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华中科技大学同济医学院硕士学位论文 d d p h 对h e c c m 促p a s m c s 增殖的 逆转效应研究 摘要 本实验以低氧内皮细胞条件培养液( h y p o x i a le n d o t h e l i ac e l l s c o n d i t i o n a lm e d i u m ，h e c c m ) 培养猪肺动脉平滑肌细胞( p u l m o n a r y a r t e r i a lm u s c l ec e l l s ，p a s m c s ) ，以婀t 为指标建立肺动脉平滑肌细 胞的增殖模型。采用r t - p c r ，免疫细胞化学染色方法检测p a s m c s 的骨桥 蛋白( o s t e o p o n t i n ，o p n ) 及a s m - a c t i n 表达并用流式细胞术观察细胞 周期时相分布，进而探讨d d p h 对合成表型p a s m c s 的逆转效应。结果表 明( 1 ) h e c c m 能显著促p a s m c s 增殖，降低p a s m c s 的q s m - a c t i n 含量 并促使其表达o p n ，表明h e c c m 促使p a s m c s ，由收缩表型转化为合成表 型。( 2 ) d d p h 对合成表型p a s m c s 有明显的逆转效应，表现为q s m - a c t i n 的含量回升，o p n 表达下降且该逆转效应有时间依赖性。( 3 ) h e c c m 可促 使p a s m c s 通过g 棚。期进入s 及g 。m 期，p a s m c s 由分化态进入增殖态； d d p h 则可使h e c c ) d 培养后的p a s m c s 停滞在g 。g 。期，重新呈现生理性的 分化态。结论：d d p h 对h e c c m 培养后的p a s h c s 表型转化有显著的逆转效 应，且呈时间相关性。 关键词：删峭m - a c t t n 骨桥蛋白，蝴锄c 谢碰 表型转化肺动脉平滑肌细胞砥氧 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 r e s e a r c hf o rt h er e v e r s i b l ee f f e c t so fd d p h o nt h e p r o l i f e r a t i o n o f p u l m o n a r y a r t e r i a ls m o o t hm u s c l ec e l lt h a tb y h y p o x i a e n d o t h e l i ac e l lc o n d i t i o n e dm e d i u m a b s t r a c t t o s t u d y t h ee f f e c t so f h y p o x i a l e n d o t h e l i ac e l l sc o n d i t i o n a l m e d i u m f h e c c m ) o n t h e p r o l i f e r a t i o n o f p u l m o n a r y a r t e r i a lm u s c l e c e l l s ( p a s m c s ) m i ta s s a yw a s u s e dt ot e s tt h ep r o l i f e r a t i o n ，r t p c ra n d i m m u n o - c y t o c h e m i s t r yw e r e u s e dt oi d e n t i f yt h ee x p r e s s i o no f a - s m - a c t i na n d o s t e o p o n t i n ( o p n ) ，t h e c e l lc y c l ew a so b s e r v e db yf c m r e s u r s ：( 1 ) h e c c m c o u l dp r o m o t et h ep r o l i f e r a t i o no fp a s m c s ，d o w n - r e g u l a t et h e i re x p r e s s i o n o fa - s m - a c t i na n de l e v a t et h ee x p r e s s i o no fo p n i tt e s t i f i e dh e c c m i n d u c e t h ep h e n o t y p et r a n s f o r m a t i o no fp a s m c s f r o mt h ec o n t r a c t i l et ot h es y n t h e t i c - ( 2 ) d d p h c o u l dr e v e r s e t h e p h e n o t y p e u a n