（药理学专业论文）杜氏盐藻（dunaliella+salina）叶绿体atpa片段的克隆及杂交分析.pdf

郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e l l az a l i n a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 叶绿体a t p a 基因 片段的克隆及杂交分析 硕士研究生侯桂琴 导师薛乐勋 郑州大学细胞生物研究室 郑州4 5 0 0 5 2 中文摘要 近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞 和转基因动物等生产系统相比，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具 有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的 生物反应器。然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，许多研究兴趣集中到 生长迅速，培养简单的单细胞绿藻上。近几年来，莱茵衣藻的遗传背景已逐步研究清 楚，有多种外源性蛋白质在衣藻中表达成功。遗憾的是，与衣藻比较，更具有优点的 盐藻作为生物反应器的研究至今国内外尚缺乏。盐藻属绿藻门团藻目，是一种原生质 裸露的嗜盐性浮游单细胞真核藻，长约6 1 5um ，呈椭圆形或梨形，无细胞壁只有 细胞膜，且有双鞭毛，能在水中游动。有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的4 8 左 右，可以进行光和自养，叶绿体的基部有一个淀粉核。盐藻是一种没有细胞壁的单细 胞真核藻类，电是真核植物中抗逆性最强的一种藻类。该藻的突出优点在于培养条件 极其简单，光合自养，抗盐性极佳，可在0 0 5 5 m 的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度 为2 - 3 m 。其强大的渗透调节能力，被认为可能是耐盐机理研究的模式植物。同时它 又是单细胞光合自养生物，适于研究光合作用机理。 以细胞核为外源基因受体的传统植物基因工程虽己发展趋于成熟并得到广泛应 用，但由于细胞核基因组大，背景复杂，外源基凼的整合位点和整合的拷贝数难以人 为控制，造成外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象； 同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l # z a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 安全难以保证等。叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望。与核基因转化 系统相比，叶绿体基因组小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合 进叶绿体基因组。这样有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在 适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由 于叶绿体中d n a 分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力， 保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外，由于叶绿体基因组的原核性质，对来 自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体中高效表达，而且可以将多个外源基 因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入，并由共同的启动子控制，既方便操作 又可避免由于存在多个相同的启动子所带来的“共沉默”。这是核基因转化无法做到 的。 要建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，最关键的是构建一个稳定的叶绿体表达载体。 因此选择理想的启动子是至关重要的。研究表明，在莱因衣藻中a t p a 基因( 编码叶 绿体a t p 合成酶a 亚基) 簇( 包括a t p a ，p s b i ，c e m a 和a t p h 四个基因) 共用一个 启动子，这个强启动子位于a t p a 基因的上游，它可以作为叶绿体载体表达系统的必 要元件。本研究室曾采用莱因衣藻叶绿体a t p a 基因启动子作为盐藻叶绿体转化系统 的启动予，虽然也有转录起始活性，但表达效率不高。若能把盐藻叶绿体自身的a t p a 基因强启动子克隆出来并用于其叶绿体表达载体无疑是最理想的。故本研究根据近缘 藻类a t p a 基因的氨基酸高度保守序列，设计简并引物，用p c r 方法扩增得到了盐 藻叶绿体a t p a 部分核苷酸序列( g e n b a n ka c c e s s i o na y 4 3 5 0 9 6 ) ，旨在为下一步 启动子的克隆和盐藻高效叶绿体表达载体的构建打下基础。同时还通过设计简并引 物，用p c r 方法直接从叶绿体基因组中克隆了a t p a 基因片段，这为从叶绿体中克 隆某些基因提供了一种快速而简便的途径。 方法 从g e n b a n k 上搜索五种藻类莱因衣藻( c h l o z q y d o m o n a sr e l n h a r d t i i ) 、普通小球 藻( c h l o r e l l av u l g a r i s ) 、m e s o s t i g m a 订r i d o 、卵形肾藻( n e p h r o s e l m i so l i v a c e a ) 和c y a n i d j o s 血y z o i im e l - o a e 叶绿体的a t p a 全基因所编码的氨基酸序列进行比对， 找出两段比较保守的序列，设计简并引物，以提取的c t d n a 为模板，用p c r 方法扩增 a t p a 基因片段。