HPLC法测定地特胰岛素有关物质及主要杂质鉴别.docx

hplc 法测定地特胰岛素有关物质及主要杂质鉴别 *辛中帅，丁晓丽，任雪，张慧，梁成罡( 中国食品药品检定研究院，北京 100050)摘要 目的: 探索和建立地特胰岛素的纯度分析测定方法，并对主要杂质进行鉴别。方法: 采用 p hplc 方法分离分析地 1特胰岛素的有关物质，使用 protronavi c4 色谱柱( 250 mm 4. 6 mm，5 m，300 ) ，流动相 a 为 0. 2 moll 硫酸钠缓冲液( ph2. 3) 乙腈( 82 18) ，流动相 b 为水 乙腈( 40 60) ，洗脱梯度( 0 min，35% b; 45 min，67% b; 65 min，67% b; 66 min，35% b; 80min，35% b) ，流速 1. 0 mlmin 1 ，检测波长 214 nm，柱温 45 。同时收集该色谱条件下的最大杂质组分，利用 lc ms / ms方法进行鉴别。液质条件为: 液相色谱分离采用 acquity uplc beh300 c18 柱 ( 2. 1 mm 100 mm，1. 7 m) ，流 动 相 a 为 含0. 1% 甲酸的水溶液，流动相 b 为含 0. 1% 甲酸的乙腈溶液，30 min 内 b 相由 5% 升至 30% ，流速为 300 nlmin 1 ，洗脱时间为30 min。质谱离子源为纳升级电喷雾离子源，采用正离子模式检测。结果: 建立的 p hplc 纯度分析方法具有良好的方法学验证结果，能准确测定样品中的有关物质; lc ms / ms 鉴定了地特胰岛素中的最大杂质为 a 链第 21 位天冬酰胺的脱氨产物。结论: 建立的 p hplc 和 lc ms / ms 方法可准确有效地对地特胰岛素有关物质进行定量测定和鉴别分析，可作为地特胰岛素的质量研究和质控分析方法。关键词: 地特胰岛素; 纯度; 有关物质; 杂质鉴别; 脱氨天冬酰胺; 反相高效液相色谱; 液相色谱 质谱联用中图分类号: 917文献标识码: a文章编号: 0254 1793( 2014) 08 1497 07hplc determination of related substances and identificationof main impurity in insulin detemir*xin zhong shuai，ding xiao li，en xue，zhang hui，liang cheng gang( national institutes for food and drug control，beijing 100050，china)abstractobjective: to explore and establish a method for determination of purity of insulin detemir and to identi-fy the main impurity methods: the related substances in insulin detemir were separated and analyzed by p 1hplc the column was protronavi c4 ( 250 mm 4. 6 mm，5 m，300 ) ; the mobile phase a was 0. 2 mollso-dium sulphate buffer ( ph 2. 3) acetonitrile ( 82 18) ; the mobile phase b was water acetonitrile ( 40 60) withgradient elution ( 0 min，35% b; 45 min，67% b; 65 min，67% b; 66 min，35% b; 80 min，35% b) the flow rate was1. 0 mlmin 1 ; the detection wavelength was set at 214 nm; the column temperature was 45 chromatographicseparation was achieved on an acquity uplc beh300 c18 column ( 2. 1 mm 100 mm，1. 7 m)with a gradientsolvent system composed of 0. 1% aqueous formic acid ( a) and acetonitrile with 0. 