s f o r m a f i o n o f p a s m c s a - s m a c t i ni n c r e a s e da n do p n d e c r e a s e d - - - w h i c h h a d t i m e d e p e n d a n t ( 3 ) h e c c mc o u l dp r o m o t ep a s m c s f r o mg d g lt osa n d g z l v l , w h i c hs u g g e s t e d p a s m c se n t e rt h ep r o l i f e r a t i o ns t a g e - h o w e v e r ， d d p hm a d ep a s m c se x p o s e dt oh e c c m b l o c ka tg o g ：。w h i c hp r e s e n t e d t h ec o n t r a c t i l e a g a i n c o n d u s i o n ：d d p h c o u l dr e v e r s et h e p h e n o t y p e t r a n s f o r m a f i o no fp a s m c s e x p o s e d t oh e c c m t h ea c t i o n w a s t i m e r e l a t i v i t y k e y w o r d s ： d d p h a s m o o t h m u s c l e a c t i n ，o s t e o p o n t i n ，h y p o x i a ， p u l m o n a r y a r t e r i a ls m o o t hm u s c l ec e l l s ，p h e n o t y p et r a n s f o r m a t i o n 2 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 前言 肺源性心脏病是一种严重危害人类健康的常见心血管疾病，低氧性 肺动脉高压( h y p o x i cp u l m o n a r yh y p e r t e n s i o n ，h p h ) 是其形成的关键 环节。肺血管结构重建( p u l m o n a r yv a s c u l a rs t r u c t u r a lr e m o d l e l i n g ， p v s r ) 是h p h 形成的一个重要病理过程，主要表现为肺动脉中膜平滑肌 细胞增殖、肥大，致中层肥厚，非肌性血管肌性化和细胞外间质成分增 多。近年来，p v s r 在h p h 形成中的作用越来越受到关注。血管内皮细 胞( v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ，v e c s ) 和平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l s ，v s m c s ) 是构成血管壁的主要细胞，两者在结构和功能上 关系密切，它们之间的相互调节，特别是v e c s 对v s m c s 的调节在血管舒 缩功能和血管壁结构的调节中起重要作用。研究发现：低氧可诱导肺动 脉内皮细胞( p u l m o n a r ya r t e r i a le n d o t h i l i ac e l l s ，p a e c s ) 分泌血 小板源陛生长因子( p d g f ) 、碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 、内皮素 - 1 ( e t - 1 ) 、血管紧张素i i ( a n g n ) 等多种介质，进而刺激中膜肺动脉 平滑肌细胞( p u l m o n a r ya r t e r i a ls m o o t hm u s c l ec e l l ，p a s m c s ) 增殖 肥大、迁移及胶原合成增加，引起p v s r 而发展形成h p h 。1 。这说明， 低氧条件下内皮细胞在p v s r 形成中具有极其重要的作用。 血管平滑肌细胞具有两种不同的细胞表型，在某些条件下可发生表 型转化。在胚胎发育期，有多分化能力的v s m c s 呈合成表型，表明细胞 处于旺盛生长状态；随着机体发育成熟，v s m c s 逐渐转化为收缩表型，成 为执行收缩功能的分化细胞州。在低氧等病理条件下，收缩表型的v s m c s 又可转化为合成表型，合成和分泌功能重新活跃嘞。这正是h p h 形成时 p v s r 的结构基础。因此，将具有活跃增殖能力的合成表型v s m c s 逆转为 执行正常收缩功能的收缩表型v s m c s 是治疗h p h 的关键。n s m a c t i n 和 3 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 o p n 是v s m c s 的重要表型转化标志，其是否表达或表达高低与表型转化密 切相关。