ( 6 一l 图1 b z i p 结构域的基本结构( 由文献 6 3 补充) f i g 1p r i m a r ys t m c t l l r eo f t h eb z i pd o m a i n 图2 g c n 4 的b z i p 结构域与d n a 结合的三维结构图( 由文献 6 3 补充) f i g 2t h r c e d i m e n s i o m ls t n l c t i l r eo f 龇g c n 4b z i p d o m a i nb o u n dt o