并把其与p m d 一1 8 t v e c t o r ( 全长2 6 9 k b ) 载体连接进行体外重组和转 2 郑卅i 大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d “n a l h t l l as a l i n a ) 叶绿体址p a 基因片段的克隆分析及杂交 化，用含a m p 、x - g a l 和i p t g 的l b 平板筛选，挑取阳性菌落提质粒，后用e c o r l 和 h i n d i i i 进行双酶切鉴定，将含有插入片段的重组质粒送上海基康公司测序，序列结 果与g e n b a n k 上其他藻类的a t p a 基因片段进行分析较。最后利用克隆的片段为探 针分别与盐藻叶绿体基因组和核基因组进行s o u t h e r n 杂交，证实其是否来自盐藻叶 绿体，为下一步启动子的定位打下基础。 结果 1 p c r 扩增产物 经p c r 扩增后，电泳检测在约4 0 0 b p 处有一明显亮带，与预期扩增的片段大小一 致。 2 盐藻叶绿体a t p a 基因的克隆及重组质粒的鉴定 将p c r 扩增后获得的片段经琼脂糖凝胶回收后与p y d 一1 8t - v e c t o r 相连进行体外 重组和转化，用含a m p 、x - g a l 和i p t g 的l b 平板筛选，挑取1 4 个阳性菌落进行快速 d n a 鉴定，用e e o r i 和h i n d i i i 双酶切，电泳结果表明有四个克隆具有与预测大小一 致的插入片段。 3 a t p a 基因片段的序列同源性分析 将测序结果与5 种近缘藻类的叶绿体a t p a 基因进行b l a s t 分析。结果显示，本 研究克隆到的基因序列片段与莱因衣藻( c h l a m y d o t a o n a sr e i n h a r d t i i ) 、普通小球藻 ( c h l o r e l l av u l g a r i s ) 、m e s o s t i g m av i r i d e 、卵形肾藻( n e p h r o s e l m i so l i v a e e a ) 和c y a n i d i o s c h y z o nm e r o l a e 叶绿体a t p a 基因氨基酸序列的同源性分别为9 2 、8 8 、 8 7 、8 6 和8 5 。 4 s o u t h e r nb l o t 分析结果 用克隆出的a t p a 基因片段作为探针与盐藻c t d n a 的杂交，结果加m a r k e r 的泳道 没有杂交信号，而加c t d n a 的其他三个泳道均有明显的杂交信号，与核基因组有极微 弱的杂交信号。 结论 1 利用简并引物p c r 方法从盐藻中获得的基因片段是盐藻叶绿体a t p a 基因片段。 通过s o u t h e r nb l o t 证实此基因片段来源于盐藻叶绿体，并由叶绿体编码合成。 2 本研究利用简并引物p c r 的方法直接从叶绿体基因组中克隆了盐藻叶绿体 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文 杜氏盐藻( d u n a l i e l l a 1 a l i n a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 a t p a 基因片段，为从叶绿体中克隆其他基因提供了一个快速而简便的途径。 关键词：杜氏盐藻，叶绿体，a t p a ，简并引物，杂交 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e t l as a l i n a ) o r r i sa t p a 基因片段的克隆分析及杂交 b 自“目州_ * _ “_ * 碾_ b # - _ 日_ _ u 日_ * _ 材t _ _ 删_ w 目m e _ _ h 自目# * _ * * 瑚髓m i _ 目_ 擗柞h 鹕_ * _ 倒_ 翊- c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa na t p ag e n ef r a g m e n t f r o mt h ec h l o r o p l a s to f d u n a l i e l l as a l i n a p o s t g r a d u a t e h o ug u i q i n s u p e r v i s o r x u el e x u n ， l a b r o r a t o r yf o rc e l lb i o l o g y , z h e n g z h o uu n i v e r s i t y , h e n a n4 5 0 0 5 2 a b s t r a c t d u n a l i e l l as a l i n ab e l o n g st oc h l o r o p h y t a ，c h l o r o p h y c e a s e ，v o l v o c a l e s a n di t s s h a p ea n ds t r u c t u r ea r ev e r ys i m i l a rt oc h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i e x c e p tf o rl a c k i n go fc e l l w a l l i ti sak i n do fu n i c e l l u l a ra l g a ，c a ns w i m t h r o u g hi t sd i f l a g e l l aa n dh a sal a r g ec u p s h a p e dc h l o r o p l a s tc o v e r i n ga b o u t 4 8 o ft h ec e l lv o l u m e d s a l i n ac a ng r o wi ne x t r e m ee n v i r o n m e n ts u c ha si n av a r i e t yo fs a l tc o n c e n t r a t i o n sr a n g i n gf r o mo 0 5t o5 m a