在收缩表型的v s m c s ，o p n 几乎不表达，在一定刺激因素作 用下，v s m c s 由收缩表型转化为合成表型，o p n 明显表达，同时a s m - a c t i n 含量下降。去除刺激因素后，v s m c s 恢复到收缩表型，不表达o p n 及 a s m a c t i n 含量回升。m 1 。因此，将具有活跃增殖能力的合成表型v s m c s 逆转为执行正常收缩功能的收缩表型v s m c s ，可用d s m - a c t i n 的含量变 化及o p n 的表达与否作为表型转化的指标。 d d p h 1 一( 2 ，6 - d i m e t h y l p h e n o x y ) 2 - ( 3 , 4 - d i m e t h o x yp h n y l e s t h y l a m i n o ) p r o p a n eh y d r o c h l o r i d e ，即卜( 2 ，6 - - - 甲基苯氧基) 一2 一( 3 ，4 - 二甲氧基 苯乙胺基) 丙烷盐酸盐，是我国自行设计合成的一种抗高血压药物“”“。 本室已有研究表明，d d p h 能明显抑制h e c c m 对p a s m c s 的促增殖作用“” “小“3 ，并在细胞水平上对d d p h 促增殖的机理进行了初步探讨“”。亦有文 章报道d d p h 在组织水平上对p v s r 有一定的逆转效应m 1 。 本实验以h e c c m 培养p a s m c s ，以m t t 为指标，建立肺动脉平滑肌细 胞的增殖模型。采用r t - p c r ，免疫细胞化学染色等方法检测p a s m c s 的 o p n 及d s m a c t i n 表达并用流式细胞术观察细胞周期时相分布，进一步 探讨d d p h 对合成表型p a s m c s 的逆转效应，旨在为d d p h 最终成为治疗h p h 的有效药物的开发，提供重要理论和实验依据。 4 华中科技大学同跻医学院硕士学位论文 材料与方法 一、主要试剂： m 1 9 9 培养基( g b i c o ，u s a ) 胎牛血清( f b s ) ( g b i c o ，u s a ) ：一2 0 保存 s f m ( g b i c o ，u s a ) ：4 x 2 避光保存 胶原酶i ( s i g m a ，u s a ) 胰蛋白酶( d i f c 0 ) ：用p b s 配制成1 的储存液，0 2 2 u m 微孔滤膜过 滤除菌分装，- 2 0 c 保存备用 d d p h ( 南京药科大学) ：用p b s 配制0 0 2 m g m l 的溶液，0 2 2 u m 微孔 滤膜过滤除菌分装，一2 0 c 保存备用 谷氨酰胺( g l n ) ：用p b s 配制3 的溶液，0 2 2 u m 微孔滤膜过滤除菌 分装，2 0 保存备用 肺动脉内皮细胞( p a e c s ) 培养液：m 1 9 9 粉剂9 8 9 加三蒸水溶解， 定容1 0 0 0 m l ，0 2 2 u m 微孔滤膜负压抽滤除菌，一2 0 2 2 保存备用。临用 时解冻，加入青霉素l o o u m l 、链霉素l o o u g m 1 、0 0 3 谷氨酰胺、 2 0 胎牛血清，5 6 碳酸氢钠调p h 至7 2 - 7 4 肺动脉平滑肌细胞培养液( p a s m c s ) ：配制同p a e c s 培养液 四甲基偶氦唑盐( m t t ) ( a m r e s c o ，u s a ) ：配制5 m g m 1 的储存液。称 取5 0 m g m w t ，溶于i o m l p b s 中，避光充分溶解后，0 2 2 u m 微孔滤膜过 滤除菌，e p 管分装( 1 m l 管) ，4 c 或一2 0 c 避光保存 二甲基亚砜( d m s o ) 碘化丙啶( p i ) ( s i g m a ，u s a ) ：用0 0 1 m p b s ( p h 7 2 ) 溶解后配成 l o o u g m l 储存液( 含t r i t o n x1 0 01 0 ) ，4 。c 避光保存 r n a s e a ( s i g m a u s a ) ：配成l m g m l 储存液，一2 0 2 2 保存 5 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 d 一平滑肌肌动蛋白单克隆抗体( 武汉博士德公司) s a b c 免疫组化试剂盒( 武汉博士德公司) d a b 显色试剂盒( 武汉博士德公司) t r i z o l 试剂( 国产) r i p c r 试剂盒：m - m l v 逆转录酶、o l i g o d t 、5 x 逆转录b u f f e r 、d n t p 、 t a q d n a 聚合酶、1 0 p c r b u f f e r ( p r o m e g a ，u s a ) p c rm a r k e r ( t a k a r a 生物工程公司) 琼脂糖( s i g m a ，u s a ) 溴化乙锭( e b ) ( s i g m a ，u s a ) l t b e 电泳缓冲液：在8 0 0 毫升双蒸水中溶解1 2 1 9 t r i s 碱，5 1 3 5 9 硼酸，3 7 2 9 e d t a ，定容至1 0 0 0 毫升。 