1% formic acid ( b) ，and thegradient profile was 0 30 min，5% b30% b the flow rate was 300 nlmin 1 with 30 min elution the sam-ples were analyzed with a nanoliter electrospray ionization interface set in positive ionization mode the main impuri-ty was collected and identified using lc ms / ms esults: the analytical procedures were validated and the resultsshowed that the method was qualified and could be applied to accurate determination of the related substances in in-sulin detemir the main impurity was identified by lc ms / ms as the deaminated product of the 21st asparagineresidue in a chain of insulin detemir conclusion: the p hplc and lc ms / ms methods established are ac-curate and effective for qualitative determination and identification of related substances in insulin detemir，and canbe applied to specification research and quality control of insulin detemir*中国食品药品检定研究院中青年发展基金资助项目( 2011a5) 通讯作者tel: ( 010) 67095987; e mail: liangchenggang sina com第一作者 tel: ( 010) 67095310; e mail: xinzhongshuai gmail com药物分析杂志 chin j pharm anal 2014，34( 8) 1498 key words: insulin detemir; purity; related substances; impurity identification; deaminated asparagines; p hplc;lc ms / ms地特胰岛 素 ( insulin detemir) 是新一代的长效 胰岛素类 似 物，与目前已上市的其他 胰 岛 素 类 似物不同，地特胰岛素除了需通过重组 dna 技 术 表 达纯化蛋 白 母 链，还需利用化学合成 方 法 将 十 四 碳的脂肪酸 ( 肉 豆 蔻 酸 ) 连 接 到 b 链 第 29 位 的 赖 氨酸残基 上1，这就使得地特胰岛素在结 构 上 更为复杂，产生杂质的种 类及类别也可能更多。 目前各国药 典中均未收载地特胰岛素，进 口 产 品 执 行的是进口药品注册标 准2，而 进 口 药 品 标 准 尚属于未公开标准。国 内 由 于 专 利保护还没有上市 产品，但已 有多家企业正在进行地特 胰 岛 素 的 仿 制研究。根据 ich 要 求，应对药品中的主要杂质 进行定量 检 测 和 鉴 定3，因此有必要建立 地 特 胰 岛素的有关物质分析方法，并分离和鉴定其主要杂 质。本文参考中国药典人胰岛素的有关物质分析方 法4及其他人胰岛素类似物的相 关 文 献5 6，摸 索 和建立了地特胰岛素 有 关 物 质 的 hplc 检 测 方 法， 并对其中的最主要杂质进行了收集和 lc ms / ms 鉴定，可供该品种的理化性质研究和质量标准制订 作为参考。( 40 60 ) ，洗脱梯度( 0 min，35 % b; 45 min，67 % b;65 min，67 % b; 66 min，35 % b; 80 min，35 % b) ，流速 1. 0 mlmin 1 ，检测 波 长 214 nm，柱 温 45 ，进样量 20 l。2. 1. 2供试品溶液制备精密称取地特胰岛素 原 料 适 量，用 0. 01 moll 1 的盐酸制成约 3. 5 mgml 1 浓度的溶液，即得。2. 1. 3方法学考察2. 1. 3. 1线性 和 范 围将 约 含 8% 有 关 物 质 的 4mgml 1 地特胰岛素样品 按 2 倍比例逐级稀释至 0. 06 mgml 1 ，制成线性范围研究的系列溶液，分别以测得的地特胰岛素主成分峰和最大有关物质峰峰面积响应值为纵坐标，以地特胰岛素浓度和最大 有关物质浓度作为横坐标分别做标准曲线，其结果 符合线性相关( 如图 1 ) ，主成分峰峰面积与浓度线 性方程为:y = 6. 920 106 x + 9. 006 105 r = 0. 9990有关物质峰峰面积与浓度线性方程为:y = 4. 742 105 x + 5. 121 104 r = 0. 9991 表明主成分浓度在 0. 06 4 mgml 1 范围内，有关 物质浓度在 4. 8 320 gml 1 范围内与峰面积有 良好的线性关系。2. 1. 3. 2 精密度 取 3. 5 mgml 1 的供试品溶液 连续进样 6 次，主成分保留时间的 sd 为 0. 1% ，主 成分峰面积响应值的 sd 为 0. 