n dt h eo p t i m u ms a l t c e n c e n t r a t i o nf o rg r o w t hi s2t o3 m b e c a u s ei t sg r o w t hc o n d i t i o ni sv e r y s i m p l e ，d s a l i n ai saf a v o r a b l eh o s tf o rp r o d u c i n gp h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n s n u c l e i ct r a n s f o r m a t i o ni n p l a n t s h a sm a n yp r o b l e m ss u c ha st h e c o m p l i c a t e dm a n i p u l a t i o n sa n dl o we f f i c i e n c ye x p r e s s i o no ft h ef o r e i g ng e n e s ， b u tt h ec h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nm a yr e s o l v et h ep r o b l e m sm e n t i o n e da b o v e t h ec h l o r o p l a s tg e n o m ei sv e r ys m a l la n dg e n e t i c a lm a n i p u l a t i o ni ni ti s e a s i e r , s ot h ef o r e i g ng e n ei ss i t e d d i r e c ti n t e g r a t e di n t ot h ec h l o r o p l a s t g e n o m et h r o u g hh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，w h i c hi sh e l p f u lt ol o c a t i n gt h e f o r e i g ng e n ei n t r o d u c e da tac e r t a i ns i t ew h e r ei tc a nb ee x p r e s s e de f f i c i e n t l y f u r t h e r m o r e ，b e c a u s et h ec h l o r o p l a s td n ah a sm a n yc o p i e s ，i ti s v e r y p o s s i b l et oe x p r e s sh i g ht h ef o r e i g ng e n e si nt h ec h l o r o p l a s t i no r d e rt of i n dac h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fd s a l i n a , w e c o n s t r u c t e dah i g he f f i c i e n c ye x p r e s s i o nv e c t o r ，a n dt h ek e yt oi ti st h a tw e 5 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e l l am “m ) 叶绿体越p a 基因片段的克隆分析及杂交 m u s tf i n do u tap o w e r f u lp r o m o t e rf o r 也ev e c t o r i th a sb e e ns h o w nt h a tt h e a t p ag e n ec l u s t e ri nt h ec r e i n h a r d t i ic h l o r o p l a s tg e n o m ec o m p r i s e st h ea p t a ， p s b i ，c e m a a n d a t p hg e n e s ，w h i c h e n c o d ead - s u b u n i to ft h e c o u p l i n g f a c t o r 一1 ( c f l ) a t ps y n t h a s e ，as m a l lp h o t os y s t e mi ip o l y p e p t i d e ，a c h l o r o p l a s te n v e l o p em e m b r a n c ep r o t e i n ，a n ds u b u n i ti i i o ft h ec f 0a t p s y n t h a s e ，r e s p e c t i v e l y t h ef o u rg e n e sh a v ea c o m m o nf u n c t i o n a lp r o m o t e t t h a tl i e si m m e d i a t e l yt h eu p s t r e a mo fp s b ia n dt h ea t p ag e n e d s a l i n ah a sh i 业h o m o l o g y st oc r e i n h a r d t t i ，s ot h ep o w e r f u lp r o m o t e r m a vb ee v o l v e de i t h e ri nd s l i n ao ri nc r e i n h a r t i i f o rf i n d i n gt h i sp o w e r f u l p r o m o t e r , w ed e s i g n e dap a i ro fd e g e n e r a t ep r i m e r sa n da m p l i f i e d t h ea t p a g e n ef r a g m e n tf r o mt h ec