（动物学专业论文）抗体芯片基本技术平台的建立及其在肝脏蛋白质组学研究中的应用.pdf

摘要随着人类基因组计划的基本完成，以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临。基因是遗传物质的载体，蛋白质才是生理功能的执行者。因此对基因组的研究有时并不能完全反映机体功能的变化，为了减少这种相对“误差”，迫切需要一种快捷，有效的蛋白质分析技术。蛋白质芯片技术应运而生。蛋白芯片( p r o t e i nc h i p ) 是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在玻片上，形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片，带有特殊标记的蛋白质分子( 抗体或抗原) 与之特异性结合，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的高通量互检。该技术所需蛋白质的量极少，检测反应相对较快，具有通量化，稳定性较好，灵敏度较高。目前在国内外这方面的研究都才刚刚起步。蛋白质芯片以蛋白质代替d n a 作为检测目的物，比基因芯片更接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。蛋白质芯片作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具，必将发挥越来越大的作用。因本课题是国家科技攻关计划项目“人类肝脏蛋白抗体库的构建与应用”中的子项目，其主要研究任务是：利用获得的单克隆抗体研制适合肝脏蛋白表达谱和功能研究的抗体芯片，探索提高标记效率和芯片敏感性的方法，研制成肝脏蛋白抗体芯片和配套试剂，并应用于肝脏蛋白质的定性、定量和相互作用等研究。我们在经过文献检索之后，选择了一个基于环氧基表面修饰玻片的抗原抗体结合反应体系，对在这一体系中抗原，抗体的固定方法、抗原抗体特异性结合反应、蛋白质的标记方法及信号检测等问题进行研究，并尝试将这一体系应用于肝脏蛋白质组学的研究。得到以下实验结果：1 预点样1 0 个拷贝点后，各蛋白质样品的荧光测量值趋于稳定，可正式点样。2 点样后的固定时间以2 4 4 8 h 为宜。时间过长或过短均会导致荧光测量值偏低。3 使用乙醇胺封闭缓冲液的封闭效果最好。最佳的抗原抗体特异性结合反应温度为3 7 、时间为2 h ，选择1 n l g m 1 作为最佳的点样浓度。4 当点样浓度一定时，靶分子浓度增加，荧光信号强度也相应增加，且靶分子浓度在1 n 咖l 一1 u g ，m l 范围内与荧光强度间有线性关系。i i5 应用建立的抗体芯片技术乎台，对人的四种肝脏总蛋白( 成肝胞浆蛋白、胎肝核蛋白、成肝匀浆蛋白、胎肝线粒体蛋白) 进行了检测分析，制备了含3 2 种单克隆抗体，共4 3 2 点的抗体微阵列，初步进行了肝脏蛋白质组的研究分析。得到以下初步结论：c b r 在胎肝线粒体蛋白中表达丰度较高，成肝胞浆蛋白中丰度最低。d c t 在成肝胞浆蛋白中表达丰度较高。a l b 在同一发育期的不同样本( 胎肝或成肝) 中表达趋于稳定，但在胎肝中的表达量高于成人肝。t f 在成肝匀浆蛋白中的含量最高。a 2 m 在成肝匀浆蛋白中的含量最高，成肝胞浆蛋白中的含量最低。6 探索了量子点荧光标记蛋白质的新方法。用n h s 对量子点进行功能化，经修饰的量子点可以与蛋白共价偶联。将功能化量子点标记蛋白用于抗体芯片的检测，初步实验证明功能化量子点可以应用于生物芯片检测的领域。7 出于研制可目视化检测芯片的需求，又探索了把金磁微粒作为标记试剂标记蛋白质。经标记的蛋白质用于抗体芯片检测，可用肉眼观察检测结果。此方法简便，操作简单。关键词：蛋白质芯片抗体芯片肝脏蛋白质组学量子点纳米金ia b s t r a c ta n t i b o d ym i c m a 啪yt e c h n o l o 留a n da p p l i 戗o ni nl i v e r _ l p m t e o m i c sw i t ht h eg c n o m es e q u o c so fs e v c r a lo r 霉 a n i s m sn o wi n 口_ l b l i cd a t 烟e s ，t b es c i c n t i cc 0 删u n i t yh sr c a l i z e dt h a ti ti st j n l et op m p a f b ft h cn e x ts t e p ：t h eu n d 盯曲m 血go fb i o l o 昏c a ls y s t c m so rs y s t e m sb i o l o g y g e n ec x p f c s s j m i 啪a h a yt e c ：h 加1 0 9 yh