8% ，表明方法的精 密度良好。2. 1. 3. 3 重复性 平行制备 6 份 3. 5 mgml 1 供 试品溶液，分别测定其有关物质的百分含量，结果分 别为 0. 658% ，0. 650% ，0. 665% ，0. 663% ，0. 652% 和 0. 659% ，sd 为 0. 9% ，表明该方法具有良好的 重复性。1仪器与材料2695 型高效 液 相 色 谱 仪，包 括 2996 二 极 管 阵列检测器，waters 公司; spd121p 低温浓缩离 心 仪，thermo 公司; visiprep 固相 萃 取 仪，supelco 公 司; 纳升级 hplc 分离系统，agilent 公 司; 毛 细 管 色 谱 仪，upchurch scientific 公司; ltq velosorbitrap 质谱仪，thermo 公司; oasis hlb 固相萃取柱，waters 公司;色谱 柱 包 括 grace 公 司 vydac c4 柱、waters 公 司symmetry c4 柱、phenomenon 公 司 jupiter c4 柱 以 及shiseido 公司 protronavi c4 柱，以上色谱柱规格均为250 mm 4. 6 mm，5 m，300 ; 乙 腈、甲 酸 为 色 谱纯，购 自 fisher 公 司; 二 硫 苏 糖 醇 为 分 析 纯，购 自sigma 公司; 硫酸钠为分析纯，购自北京化学试剂 厂。地 特胰岛素原料分别来自进口企业和国内 企业。2. 1. 3. 4检 测 限 和 定 量 限制备浓度分别为 5gml 1 和 1. 5 gml 1 的溶液作为检测限和定量限溶液进样，测定结果定量限溶液和检测限溶液的信噪比分别约为 29. 2 和 9. 2，定量限和检测限溶 液的进样量分别约为 0. 1 g 和 0. 03 g，因此推算 信噪比为 10 和 3 时的定量限和检测限分别约为 0. 03 g 和 0. 01 g。当 有关物质检查时地特胰岛 22. 1方法与结果地特胰岛素的有关物质的测定2. 1. 1hplc 色谱条件采用 protronavi c4 色 谱 柱 ( 250 mm 4. 6 mm，5 m) ，流动 相 a 为 0. 2 mol l 1 硫 酸 钠 缓 冲 液( ph 2. 3 ) 乙 腈 ( 82 18 ) ，流 动 相 b 为 水 乙 腈 1素进样量为 70 g( 3. 5 mgml溶液进样 20 l)时，该检测限下能检出样品中含量低至 0. 015% 的有关物质。药物分析杂志 chin j pharm anal 2014，34( 8) 1499 图 1 地特胰岛素主成分和有关物质系列色谱图fig 1 serial chromatograms of main component and the largest related substancea 全图( full scale)b 放大图( baseline expanded)2. 1. 3. 5专属性研究 取地特胰岛素原料，照文献指导分别进行高温高湿、强酸、强碱、强光照和强氧 化破坏试验，并用 0. 01 moll 1 的盐酸制成约 3. 5 mgml 1 的溶液7，进样测定。结果表明强碱作用 后样品破坏最严重，主成分几乎完全降解，其他破坏 作用下也会产生大量降解产物，这些降解产物色谱 峰在建立的色谱条件下均能与主峰有效地分离开， 具有良 好 的 分 离 度，如 图 2。此 外，经 dad 全 波 长 扫描该条件下分离的主峰均为单一峰，重组人胰岛 素和苯酚及间甲酚在该色谱系统上与地特胰岛素也 能完全分离，不会干扰样品的测定。表明该方法具 有良好的专属性。质荷比 检 测 范 围 为 300 2000 amu，应 用 数 据 依 赖方式进行二级质谱扫描，每次全扫描后做 10 次二级扫描，母离子质核比宽度为 2 amu，35% 标准碰撞能量，动态排除时间为 15 s。2. 2. 2供试品溶液的制备将 80 放置 6 h 后的地特胰岛素用 0. 01 moll 1 的盐酸制成约 10 mgml 1 的溶液，取 100 l 进样，收集地特胰岛素高效液相色谱分离的地特胰岛素主峰 ( det st) 以及相对保留时 间 约 1. 05 的 最 大有关物质 峰 组 分 ( det s) ，于 低 温 浓 缩 离 心 仪 中浓 缩 抽 干，加 纯 水 溶 解，用 固 相 萃 取 仪 和 oasis hlb 固相萃取柱进行脱盐和纯化处理8，再于低温 浓缩离心仪中浓缩冻干，lc ms / ms 测定前将处理 后的冻干产物用 20 mmoll 1 tris 盐酸( ph 8. 0) 溶解，加入终 浓 度 10 mmol l 1 的 二 硫 苏 糖 醇9，30 孵育 30 min，即得还原化的供试品溶液。a 链相对分子质量测定2. 2. 3取经固相萃 取 和 dtt 还原处理后的供试品溶 液 1 l，注入 lc ms 仪，反相柱分离 a 链、b 链后进行质谱测定，结果det sta 链的相对分子质量为2383. 02，与理论相对分子质 量 一 致，而 det s 的a 链测定的相对分子质量为 2384. 