o s t e o p o n t i n 检测引物( 8 5 7 b p ) ：p r i m e r 5 0 设计，大连赛百盛生物 技术有限公司合成 s e n s e5 t g ct 从a g cc t ga c cc a tc t3 a n t i s e n s e5 a t tt t ct c cc a cc t cg c ta c3 g a d p h 内参照引物 二、主要仪器与器材： 超净工作台( 江苏苏州净化设备公司) 恒温二氧化碳培养箱( s h e l l l a b ，u s a ) 电子精密天平( 奥豪斯上海公司) 台式低速离心机( 上海安亭科学仪器厂) 台式高速离心机( 上海医用分析仪器厂) 低温高速离心机( b e c k m a n 公司) 恒温水峪箱( 北京医疗设备总厂) 倒置显微镜( 重庆光学仪器厂) 6 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 u - 2 0 0 0 可见光一紫外光分光光度计( 日本岛津仪器厂) f a c s t a r 流式细胞仪( b d ，u s a ) t i t y 一3 全自动图象分析仪 p t c 一1 0 0 p c r 仪 恒压恒流电泳仪( 北京市六一仪器厂) 紫外分析仪( 北京新技术应用研究所) 旋涡混合仪( 上海环球物化仪器厂) 上海天能凝胶图像处理系统 6 孔、9 6 孔培养板( c o s t a r ，u s a ) 5 0 m l 细胞培养瓶( c o s t a r ，u s a ) 玻璃培养瓶( 国产) 三、方法： i 、猪肺动脉内皮细胞( p a e c s ) 的培养”： 将幼年猪心肺连同取出，无菌条件下剪开心包，分离肺动脉至左右 肺门，剪下肺动脉，用含青霉素1 0 0 u m l 、链霉素1 0 0 u g m l 的p b s 漂洗 数次，夹闭断端，向肺动脉腔内注满0 2 5 胰蛋白酶溶液3 7 1 ：水浴消化 1 5 - 2 0 分钟。吸出消化液，加入lm lp a e c s 培养液( 终止消化) 离心 ( 1 0 0 0 r p m ，5 分钟) 弃上清，加入适量p a e c s 培养液，吹打制成细胞悬 液，转入培养瓶，置于3 7 。c5 c 0 t 培养箱中培养，每三天换液一次。 细胞长满瓶壁后，吸出培养液，向培养瓶中加入卜2m l0 2 5 胰蛋 白酶溶液，使酶液完全覆盖贴有细胞的瓶壁。室温下消化约1 分钟至镜 下见多数细胞已回缩，弃消化液，加入p a e c s 培养液，用吸管吹打瓶壁 上的细胞，使之脱落形成细胞悬液，按1 ：3 比例接种于培养瓶。当细胞 长满时可再次传代。 2 、猪肺动脉平滑肌细胞( p a s m c s ) 的培养： 7 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 消化法原代培养：以上述方法取猪肺动脉干，纵行剪开，固定于橡 皮垫上。手术刀轻刮内膜两次，p b s 充分冲洗，切割剥离中膜内i 3 2 3 肌层，切成i m m 3 大小组织块，置于2 2 m 1 胶原酶液( 4 m g 胶原酶，2 m l s f m ，0 2m lf b s ) 中，摇床晃动，3 7 c ，1 0 0 次分。消化至组织快变 透明，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清，加入p a s m c s 培养液，悬浮转入培 养瓶，置3 7 5 9 6 c 0 ：培养箱中培养，每三天换液一次，生长融合后消化传 代。 贴块法原代培养：将按上述方法切成的1 珊n 3 大小组织块以0 5 脚 间距排列在培养瓶壁，加入p a s m c s 培养液，有组织块的瓶壁在上置于 3 7 5 c 0 。培养箱中。静置2 3 小时，待组织快贴壁后，轻轻翻转培养瓶， 使组织块浸在培养液中，继续培养。每三天换液一次，一周后细胞可从 组织快边缘爬出，当有较多细胞生长融合可进行原瓶传代。 3 、内皮细胞条件培养液( h e c c m 与n e c c m ) 的制备“”： 第三代生长融合的p a e c s ，弃培养液，加入s f m ，随机分成两组，一 组直接置于3 7 ( 3 5 c 0 , 培养箱；另一组通入5 0 2 、9 0 n ：、5 c 0 。，分别培 养2 4 小时后收集相应培养液，0 2 2 u m 微孔滤膜过滤，郎得n e c c i h 和 h e c c m ，一2 0 保存备用。 4 、细胞增殖指标( 采用改良的姗盯法) “”： 调整第三代p a s m c s 密度为5 - 8 x1 0 4 m l ，以l o o u l 孔接种于9 6 孔培 养板，2 4 小时后弃去原培养液，p b s 洗两次，每孔加入s p m i o o u l ，2 4 小 时后弃s f m ，再加入条件培养液l o o u l 孑l 。培养一定的时间后，弃条件 培养液，每孔加入1i o u l m t t 反应液：l o o u ls f m + i ou l m t t ( 5 m g m 1 ) ， 3 7 1 3 5 c 0 。