sc x p l o d e di nt h el 勰tf * ey e a 塔、i t hc o i n p k t i 衄o ft h ch u 衄g c 咖e州c c t i t su s eh a sb e e ns h o w n 跏s saw i d e 瑚留eo ff i c l d si n d u d i n gb u tn o tl i ：n l i t e dt ob i 呲a r k c rd i 吼，o v e r y ，口删c t i n gd i s c a s eo u t c o m e s 柚dt e s p o n s et 0t 坞a 切d e n t ，a 龉鹤s i g r c g u l a t i o nv i at i m ec 璐ea n d 0 rd 0 - m s p s c 懿p c 血b ，壮dd c t 咖n 2m o i e c u l a rm e c h 锄i s m s 卸d o rp a m w a y s 髂s o d 种e dw i t hap a r t i c u l 盯d i s 黜s t a t e w h a 馏留e n e sc t a i nt h ci n f b r n l a t i o nf b fl i f e ，t h ee n o o d e d 翻眦e i n sa n dr n a sf h l 6 n 雎a d ya l lt h ef i l c t i o n s ，胁r c p l i t i o nt o g i i l a t i o n a tp r c s 蛐t ，t h c 咒i sap e r c e i v e dd e m 锄df o rh i g h - t i l r o u 曲p u ta n dp m u da n a l y t i c a ld e v j c c s 髂r e s e 卸c ht o o l si ns y s t e m sb i o l o g y ，柚d ，i na d d i t i o n ，f o rn e wc 0 咀c e p t st oe x 仃a c tl m o w l e d g e 强d砌u e 丘o mt h e s ed a t a f o rt h i s 朋a s o n ，an e wt o c l l n o l o p 呵c a l l e d 砌1 t i b o d vm i 啪a n a y sh 髂b e e nd c v e l o p e dt 0 醛s sd i 丘b r c m i a le x p m s s i o nd i i 瞅l va tt h e 邮t e j nl e v e l a n t i b o d ym i a d a m y sc a l lb eu s e df b re x p r e 鹃i o np m a u n 譬o fh 岫d 坞d so ft h o u s a n d so fp f o t e i n ss i l n l l l t a n c o u s l y w i t ht h eg o a lo fi d t i f y i n gd i s e 勰e p r o t e i no rp m t e i p m t e i nr d a t i o n s h i p s 1 1 1 i st o p i ci st h es u b i t e m0 fn a 哟眦lk e yt e c h o l o 西髓r dp r o 肿m “t h ej n s t a u m t i o na n da p p l i c a t i o n0 fl i v e r - p r o t e i l la n t i b o d yd a t a b a s e ”h sm a i nt a s ki s ：u s i n zt l l ea c q u i m dm 衄o - a n t i b o d yt om a n u f a d u r ct l i ca n t i b o d yc h i p 也a tk p i n gw i 也l i v e r - p r o t d e x p 咒s s i o nc h a n 蛆df i l n c t i 咖r e s e a f c h ，i m 他s t i g a 血gt h cm e t h o do fr a i s c也el a b e l i i i ge f f i d e n c ya n dt h ec h i ps e 璐m v i t y ，r e s e 缸c h j n gt om 卸乱= t i l r ct h e柚m o l d yc h i p 缸dk i t s ，柚da p p l yi nt h cl i v 盯- p r o t c i n s 懈c a r c h s u c h 鹬o b r v a t i o n a lm e 船咖e n t ，口u a n t i t a t i v ed c t e 珊i a t i o n纽di n t e m c i i o e t c 。