h l o r o p l a s t o fd s a l i n ab yp c ra c c o r d i n gt o c o a s e r r e dm o t i f so ft h eh o m o l o g o u sa m i n oa c i ds e q u e n c e so ff i v ek i n d so f a l g a e i nt h i ss t u d y ，t h es t r o n gp r o m o t e rw a sc l o n e d t oac o n s t r u c th i g h e f f i c i e n c ye x p r e s s i o nv e c t o ro ft h ec h l o r o p l a s to fd s a l i n a o nt h eo t h e rh a n d ， t h ef r a g m e n to ft h ea t p ag e n ed i r e c t l yf r o mt h ec h l o r o p l a s tg e n o m ew a s c l o n e db yp c rt e c h n i q u et h r o u g hd e s i g n i n gd e g e n e r a t ep r i m e r , w h i c h p r o v i d e s af a s ta n ds i m p l em e t h o df o rc l o n i n gs o m eg e n e sf r o mt h e c h l o r o p l a s t m f e t h o d s ： t of i n dt h ec o n s e r v e dm o t i f s ，k n o w na m i n oa c i ds e q u e n c e sw e r e c o m p a r e d a c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e dm o t i f so ft h eh o m o l o g o u sa m i n oa c i d s e q u e n c e so fa b o u tt e nk i n d s o fa l g a e ，w ed e s i g n e dap a i ro fd e g e n e r a t e p r i m e ra n da m p l i f i e dt h ea t p ag e n ef r a g m e n tf r o m t h ec h l o r o p l a s to fd 5 z f 九日b yp c rt e c h n i q u e t h er e s u l t i n gp c rp r o d u c t sw e r e i n s e r t e di n t o p m d 一1 8t - v e c t o r , a n dt h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l ij m l 0 9 p o s i t i v ec o l o n i e s w e r es e l e c t e dt od e t e r m i n et h e i rs e q u e n c e s h o m o l o g o u sa n a l y s i so ft h e d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e sw a sp e r f o r m e db yb l a s ta n ds u b s e q u e n t l y c o m p a r e dw i t hg e n b a n kd a t a t h ec l o n e df r a g m e n tw a su s e da s a p r o b e ， w h i c hw a sh y b r i d i z e dw i t ht h ec h l o r o p l a s td n a o fd s a l i n ab ys o u t h e r n 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文 杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l h m ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 w “月* t * * * _ w * “* “* * * * m * _ w _ “_ w * * * l _ h _ w “自_ 1 w w * * * * * _ * * * 目_ * 4 _ _ m b l o t r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n ： 1 t h ep r o d u c t so fp c r t h ep r o d u c t sa m p l i f i e db yp c rw e r ea n a l y z e db ye l e c t r o p h o r i s i sa n da b r i g h tb r a n do fa b o u t4 0 0 b pa p p e a r e d 2 c l o n i n go ft h ea t p ag e n ea n di d e n t i f i c a t i o n ，o ft h er e c o m b i n a n t p l a s m i d t h er e s u l t i n gp c rp r o d u c t sw e r ei n s e r t e di n t op m d - 1 8t - v e c t o r , a n d t h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l ij m l 0 9 p o s i t i v ec o l o n e sw e r es e l e