培养箱孵育4 小时，吸出8 0u l m t t 反应液，每孔加入1 5 0 u l 二甲基亚砜( d m s o ) ，小心吹打使甲充分溶解，转入e p 管，用d m s o 稀释 至3 1 0 u 1 立即在u - 2 0 0 0 紫外一可见光分光分析仪上检测在5 7 0 h m 的吸光 8 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 度( o d ) 值。0 d 值与活的细胞数呈正比。 5 、r t - p c r 检测o p n ： ( 1 ) t r i z o l 试剂提取细胞总r n a ： 将第三代p a s m c s 接种于六孔培养板或2 5 m l 培养瓶，细胞生长接近 融合时，弃培养液加入s f m ，2 4 小时后换用条件培养液。作用一定时间 后，用t r i z o l 试剂快速提取各组p a s m c s 的r n a 。基本步骤如下： 六孔培养板每孔或2 5 m l 培养瓶每瓶加t r iz o l 试剂0 6 - 0 8 m l ， 室温下直接变性裂解细胞，将变性裂解液转入e p 管中； 加氯仿0 1 - 0 2 m l ，振摇1 5 秒，室温放置5 分钟左右； 4 c 离心，1 2 0 0 0 r p m ，1 5 分钟； 取上清( 记录体积) 转至另一e p 管，加等体积异丙醇，混匀后 室温置1 0 分钟； 4 离心，1 2 0 0 0 r p m ，1 0 分钟： 弃上清，加7 5 乙醇洗涤沉淀； 去上清，d e p c 水溶解沉淀立即进行逆转录。也可用7 5 z , 醇沉淀 置一7 0 保存。 ( 2 ) 逆转录得到e d n a ： 以提取的总r n a 为模板，加入o l i g o d ( t ) ，。随机引物，在m _ 札v 逆 转录酶作用下完成c d n a 第一链的合成：总r n a ( 约l u g u 1 ) 2 u l ，o l i g o d ( t ) 。l u l ，d e p c 水1 3 u l ，混匀置7 2 水浴5 r a i n 以破坏r n a 的二级结 构，立即置于冰浴防止二级结构重新形成。加5x 逆转录缓冲液5 u l ，d n t p 3 u l ( 4 种d n t p 混合液，每种d n t p 均为1 0 m m ) ，m m l v 逆转录酶l u l ( 2 0 0 u u 1 ) ，反应总体系为2 5 u l ，混匀，4 2 温育l h 后9 5 5 - l o m i n 。 一2 0 保存 ( 3 ) p c r 扩增： 9 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 采用2 5 u i 反应体系，e d n a2 u l ，p c rb u f f e r ( 1 0 x ) 2 5 u l ，m g c l 。l _ 5 u l ，d n t p0 5 u l ，三蒸水1 6 u l ，引物各l u l ，t a q d n a 聚合酶0 5 u l ， 混匀后，9 5 变性5 m i n ，9 4 5 0 s e c ，5 3 5 5 0 s e e ，7 2 5 5s e c ，循 环次数3 2 次，全部周期结束后于7 2 cl o m i n 做终止前延伸。反应结束后 取p c r 产物5 u l 加l u l 溴芬蓝点样液( 6 ) 点样于1 琼脂糖凝胶。电泳 结束后利用凝胶图象处理系统对电泳条带进行半定量分析，结果以目的 片段与参照片段的净面积比值表示。 6 、流式细胞仪检测细胞周期时相分布： 收集经条件培养液培养的的p a s m c s 活细胞悬液( 胰酶消化) ，p b s 洗 涤至两次，用预冷的7 0 乙醇固定，4 1 2 保存过夜( 一2 0 下可放置一个 月) 。测定前离心弃固定液，p b s 洗涤一次后再加1 0 0 0 u l p b s ( 细胞数少， p b s 量可酌减) 成细胞悬液，在其中加入2 0 u l r n a s e a 和5 0 u l p l ，闭光放 置3 0 分钟，于流式细胞仪检测激发波长为4 8 8 n m 处的红色荧光，结果用 细胞周期分析软件处理。 7 、免疫细胞化学染色检测a - s m - a c t i n ： 取已高压灭菌的清洁条形血盖片放入六孔培养板或培养瓶，将第三 代p a s m c s 接种于这种六孔培养板或培养瓶内，置于3 7 c 5 c 0 , 培养箱内 培养。待细胞生长接近融合时，弃培养液，加入s f m 。2 4 小时后弃去s f m ， 换用相应的条件培养液。作用一定的时间后取出附有p a s m c s 的血盖片， p b s 漂洗两次，于等体积丙酮乙醇混合液( 4 预冷) 中室温固定1 5 m i n ， 取出晾干，一2 0 保存备用。 采用链霉亲和素一生物素( s a b c ) 法进行单层细胞免疫细胞化学染色， 抗体为小鼠抗人单克隆抗体。基本步骤如下： ( 1 ) 各组细胞片在含0 1 t r i t o n x 1 0 0 的p b s 缓冲掖中处理 l o - 1 5 m i n ，蒸馏水洗2 次； 1 0 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 ( 2 ) 在0 3 h 2 0 2 中1 5 2 0 分钟，蒸馏水洗2 次； ( 3 ) 滴加正常山羊血清封闭液，室温2 0 分钟。