ht h i sm e s i s ，s p o t t i n gc o n c e 曲a t i o n ，p f o t e i ni l n m o b i l i z a l i o ns u b s t r a t e s ，t a r g e tl a b c l i n g 柚da 腼i t yn a c t i o c 0 d “i o nw e r cj 卫i v e s t i g a t c d ，a n dt h c 锄t i b o d vc h i po fl i v c r - 埘t c i nr e s e a r c h e sw 盯ea p p l i e d t h cm a i o rc o n 砸b u t i o 璐i n c l u d e 也ef o l l o w i n g 鹤p c c t s ：1 a f t c rp m 一1 0s p o tt o0 r d e r t l l ef l u o r c s o e n c cm e 弱u r e dv a l u eo fe a c ：hp m t e i ns 锄p l ei st e n di ns t a b i l i t v 。i h e nw cc a ns p o tf b 珊a l l v 2 a f t e rs p o t 血gt h e 丘) 【e dt i m eta ：k e2 4 _ 4 8 ha sp r o p e r b 0 t hl o g 姐ds h o nt i m ew i l l。c a u s et l i ef l u o r e s c e n c em e a s i 司v a l u el o w 3 h st h eb e s tc h o i c eu s i n ge a l u t i o nt or c m o v eu n b o 岫dp m t e i n t h eb e s t如t i g c - 锄t i b o d yp 删c l l l a r i t yo 咖曲i n 髓t e 唧n 鹏i s3 7 ，t i m ci s2 h ，c h s i n gt h e1m 咖ld o s et h e0 p t i m a ls p o t 血g o c n t 船t i 咖4 w h e ns 口o l l i n gc o n c e n t m i i w 弱d e 丘】m e ，m o r et h el a b e l i n gt a f 舻tn c c n t 删，h i 曲e rt h en u o 瑚啪s i 蟹皿a 1 a m dt h c 切塘c tc c e n t 阳以o nh a sal i c rr e l a t i o s h i pw i u lt h en l l 0 咒s c c n c es i 辨a li n1 n l h l - 1 0 i l 罂i n l 5 a p p l yt h ea n t i b o d yc h i pt e c h n i q u et oa n a l 、亿et h ep e r s o n sf o u rk i n d s 0 ft o t a li vp m t e i n ( a d u l th u m a nl i v e rh o m o g e n a t ep r o t e i 璐，a d u l th u m a n1 i v e rp l 踟ap m t e i n s ，f e t a lh u m a nl i v c rn u d e ip m t e i l l s ，f e t a lh u m a nl i v e rm i t o c h o n “a lp r o t e i n 曲，m a k et h ea n t i b o d yc h i pw i t l l3 2l 【i n d so fm o n o 姐t i b o d ya n dt o t a l4 3 2s d o t sf o rr c s e a r c h i n e 蛐a l v s i so ft l l el i v c rp r o t e i n g e tt h ef o l l o w i n gi n i t i a l呲【u s i o n ：c b re x p r c s s e st h ep l e n t i f i i ld e 虹e eh i g l l c ri n f c t a lh u m a nl i v e rm i t o c h o