c t e dt o d e t e r m i n et h e i r s e q u e n c e s b y t h em e t h o d so f e n z y m ed i g e s t i o n a n d e l e c t r o p h o r i s i s ，t h e r e w e r et h e e x p e c t e d f r a g m e n t s i n f o u r c o l o n e s ， r e s p e c t i v e l y 3 a n a l y s i st h er e s u l to fs e q u e n c i n g h o m o l o g o u sa n a l y s i s o ft h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ew e r e p e r f o r m e db yb l a s ta n ds u b s e q u e n t l yc o m p a r e d w i t hg e n b a n kd a t a f i n a l l y , w eg o ta4 0 5 b pn u c l e o t i d es e q u e n c et h a te n c o d e s1 3 5a m i n oa c i d s t h es e q u e n c es h a r e dh i g hh o m o l o g yw i t ht h ea t p ag o n e ，w i t hi d e n t i t y9 2 ， 8 8 ，8 7 ，8 6 a n d8 5 t oc r e i n h a r d t i c , c h l o r e l l av u l g a r i s , m e s o s t i g m a v i r i d e , n e p h r o s e l m i so l w ac e aa n dc y a n i d i o s c h y z o nm e r d a e ，r e s p e c t i v e l y , s u g g e s t i n gt h a tt h ec l o n e ds e q u e n c ei st h ea t p ag e n ef r a g m e n t 4 t h er e s u l to fs o u t h e mb l o t t h ec l o n e df r a g m e n tw a su s e da sap r o b ea n ds o u t h e r nh y b r i d i z e dw i t h t h ec h l o r o p l a s td n a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o b eh a dav e r yp o w e r f u l s i g n a lw i t ht h ec h l o r o p l a s td n a o fd s a l i n a , b u tn o tw i t hm a r k e ro rn u c l e i c g e n o m ed n ao fd s a l i n a , f u r t h e rd e m o n s t r a t i n gt h a tt h ea t p ag e n ei sf r o m t h ec h l o r o p l a s to f d s a l i n a c o n e l u s i o n ： 1 t h ef r a g e m e n ta b t a i n e df r o md s a l i n ab yp c rw i t hd e g e n e r a t e p r i m e ri st h ea t p ag e n ef r a g e m e n t ，w h i c hc o m e sf r o mt h ec h l o r o p l a s to fd ， 7 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文 杜氏盐藻( d “n a l i c l l as a l i n ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 w rm 一m m “口m 口口口目_ _ _ _ 一 s a l i n a 2 t h i ss t u d yl a y saf o u n d a t i o nf o rf i n d i n gap r o m o t e rf o rt h ea t p ag e n e a n dc o n s t r u c t i o no fh i g he f f i c i e n c ye x p r e s s i o nv e c t o ro ft h ec h l o r o p l a s to f d s a l i n a 3 t h ea n n o v a t i o no ft h i ss t u d yi st h ea t p ag e n ef r a g m e n to fd s a l i n ac a n b ed e r e c t l ya m p l i f i e d6 yp c rt e c h n i q u ew i t hd e g e n e r a t ep r i m e r s ，w h i c h p r o v i d e af a s ta n ds i m p l em e t h o df o rc l o n i n go fo t h e rg e n e sf r o mt h e c h l o r o p l a s to fp l a n t s k e yw o r d s ：d u n a l i e l l as a l i n a ；c h l o r o p l a s t ；a t p a ；d e g e n e r a t ep o r i m e r ； s o u t h e r nb l o t 8 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 叶绿体a t p a 基因 片段的克隆及杂交分析 硕士研究生侯桂琴 导师薛乐勋 郑州大学细胞生物研究室，郑州45 0 0 5 2 月l j昂 盐藻属绿藻门团藻目，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞真核藻，长约6 1 5um ，呈椭圆形或梨形，无细胞壁只有细胞膜，且有双鞭毛，能在水中游动。