甩去多余液体，不洗： ( 4 ) 滴加( 鼠抗人一抗a s m a c t i n 单克隆抗体) 3 0 5 0 u i ，4 孵 育过夜； ( 5 ) 0 0 1 m p b s 漂洗，2 分钟3 次： ( 6 ) 滴加生物索化山羊抗小鼠i g g ，3 7 。c ，3 0 分钟； ( 7 ) 0 0 l m p b s 漂洗，2 分钟x 3 次； ( 8 ) 滴加试剂s a b c ，3 7 c ，3 0 分钟； ( 9 ) 0 0 l 肝b s 漂洗，5 分钟x 4 次： ( 1 0 ) d a b 显色，l o 一1 5 分钟，蒸馏水充分洗涤； ( 1 1 ) 常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 阴性对照以p b s 代替一抗，其余步骤及试剂不变。光镜下用t i t y - 3 型图象分析仪对各组p a s m c s 内c t - s m - a c t i n 的表达进行定量分析。在相 同的放大倍数( 2 0 0 ) 下，于同次实验的各组p a s m c s 细胞片中随机选 取和测定2 0 个细胞的平均吸光度( a ) 值。 8 、实验分组： h e c c m 和n e c c m 分别培养p a s m c s 2 4 小时、3 6 小时、4 8 小时、6 0 小 时，再加入d d p h 分别作用2 4 小时、3 6 小时、4 8 小时、6 0 小时，共分 4 0 组。h e c c m 和n e c c m 分别简写为呱和n e ，h e c c m + d d p h 、n e c c h i + d d p h 分别简写为h e + d 及n e + d 。d d p h 的终浓度为2 0 0 n g m 1 9 、统计学处理： 以上数据以平均值标准差( i 士s ) 表示，组间比较采用单因素方 差分析，两组间比较应用s t u d e n tt 检验。 1 1 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 结果 、培养细胞的鉴定 1 、猪肺动脉内皮细胞( p a e c s ) 的鉴定 倒置显微镜下观察，细胞生长融合后呈单层镶嵌的铺路石状排列( 图 1 一1 ) 。 图卜l 培养融台的猪肺动脉内皮细胞呈铺路石状排列( 1 2 8 ) 2 、猪肺动脉平滑肌细胞( p a s m c s ) 的鉴定 倒置显微镜下观察，p a s m c s 融合后呈典型的“峰”和“谷”样结构 ( 图卜2 ) 。免疫细胞化学染色结果显示：细胞一s m - a c t i n 表达阳性( 图 i - 3 ) 。 图卜2 培养融合的猪肺动脉平滑肌细胞呈“峰”和“谷”样( 1 2 8 ) 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 图i - 3 猪肺动脉平滑肌细胞o - s m - a c t i n 表达阳性( 2 0 0 ) 二、h e c c m 及肋p h 对p a s l i c s 增殖的影响( 以枷旧的o d 值为指标) 结果见图2 - i 、2 - 2 ，结果指出( 1 ) h e c c m 具有极显著促p a s ) 矗c s 增 殖的作用，同n e c c m 组相比p o o l 。( 2 ) d d p h ( 2 0 0 n g m 1 ) 对h e c c m 的促增殖作用有极显著抑制作用，同h e c c m 组相比，p o 0 5 ；n e c c m 中加入 d d p h 对p a s m c s 的增殖无明显影响。 表- ih e c c m 及i ) d p i i 对p a s m c s 增殖的影响 0 d 值( - + s ，n ：8 ) c o n t r o l n e 2 4 h e 2 4 * n e 2 4 + d 2 4 h e 2 4 + d 2 4 0 4 5 1 0 0 1 1 8 0 4 4 5 0 0 1 2 3 0 6 7 3 0 0 1 2 9 0 4 3 9 0 0 1 4 3 0 4 9 3 0 0 1 2 5 蝴a 与其它各组相比，p o o l ，差异具有极显著意义 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 图2 - 1h e c c m 及d d p h 对p a s m c s 增殖的影响 三、d d p h 对p a s m c s 胞浆内的a - s m - a c t i n 表达的影响 ( 一) 各组p a s m c s 胞浆内的d s m a c t i n 表达 。一s m a c ti n ，经免疫组化染色呈棕黄色细丝状或条状均匀分布( 图 3 - 1 至3 4 ) 。图象分析统计结果( 见表一2 ，图3 5 ) 显示：( 1 ) h e c c m 能 极显著下调p a s m c s 的q - s m - a c t i n 表达，且在一定时间内该下调作用与 时间有相关性。