n d r i a lp m t c j n s ，l o w e s ti a d u nh u m a nl i v c r 口l 踟ap r o t e i i l s d c x re x p r c s s 鹤t h ep l e n t i f i l ld e 伊e eh i g h e ri a d u l th u m 蛆l i v c rp l 龉m ap m t e i n s a l bi si nt h ed i f f e r e n ts 锄p l e ( a d u l th 啪a nl i v e ro rf e t a lh u 蚴l i v e r ) t l l a ts 锄eg r o 、t he x p e c tt h ee x p r e s s i o ni st e n di ns t a b i l i t y ，b u th i 曲e ri na d u l th u m 如l i v e rt h 锄i nf c t a ih u m a nl i v c r t fe x p 蟠e st h ep l e n t i f i i ld e p 田暑eh i 曲e ri na d l i l th 砌a nl i v e rh o m o g a t cp r o t e 泌a 2 me x p 聆辐e st h ep l c n t i f i l ld e g ch i g h c s ti na d u nh u m a nl i v e rh o m o g c n a t ep r o t e i n s ，l o w e s ti na d l l l t l m m nl i v 盯p i a s m ap i o t e i n s 6 h i v e s t i g a t i l l gt l l en e wm e t h o do fq dn u o r e s c c em a r k i n gp r o t e j n u s 面喀t h cn h st 0d r c 蟠q d ，w h i c hc 蛆c o v a l c n c ec o u p l i l l g 、j i r i t l lp r o t e i n t u mt h ef l i n c t i a lq dl a b e l i gp r o t e i nt 0u s e df o r t h ea n t i b o d yc h j p ，w h i c hp m v et h t 啪b ea p p l yi nt h eb i o 枷口o a i r a yt od e t e c t 7 p m c c e d 劬mr c s e a r c hn e e dt om 觚u f a c t u t l l ee y e s s e ee x 帅j n a t i o nc h i p ，w ei n v 髓t i g a t e dt h eg o l d p 猢a 尽皿e t i cm i c r o s p h e r ct ol a b c lp m t e i n nc 蛆u s ef o ra n t i b o d yc l l i pd e t c c t i o nb yt i l el a b e l i n gp r o t e i n a l s ot h er e s l l l t 啪b eo b s e r v c db ym en a k c dc v e t h j sm c 恤o di ss j l l l 口l e ，o d e r a t emb r i e f i 【e ”m r d s ：p r o t c i m i c r 0 锄y锄t i b o d ym i c r 0 锄y1 i v c f - p m t c o m i c sq u 柚t u md o tn a n 0 9 0 l dv缩略语表英文简写英文全称中文全称3 - 翻y d d y l o x y p r o p y lt r i m e l h o x y s n a m3 缩水甘油环氧丙基三甲g l 呵s- s n 粕e氧基硅烷b s ab a v i es e n i ma l b 哪i n牛血清白蛋白日：bh c m 咄b i n血红蛋白d m s od i m e t h y l s u l f o x i d e二甲基亚砜n h sn _ h 扣r o x y s u c c i n i m i d en 羟基琥珀酰亚胺d c cn ，n - d i c y c l o h c x y l r b l 删d e二环已基碳二亚胺q dq u a n t i l md o t量子点c yc y n m青色素染料m sm a s p l c c o m e t r y质谱p m 陌p h o t o m u l t i p l i ht i i b e光电倍增管c c dc h a i g e c o 叩k dd e v 娩电荷藕合器件图像传感器c b r( k k y fr 猷h c 极蛇一如持l ：| + 。