有一 个大型杯状叶绿体约占细胞体积的5 0 左右，可以进行光和自养，叶绿体的基部有一 个淀粉核，是真核植物中抗逆性最强的一种藻类”“。该藻的突出优点在于培养条件 极其简单，光合自养，抗逆性极佳，可在0 ，0 5 m 一5 m 的盐水中生长，最佳生长繁殖盐 度为2 - 3 m “1 。其强大的渗透调节能力，被认为可能是耐盐机理研究的模式植物“3 。 同时它又是单细胞光合自养生物，适于研究光合作用机理。盐藻细胞内富含具有防癌 和抗衰老作用的b 一胡萝b 素及丰富的藻体蛋白，作为天然胡萝h 索来源已在我国及 其他一些国家实现了规模养殖。它可用于生产b 一胡萝h 作为药品或天然食品添加剂， 也可用作食品、天然饵料或饲料“。6 。 近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞 和转基因动物等生产系统相，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具 有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类较廉价和安全的 生物反应器。然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，许多研究兴趣集中到 生长迅速，培养简单的单细胞绿藻上。近几年来，莱茵衣藻的遗传背景已逐步研究清 楚，有多种外源性蛋白质在衣藻中表达成功“，其它单细胞绿藻如小球藻等也有类 似研究“。遗憾的是，与衣藻和小球藻较，更具有优点的盐藻作为生物反应器的研 究至今国内外尚缺乏。 作为生物反应器，盐藻具有很多优越性：繁殖快，效率高：单细胞生物盐藻的 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e l l az a l i n a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 繁殖速度与多细胞生物比较，可以在短时间内产生数量巨大的后代个体。遗传操作 比较容易：盐藻属于低等的真核绿藻，基因组相对较小，且细胞无细胞壁，因此许多 用于转染哺乳动物的方法，如磷酸钙法，电穿孔( 电激) 法，脂质体法等，也非常适 合于盐藻细胞。培养成本低：表现在两个方面。其一，盐藻属自养生物，不需要昂 贵的培养基，只需适宜的光照，温度和无机盐，培养简单，故成本低廉；其二，盐藻 可在高渗盐培养液中生长“1 ，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养不 需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，因此也大大降低生产成 本。盐藻本身无毒，富含多种天然维生素，食用价值高，w h o 已批准其为天然胡萝 h 素来源的食物添加剂。因此，如果用盐藻生产口服型疫苗或其他口服型药物，甚至 无须纯化即可直接服用，大大降低生产成本。 以细胞核为外源基因受体的传统植物基因工程虽己发展趋于成熟并得到广泛应 用，但随着研究的不断深入，人们逐渐认识到对细胞核基因组的遗传转化存在一系列 难以解决的问题：例如由于细胞核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合 的拷贝数难以人为控制，造成外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、 位置效应等现象：同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经 过修饰改造，环境安全难以保证等。叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希 望“。与核基因转化系统相比，叶绿化转化系统有以下特点：基因组小，遗传背景 清晰，目前已有几十种植物和藻类的叶绿体基因组全序列得到测定，这就为外源基因 通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础。定点整合有利于人为控制外 源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的位点，能较好地解决“顺式失， 活”、“位置效应”等类的基因沉默问题，而且简化了外源基因转化后的筛选工作。例 如莱茵衣藻的核基因组为1 0 5 k b ，至少有1 7 个连锁群，上万个基因，这些基因的结构， 功能与序列还不清楚；而叶绿体基因组为1 9 6 k b ，除- r l q 基因和t r n 基因外编码大约 1 0 0 个基因。，全序列已测定，基因的背景资料非常清楚，叶绿体转化载体插入的靶 序列非常明确，不会影响其它基因的功能。外源基因超量表达。由于叶绿体中d n a 分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，目的基因产物的 积累不会对其正常行使功能产生过大影响，因而为外源基因在叶绿体中的大量表达提 供了保障。一系列实验结果表明叶绿体转化系统可以使目的基因超量表达，蛋白产量 比核基因表达强度高2 0 倍阻上，甚至高达1 0 0 - 3 0 0 倍“。制。基因表达的原核方式。 由于叶绿体基因组基因的排列方式，调控方式，g c 碱基对含量及翻译所偏爱的密码 1 0 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文 杜氏盐藻( d u n a l i e l l a 胁n ) 叶绿体a , t p a 基因片段的克隆分析及杂交 子与原核生物类似。因此，对来自原核生物的有重要价值的外源基因，无需改造和修 饰就可以在叶绿体内高效表达。7 。”，这是核基因转化无法做到的。利于同时进行多 基因转化。