衄c c m 组的a - s l l f - a c t i n 表达量明显低于n e c c m 组，同 n e c c m 组相比，p o 0 1 ；随着h e c c m 作用时间的延长，p a s m c s 的 q - s m - a c t i n 表达量降低，h e 2 4 、h e 3 6 、h e 4 8 组间两两比较，p o 0 5 。( 2 ) t t e c c m 培养一定时间后加入d d p h ，p a s m c s 的一s m - a c t i n 表达上调，随 着d d p h 作用时间的延长，d - s m a c t i n 表达量增加，同h e c c m 组相比， p o 0 5 。 1 4 华中科投，：学同济医学院硕士学位论文 剀31h e c c m 组p a s m c sq s m a c l i l 表达i 2 0 0 ) 幽3 2h e c c m + d d p h 组p a s m c s 口一s m a c ti n 表达( x2 0 0 ) 1 5 毕中科拄，、学同济医学院硕士学位论文 图3 - 3n e c c m 组p a s b i c sa s m a c t i n 表达( 2 0 0 ) 幽3 4n e c c m - d d p h 组p a s m c s 一s m a c t j n 表达( x 2 0 0 ) 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 n e 2 4 髓2 4 n e 3 6 i e 3 6 n e 4 8 h b 4 8 n e 6 0 h e 6 0 0 2 7 9 蝴0 3 1 + 0 2 7 9 0 0 1 30 2 8 6 0 0 1 40 2 8 4 0 0 1 70 2 8 5 _ * 0 0 2 8 0 1 8 2 如0 2 3 0 2 1 7 0 0 1 5 # 0 2 7 1 1 0 0 2 0 # 0 册0 0 1 7 # 0 2 9 4 _ + 0 0 2 0 # 0 2 8 2 0 0 2 10 2 8 5 0 0 2 80 2 9 0 o - 0 2 40 2 9 1 1 0 _ 0 3 00 3 0 0 _ + 0 0 3 2 0 1 6 5 _ - o 0 1 6 0 2 1 5 0 0 1 8 # o 2 5 7 + 0 0 5 酣0 2 9 8 - 0 0 1 4 # 0 2 9 9 土0 0 1 8 # 0 2 8 6 0 - 0 2 20 2 8 4 _ * 0 0 3 0n 2 8 5 虬0 3 70 2 9 4 - * 0 , 0 2 90 2 9 3 _ * 0 0 3 8 0 1 5 0 _ * o 0 1 5 0 2 0 9 0 0 3 甜0 2 5 3 0 0 1 辨0 2 8 0 0 0 2 2 1 # 0 3 0 7 0 0 3 鲫 0 2 9 5 _ + 0 0 2 2 0 2 9 8 - * 0 0 2 3n 2 9 9 0 0 4 50 3 0 5 0 0 2 10 3 0 4 0 0 2 5 0 1 4 0 - + 0 0 1 9 60 1 7 8 _ + 0 0 2 1 # 0 2 1 8 _ + 0 0 2 0 # 0 2 5 4 0 0 4 3 # 0 2 8 9 _ * 0 0 4 博 组与+ 组相比p 0 0 l ， 组间比较p 0 0 5 ；# 组与相应枷相比，p 0 0 1 图3 - 5d d p h 作用不同时间后- s m - a e t i n 表达 1 7 华中科技太学同济医学院顽士学位论文 ( 二) d d p h 对p a s m c s 的表型逆转效应分析 ( 1 ) h e c c m 培养定时间加入d d p h ，p a s m c s 的d s m a c t i n 表达量 回升，与相应的h e c c m 组相比，p o 0 5 。结果表明：d d p h 作用不同时间对合成表型p a s m c s 均有表型逆转 效应；d d p h 作用4 8 小时p a s m c s 表型己基本逆转恢复至正常态。 表- 2h e c c b i 培养3 6 小时后d d p i i 作用不同时间p a s m c s 的 a s h - a c t i n 表达( 娃s ，n = 2 0 ) # 组与 组相比，p o 0 1 ；# 组间相比，p o 0 5 ( # 组除外) ；与相应n 组相比 p o o l ( # + 、# 组除外) 1 8 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 图3 - 6 麟跚培养3 6 小时后肋p h 作用不同时间p a s i i c s 的a s l - a c t i n 表达 四、r t - p c r 检测o p n ( 1 ) h e c c m 培养3 6 小时p a s m c s 显著表达o p n ，n e c c m 培养3 6 小 时无o p n 表达。( 2 ) 在h e c c m 培养的基础上加入d d p h ，可显著降低o p n 的表达，且有时间依赖性。h e 3 6 + d 组与h e 3 6 组相比，p o 0 1 ；h e 3 6 + d 2 4 组与h e 3 6 + 1 ) 3 6 组相比，p o o l ，而h e 3 6 + d 4 8 组、h e 3 6 + d 6 0 组则无o p n 表达。