坦r “蚀缸g 阐电甚f “d c x r研曲山吲饥一咖k 幽e b 瞎双羰基肛木酮糖还原酶f n丘b n e c d n纤维连接素a 2 m4 倒口一j 一”m a 0 8 打占i 舶a 2 一巨球蛋白c p s lc a i b a m o y lp h o s p b a ks y m h e t a 辩i氨基甲酰磷酸合成酶if r l尾州协幻k 于。9 尹e 融铁蛋白轻多肽h s d l l b l鼢? 伊洒勺山呵吣d d脂肪细胞中过表达羟基类“卜b e 缸 如o k s 翻q 1固醇1 1 一b 脱氢酶一1y 8 0 i ：i3 西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：赵整工一台年占月7 日指导教师签名：型年月日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：客辨h 占年厶月日西北大学硕士论文- j l刖罱1 本课题的研究目的和意义随着人类基因组测序的顺利完成，使得功能基因组的研究成为可能。以蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越重要。用于研究蛋白质组学的抗体阵列芯片分析系统正是为了适应这一要求而发展起来的一种全新的技术，国内外在这方面的研究才刚刚起步【”。基于蛋白质作为生命活动的功能执行体，人类基因组绝大部分基因及其功能有待于在蛋白质水平上的揭示与阐述，为探索生命秘密，政府间“国际人类蛋白质组组织”( 简称h u p 0 ) 已宣布成立，并同时提出了“人类蛋白质组计划”。这是继人类基因组计划之后最大规模的国际性科技工程，也是2 1 世纪第一个重大国际合作计划。这一计划首批行动计划包括“人类肝脏蛋白质组计划”和“人类血浆蛋白质组计划”，分别由中国和美国科学家牵头执行。由中国科学院院士、中国军事医学科学院放射医学研究所所长贺福初领导执行的“人类肝脏蛋白质组计划”，长远意义和价值在于将为人类所有组织、器官、细胞和蛋白质组计划提供模式与示范。该计划的具体科学任务是完成“二谱、二图、三库”。即：建立符合国际标准的肝脏标本库；构建蛋白质表达谱和蛋白质修饰谱；绘制蛋白质相互作用连锁图和细胞定位图；发展规模化抗体制备技术并建设肝脏蛋白质抗体库；建立完整的肝脏蛋白质组数据库，并寻找药物作用靶点和探索肝脏疾病防、诊、治的新思路和新方案。本课题是国家科技攻关计划项目“人类肝脏蛋白抗体库的构建与应用”中的子项目( 课题编号：2 0 0 4 b a 7 1 1 a 2 0 ) 。以此为背景，我们在经过广泛的调查研究之后，认识到与蛋白质芯片相关的诸如载体的选择、蛋白质的固定、蛋白质的标记方法、蛋白质在固相表面的生物学活性及检测技术等基础工作的重要性。我们设计了一个基于环氧基表面修饰玻片的抗原一抗体结合反应体系，对在这一体系中抗原航体的固定方法、抗原一抗体特异性结合反应及信号检测等问题进行研究，并尝试将这一体系应用于肝脏蛋白质组学的研究。2 本课题的主要研究内容西北大学硕士论文利用获得的单克隆抗体研制适合肝脏蛋白表达谱和功能研究的抗体芯片，探索提高标记效率和芯片敏感性的方法，研制成肝脏蛋白抗体芯片和配套试剂，并应用于肝脏蛋白质的定性、定量、定位和相互作用等研究。2 1 抗体芯片基本技术平台的建立由于蛋白质分子本身的特殊性决定了蛋白质芯片与d n a 芯片有许多区别：蛋白质之间的特异性作用是抗原抗体反应或受体配体的反应，不仅取决于序列的特异性，还取决于结构的专一性；蛋白质在载体表面不易折叠成有功能的结构而导致蛋白质的变性。所以，蛋白质在载体上的固定化是芯片制各的关键。目前蛋白质固定化方法存在蛋白质活性较低，玻璃表面修饰后产生较高的荧光背景等问题。用于制各蛋白质芯片的材料有很多，如聚苯乙烯、纤维膜、玻璃等。玻璃由于耐高温、能承受高强度洗涤、背景荧光信号低，而且没有膜那样的空隙，样品用量少而受到广泛应用。因此，在本研究中选择玻璃作为固相载体，通过环氧基修饰法对玻璃表面进行修饰。( 1 ) 蛋白质在玻片表面的点样均一性评价：先在玻片表面固定不同浓度蛋白质，然后与荧光标记的蛋白质反应。在一定范围内，同一浓度蛋白质的荧光信号扫描强度趋于一致。通过分别获取信号的荧光强度，测定修饰表面对蛋白质的固定均一性的影响。( 2 ) 玻片修饰表面固定蛋白质的线性试验，对玻片表面进行修饰是为了将抗体固定于玻片表面，更好地进行抗原与抗体的反应。蛋白质固定线性实验通过固定在玻片上的不同浓度的抗体与荧光标记的抗原的反应或是固定在玻片上的同一浓度的抗体与不同浓度的荧光标记抗原的反应来评价。所固定的抗体浓度越大，所获取的荧光信号越强，但超过一定界限后荧光信号不随蛋白质的浓度增加，甚至有下降的趋势。