00，如图 3 所示，比 det st 增加 了 1，根据文献报道蛋白相对分子 质量增加 1 很可能是序列中的谷氨酰胺或天冬酰胺残基发生了酰胺水解而脱氨基，使得其分子量增加了 110 11。而在 a 链第 21 位氨基酸残基为天冬酰 胺，且 a 链只有这 1 个天冬氨酸，因此推测 det s 可能为 a21 位的脱氨基降解产物。2. 2. 4 b 链相对分子质量测定b 链的质谱鉴定结果表明 det s 和 det st三电荷和四电荷离子峰的质核比一致，对应 b 链的相对分子质量均 为 3538. 86，如 图 4，均 与 理 论 相 对分子质量一致，表明该有关物质组分的 b 链未发生变化。图 2 不同破坏试验下有关物质的分离色谱图fig 2 separation chromatograms of related substances in different stress-ing testsa 强氧化( powerful oxadation)b 强酸( strong acid)c 高温高湿( high temperature and wet) d 强光照( strong light) e 强碱( strong alkali)2. 22. 2. 1最大有关物质组分鉴定lc ms 条件液相色 谱 分 离 采 用 acquity uplc beh300 c18柱( 2. 1mm 100 mm，1. 7m ) ，流 动 相 a 为 含0. 1% 甲酸的水溶液，流动相 b 为含 0. 1% 甲酸的乙腈溶液，30 min 内 b 相由 5% 升至 30% ，流速为 300nlmin 1 ，洗脱时间为 30 min。质谱离子源为纳升级电喷雾离子源，采用正离子模式检测，离子传输毛细管电压为 1. 9 kv，离子传输毛细管温度为 200 。药物分析杂志 chin j pharm anal 2014，34( 8) 1500 图 3 地特胰岛素( a) 和最大有关物质( b) 的 a 链相对分子质量测定fig 3 measurement of relative molecular mass of a chain of insulin detemir ( a) and the largest related substance ( b)2. 2. 5a 链 ms / ms 碎片分析提取 det st 和 det s 的 a 链的母离子进行ms / ms 碎片分析，分析图谱如图 5 所示。分别比较det st 和 det s 的 n 端 b 系列碎片峰与 c 端 y 系列碎片峰，在 det st 的碎片峰中可以检测 到与理论相对分子质量一致的连续 b 系列和 y 系列碎片峰，而在 det s 的碎片峰中也可以检测到与理论相对分子质量一致的连续 b 系列碎片峰，只有b21 碎片峰的测定相对分子质量比理论相对分子质量增加了 1，同时可检测到均比理论相对分子 质 量增加 1 的 y 系列碎片峰，据此可以确证 det s 为地特胰岛素 a 链第 21 位天冬酰胺发生脱氨基的降解产物。33. 1讨论高级液相色谱柱的选择分别采用不同公司品牌 的 色 谱 柱 ( grace 公 司vydac c4 柱、waters 公 司 symmetry c4 柱、phenome-non 公 司 jupiter c4 柱 以 及 shiseido 公 司 protronavic4 柱) 进行研究，结果表明 protronavi c4 柱与主要有关物质有最佳的分离效果，分离度大于 2. 0，而其他色谱柱分离 度 均 小 于 1. 8 ( 图 6 ) ，因此在后续的研 究中均采用 protronavi c4 柱进行分析。药物分析杂志 chin j pharm anal 2014，34( 8) 1501 图 4 地特胰岛素( a) 和最大有关物质( b) 的 b 链相对分子质量测定fig 4 measurement of molecular weight of b chain of insulin detemir ( a)and the largest related substance ( b)3. 2 有关物质测定色谱条件的确定地特胰岛素从分子结构上讲属于人胰岛素的类 似物，因此其化学特性及可能产生的有关物质也与人胰岛素有相似性。但除了氨基酸的增减或替换， 地特胰岛素还需通过化学合成方法连接脂肪酸链， 因而在结构上又比普通人胰岛素类似物更为复杂。由于脂肪链的加入，使得主峰在反相上的保留时间 大大延长，主成分与杂质之间的极性差异也相对变 小，因此在进行有关物质测定时要摸索更加适合的有机相浓度和洗脱梯度。本实验中参考了重组人胰岛素的流动相 组 成，加 大 b 相中有机相的比例，通 过调节洗脱梯度，不断改变流动相 b 的初始比例及 洗脱梯度，结果表明当流动相 b 起始为 35% ，45 min 内升至 67% 的条件下，洗脱 效 果 最 佳，如 图 7 ，此 时 主峰洗脱时 间 在 30 min 左 右，地特胰岛素峰与相 邻主要杂质峰之间的分离度能达到 2. 3 。得 到 的 主峰与杂质的分离效果要优于进口 注 册 所 采 用 的 方法。