说明，h e c c m 可使p a s m c s 由收缩表型转化为合成表型；而d d p h 则对此表型转化有逆转效应，且d i ) p h 作用4 8 小时已基本恢复为正常收 缩表型。 1 9 塑壁丝点耋旦量鉴兰堕 塑圭兰垒鎏墨 1 ：h e 3 6 + d 2 42 ：h e 3 6 t d 3 6 3 ：h e 3 6 + d 4 8 4 ：h e 3 6 + d 6 05 ：3 66 ：疆3 6 + d 3 6 圈4 - 1 奄法鳍菜 淹一3o p n 的r t p c r 半定凝结果 分组 净面积比值 莲3 6 h e 3 6 h e 3 6 + d 2 4 丑三3 6 + d 3 6 艇3 6 + d 4 8 o 1 4 3 6 0 土o 0 7 0 7 + 1 1 2 9 7 0 0 8 4 3 静 0 7 9 8 3 童0 。0 s 8 9 o $ 组与# 、a 组相比，p o 0 1 ；4 魏与缎相臼：p o o l 匿4 - 2i i e c c m 跨葵3 8 、聪蠹d d p h 侔瘸苓嗣露阂o p n 表这 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 五、细胞周期时相分析结果 ( 1 ) h e 3 6 组与n 3 6 组相比，g 。g 。期细胞明显减少，s 期和g 。m 期细 胞则明显增多。( 2 ) h e c c m 培养3 6 小时后加入d d p h ，g o g 期细胞明显增 多，s 期和g 。m 期细胞明显减少。随着d d p h 作用时间延长，g 0 g 。期细胞 逐渐增多，s 期和g ：m 期细胞则逐渐减少，h e 3 6 + d 2 4 、h e 3 6 + d 3 6 和h e 3 6 + d 4 8 组间细胞周期分布差异比较明显，而h e 3 6 + d 4 8 组与h e 3 6 + d 6 0 组相比， 变化不大。( 3 ) n e 3 6 组与n e 3 6 + d 3 6 组相比，细胞周期分布变化不大。 表明，h e c c m 可促进p a s m c s 的d n a 合成，从静止期进入有丝分裂期，促 进p a s m c s 增殖；d d p h 则对h e c c m 的促p a s m c s 增殖有抑制和逆转效应， d d p h 作用4 8 小时已基本恢复至正常状态。 表一4h e c c m 培养3 6 小时后d d p h 作用不同时间细胞周期分布百分比 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 h e 3 6 h e 3 6 + d 3 6 h e 3 6 + d 2 4 h e 3 6 + d 4 8 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 h e 3 6 + d 6 0 n e 3 6 + d 3 6 图5 1p i 染色法检测细胞周期分布 n e 3 6 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 讨论 细胞表型转化是指细胞在病理情况下发生形态、结构与功能的改变， 又叫细胞重塑。v s m c s 有很强的可塑性，在胚胎发育期，v s m c s 处于旺盛 生长状态，里合成表型；随着机体发育成熟，v s m c s 逐渐转化为收缩表型， 成为执行收缩功能的分化细胞。在某些病理情况下，如动脉粥样硬化， 肺动脉高压，血管再狭窄等，v s m c s 又可由收缩表型转化为合成表型1 ， 表现为肌丝消失、高尔基复合体及大量内质网形成。o 。低氧是肺动脉 高压形成的关键因素，不仅可诱导p a s m c s 自分泌某些生长因子，促进自 身增殖。“，而且可刺激v e c s 合成、分泌p d g f 、e t 一1 、a n g h 、b f g f 等多 种旁分泌因子促使p a s m c s 发生表型转化、增殖及迁移，最终导致肺血 管结构重建，而这正是肺动脉高压的基本病理变化。因此将具有活跃增 殖能力的合成型p a s m c s 逆转为可执行正常收缩功能的收缩型p a s m c s 是 治疗肺动脉高压的关键问题。本室已有研究结果表明：h e c c m 能显著促进 p a s m c s 的增殖，d d p h 则具有显著抑制h e c c m 促p a s m c 增殖的作用：并在 细胞水平上对d d p h 抑制增殖的机理进行了研究“州”m ”。在此基础上，本 实验进一步探讨了d d p h 对h e c c m 促p a s m c s 增殖的逆转效应。 本实验中，我们以h e c c m 促p a s m c s 增殖，建立p a s m c s 的增殖模型。 首先我们以m t t 比色法检测了细胞增殖情况，结果显示h e c c m 能显著促 进p a s m c s 的增殖，d d p h 则可明显抑制h e c c m 的促p a s m c s 增殖作用，与 本室已有研究结果相符。在此基础上，我们进一步以n s m a c t i n 和骨 桥蛋白为指标探讨了d d p h 对p a s m c s 表型的逆转效应。 a s m - a c t i