靶分子浓度亦然。通过这一试验可以更好的选择抗体的固定方法和固定浓度。( 3 ) 在建立抗体芯片技术平台的过程中，要对固定化方法、封闭缓冲液以及反应时间进行选择和优化。2 2 肝脏相关蛋白的研究分析制成含有适用于肝脏蛋白质组研究的点阵抗体数量不少于2 0 0 点的抗体芯2西北大学硕士论文片，并进行初步的肝脏蛋白表达谱和功能的研究。2 3 量子点标记方法的探索传统的荧光探针多采用有机染料，通常这些染料的激发光谱都较窄，难以同时激发多种组分。另一方面，它们的荧光特征谱很宽，分布不对称，这又给区分不同探针分子的荧光带来困难。此外，这些有机染料的光化学稳定性较差，光漂白与光解使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量不可能太多，光解产物还往往会对生物体产生杀伤作用。这些分子荧光特性的限制导致有机染料不适用于蛋白质等生物大分子的专一标识。而结合生物分子的量子点具有优良的光谱特征和光化学稳定性，可以大大拓宽利用荧光探测生物体系的应用范围。我们对其标记方法进行了初步探索，所需要的费用很低，易于推广应用，具有良好的应用前景。2 4 纳米金标记方法的探索生物芯片技术在检测上多以荧光为主，要用到共聚焦激光检测扫描仪，但此仪器价格昂贵，此技术难以推广。有关银沉积信号放大抗体芯片技术的研究处于起步阶段，其检测灵敏度和荧光法相当，得到的生物芯片能够长期保存。所需要的费用很低，易于推广应用，具有良好的应用前景。我们选择拥有自主知识产权的金磁微粒对纳米金标记方法进行了研究，初步进行了可目视化芯片的研发。3 本课题的主要技术路线 一国蕞黼t m 嘲t罢匿霉生稍l 觳妒删l图l芯片实验基本操作流程陲溺一孵育反匕后捡涮疆熊脯一一一一一一西北大学硕士论文第一部分文献回顾l 生物芯片技术及其研究状况生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子等进行准确、快速、高通量检测i 。生物芯片的本质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。芯片上集成了成千上密集排列的分子微阵列或分析元件，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片技术被认为是继2 0 世纪大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。按芯片固定的生物分子可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室。基因芯片，又称d n a 芯片，是在尼龙膜或玻片等固相支持物表面上，有规律地合成大量寡核苷酸片段或基因片段作为探针，或预先合成后由机械手点样于固相支持物表面构成微阵列，然后与标记的样品d n a 按碱基配对的原则进行杂交，通过放射自显影或激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描后，并配以计算机对杂交结果进行软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，以此反映样品靶分子的数量及基因表达强弱的信息，达到疾病诊断、药物筛选、基因功能研究等目的。蛋白芯片0 釉t c i nc b j p ) 是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在玻片上，形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片，带有特殊标记的蛋白质分子( 抗体或抗原)与之特异性结合，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。该技术所需蛋白质的量极少，反应相对较快，稳定性较好，灵敏度较高，在临床检测方面大有发展。芯片实验室o a b c h j p ) 是一种更加复杂的芯片技术，在微小的硅材料表面，制造出能对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、p c r 扩增、加样、检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤，微缩于一个芯片上。由于技术的复杂性，这种技术实现商业化和实用性尚待时日。4西北大学硕士论文目前制作生物芯片的方法主要有原位合成点阵法( p s h y z er ) 、合成后微量点样( c h e u n gv g ) 和电定位法。原位合成点阵法是由a f f y m e t r i 】【公司开发的基于微电子器件制作常用的光刻掩膜法在硅片上进行合成的技术。合成前需先对芯片表面进行处理，使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基共价连接，合成单体的一端用固相合成法活化，另一端与光敏保护基相连。