在叶绿体基因组中，许多功能相近的基因聚合在一起，共用同一个启动子， 组成操纵子，这种结构为在同一启动子的调控之下同时表达多个外源基因提供了可行 性。许多产品的重要性状往往是多基因共同作用的产物，仅转入单个基因难以取得理 想效果。核转化系统转入多个基因操作复杂，工作量大，而且易出现基因沉默。在叶 绿体中表达多个外源基因时可采取“多顺反予”原核表达形式，通过一次转化就可将 多个基因引入受体植物o ，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多 个相同启动子所带来的“共沉默” 2 a o 外源基因可稳定遗传。叶绿体属于母系遗传， 这为整合在其中的外源基因的稳定遗传提供了方便。一旦得到纯合而稳定的叶绿体转 化体，这种纯系的种子后代永远保持为纯系，不会因有性杂交而发生分离。在农业生 产中只需将转基因植株作为母本就可获得所需要性状的后代。母性遗传，环境安 全性高。通过核转化技术培养的转基因植物田间释放后，转基因会通过花粉传播扩散 到相邻的植物中去，这种外逸现象使周围地区的生物安全受到威协。使用叶绿体转化 系统就不存在这些问题，因为外源基因整合到叶绿体基因组后，只能进行母系遗传， 不像核基因那样可以随花粉而扩散，这样就保证了基因工程的安全性o “。 要建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，最关键的是构建一个稳定的叶绿体表达载体。 但是面临一个共同的问题，就是所用载体必须含适于在叶绿体基因组中高效表达的启 动子，因此选择理想的启动子是至关重要的。只有选用的启动子在宿主细胞中有转录 起始活性，外源基因才有可能顺利地得到转录和表达。在转基因藻类研究中，一些学 者使用转基因植物中较常用的几种启动子进行了筛选研究，如c a m v 3 5 s 启动子已成 功地应用于小球藻，麒麟藻，坛紫菜，海带和裙带菜等o ”“。藻类的转基因研究， u b i l 启动子成功地驱使g u s 基因在小球藻细胞中表达，而且在小球藻细胞中，u b 2 l 启 动子的转化效率高于c a m v 3 5 s 启动子。“。在杜氏盐藻细胞转化实验中，耿德贵等“6 选用了转基因植物中较常用的c a m v 3 5 s 、u b i l 、u b i l 、c a m v 3 5 s u b i l 和 c a m v 3 5 s u b i l q5 种启动子转化杜氏盐藻，结果发现u b i l 启动子启动g u s 基因 在杜氏盐藻细胞中的表达水平是c a m v 3 5 s 启动子的3 倍左右，而且串联的u b i l q 启动子是在所有5 种启动子中转化杜氏盐藻细胞中效率最高者，这与使用同样5 种 启动子转化小球藻细胞所得的研究结果基本一致o “。但是所选用这5 种启动子在小 球藻中的转化效率明显高于杜氏盐藻，大约是杜氏盐藻的3 - 9 倍，这说明转基因植 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i c l l a s a l b a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 物中常用启动子驱使的g u s 基因在杜氏盐藻细胞中的转化效率相对较低，而且在上 述研究中表达结果多为瞬时表达，稳定表达较少。因此采用宿主细胞自身的启动子等 调控元件无疑是保证转录起始活性的最直接而有效的方法。研究表明，在莱因衣藻中 a t p a 基因( 编码叶绿体a t p 合成酶a 亚基) 簇( 包括a t p a ，p s b l ，c e m a 和a t p h 四个基因) 共用一个启动子，这个强启动子位于a t p a 基因的上游。”，它可以作为 叶绿体载体表达系统的必要元件。本室曾采用莱因衣藻叶绿体a t p a 基因启动子作为 盐藻叶绿体转化系统的启动子，虽然也有转录起始活性，但表达效率不高“。若能 把盐藻叶绿体自身的a t p a 基因强启动子克隆出来并用于其叶绿体表达载体无疑是 最理想的。吕玉民等。”用杜氏盐藻本身的双拷贝碳酸酐酶( d c a i ) 基因启动子通过 与b a r n o s p o i y a 片段融合构建表达载体转化杜氏盐藻，结果得到了b a r 基因在杜氏 盐藻细胞中稳定表达的转化藻株。盐藻与衣藻具有很高的亲缘性，并且除具有衣藻的 许多优点外，用盐藻叶绿体作为表达系统还有一个更大的优点：无毒，可直接食用不 需纯化，这样可降低转基因工程下游纯化的成本。故本研究根据近缘藻类a t p a 基因 的氨基酸高度保守序列，设计简并引物，用p c r 方法扩增得到了盐藻叶绿体a t p a 部 分核苷酸序列( g e n b a n ka c c e s s i o na y 4 3 5 0 9 6 ) ，旨在为下一步启动子的克隆和盐 藻高效叶绿体表达载体的构建提供理论依据。同时本研究通过设计简并引物，采用 p c r 的方法直接从叶绿体基因组中克隆了a t p a 基因片段，这为从叶绿体中克隆某些 基因提供了一种快速而简便的途径。 1 2 郑州大学2 0 0 4 年硕士学位论文杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l l n a ) 叶绿体a t p a 基因片段的克隆分析及杂交 第一节杜氏盐藻叶绿体a t p a 基因片段的克隆及序列分析 材料与方法 1 、材料 ( 1 ) 盐藻藻株杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n ad s u t e x1 6 4 4 ) 购自美国( t h e u n i v e r s i t yo f t e x a s ) ( 2 ) 培养基 杜氏盐藻的液体培养基为改良的j o h n s o n s 培养液，配方如下： n a c l3 0 9 l ，m g c m 6 琏o15g l ，m g s o , 7 心00 5g l ，k c l0 2g l ，c a c l 。 0 1 5 1g l ，k n 岛0 5g l ，n a h c 0 30 0 4 3g l ，k 心p 也0 ，0 3 5g l ，铁盐溶液1 0 0m l l ， 微量元素溶液1 0 0 m l l 。铁盐溶液：n a 2 e d t a 2 如o2 0 9 0m g l ，f e c l a 6 h 2 02 4 4 0 m g l ；微量元素溶液：h 3 8 0 36 1 0