药物分析杂志 chin j pharm anal 2014，34( 8) 1502 图 5 地特胰岛素( a) 和最大有关物质( b) 的 a 链 ms / ms 碎片分析fig 5 ms / ms sequencing of peptide fragments with a chain of insulin detemir( a) and the largest related substance ( b)图 7 不同洗脱梯度分离效果色谱图fig 7 separation chromatograms using different gradient elutions流动相 a b 初始比例( initial ratio of mobile phase a and b) : a 70 30 b 67 32 c 65 35 d 63 37图 6 不同类型色谱柱的分离效果色谱图fig 6 separation chromatograms using different chromatographic columnsa symmetry c4 b jupiter c4 c protronavi c4 d vydac c4过程中，脱氨产物是最常见的降解 产 物，通 过 lc ms / ms 也证实了地特胰岛素的主要杂质就是 a21位的脱氨产物，这点与人胰岛素及其他类似物的性质是一致的。3. 3主要杂质分离通过建立的 p hplc 方法，与主峰临近的杂 质峰均 可达到基线分离，其中相对保留时间约为 1. 05 的杂质峰是常规保存 条件下和破坏条件下的 最大杂质峰，因此提取此峰进行了鉴定。蛋白在储存3. 4主要杂质鉴别通过对蛋白的骨架碎片峰组进行分析，尤其是n 端的 b 系列碎片以及 c 端的 y 系列碎片，可以推断出 蛋白的序列和结 构12。本 文 中 利 用 lc 药物分析杂志 chin j pharm anal 2014，34( 8) 1503 wei gang( 王伟刚) ，et al comparison of hplc and uplc forthe determination of insulin analogs( hplc 法与 uplc 法对比测定胰岛素类似物) j chin j biochem pharm( 中 国 生 化 药 物杂志) ，2012，33( 2) : 139cheng hai ping( 成 海 平 ) effects of stressing test on deter- mination of impurities during validation of the analytical proce-dure( 杂质检查分析方法建立过程中破坏性试验的意义和存 在的问 题 分 析) j chin j new drugs ( 中 国 新 药 杂 志 ) ，2008，17( 17) : 1548dias nc，poole cf mechanistic study of the sorption properties ofoasis hlb and its use in solid phase extraction j chroma-tographia，2002，56( 5) : 269dong biao( 董标) ，dong fang ting( 董方霆) ，wang jing lan( 王 京 兰 ) ，et al monitoring the process of bovine insulinunfolding by capillary zone electrophoresis( 毛 细 管 区 带 电 泳 监测牛胰岛素 的 去 折 叠 过 程) j chin j anal chem ( 分 析 化学) ，2001，29( 5) : 538krokhin ov，antonovici m，ens w，et al deamidation of asn gly sequences during sample preparation for proteomics: conse-quences for maldi and hplc maldi analysis j analchem，2006 ，78( 18) : 6645wang yong( 王勇) ，li shui ming( 李 水 明 ) ，he man wen( 何曼文) uncommon modifications and dehydration reaction in the analysis of lysozyme by matrix assisted laser desorption ioni-zation tandem time of flight mass spectrometry( 溶 菌 酶 基 质 辅 助激光解吸电离 串联 飞行时间质 谱分析中的不常见修饰 及脱水反 应) j chin j anal chem ( 分 析 化 学 ) ，2013，41( 4) : 494chen jing( 陈 晶 ) ，fu hua ( 付 华 ) ，chen yi ( 陈