在合成反应过程中，通过蔽光膜使特定的位点透光，其余位点不透光，只有受光的位点才能脱保护并与特定单体活化端相连，单体的光敏保护端露出，经过若干上述循环反应后，使每个位点按需要合成特定序列的探针【2 。合成后微量点样芯片是将合成好的探针通过机械手直接打印或喷印于芯片上。采用打印法可使探针密度高，但定量准确性及重现性不够，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印澍4 】定量准确，重现性好，使用寿命长，但斑点大，探针密度低。电定位法是利用静电吸附的原理将d n j 嗽速定位在硅基质、导电玻璃上，其优点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。生物芯片结果的分析和判定一般利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术进行扫描、图象分析、数据处理及检测结果判定【5 】，这一过程是生物芯片在应用时十分重要的一个环节。荧光标记是芯片信息采集中使用最多也是最成功的标志。杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过专门的荧光芯片扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转换成数据，即可以获得有关生物信息。如果用同位素3 2 p 、3 3 p 作标记，其信号的检测可以通过压x 光片或直接用磷屏成像系统来完成。为了使结果的检验更加简便和快速，生物芯片的分析系统中可采用基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站，对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析仅需数分钟的时间。国家科技部起草的医药生物技术“十五”及2 0 1 5 年规划所列的1 5 个关键技术项目中，就有8 个项目( 基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术) 要使用生物芯片，其中，生物芯片被单列为一个专门项目进行规划。2 0 0 2 年8 月国家科技部在8 6 3 高技术项目中正式启动了功能基因组和生物芯片重大专项。西北大学颈士论文2 蛋白质芯片技术及其研究状况随着人类基因组测序的顺利完成，使得功能基因组的研究成为可能。以蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越重要。蛋白质与抗体阵列芯片分析正是为了适应这一要求而发展起来的一种全新的技术，但这方面的研究才刚刚起步。特别是随着其他相关领域如机械制造、微电子加工技术及生物信息学方面所取得的进展，其研究和应用前景则使人们备受鼓舞【6 一卦。2 1 蛋白质芯片的概念和原理蛋白质芯片，也叫蛋白质微阵列口m t c i nm i 姗y ) ，是一种快捷、高效、并行、高通量的蛋白质分析技术【6 】。一个蛋白质芯片可以容纳一个蛋白质家族所有成员或一种蛋白质的所有变异体，甚至一种组织、器官或有机体的所有蛋白质。主要有两种方法同：一种是以阵列为基础，即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白或抗体点阵，可特异地捕获样品中的分子，用c c d ( c h a r g cc o u p l e dd c v i c c ) 照相技术与激光扫描系统获取阵列图象，最后利用专门的计算机软件包进行图象分析、结果定量和解释。具体方法有直接检测模式和间接检测模式，前者是将样品中蛋白质预先用荧光素或同位素标记，结合到芯片上的蛋白质就会发出特定的信号；而后者则采用的是标记第二抗体分子，其原理和操作过程类似于e u s a 方法。这种以阵列为基础的芯片检测技术操作简便、成本低廉、结果重复性较好，并能很快获得测试结果。另一种则是微流路芯片装置，也就是微型化的凝胶电泳板，它将毛细管电泳、质谱分析( m s ) 和荧光检测技术融为一体，在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪中进行检测，以确定样品中蛋白质的分子质量和种类。就临床应用前景而言，人们更关注第一种阵列芯片。蛋白质芯片是利用抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来构建，首先选择一种判断结果的根据。将每个点的荧光密度或灰度除去背景干扰后与相对界值进行比较，根据信号的有无、多少进行定性或定量分析。因此如何降低检测背景的荧光信号强度，增强检测信号的强度也是蛋白质芯片研究的一个关键问题。当然，在结果分析过程中需要对大量数据进行复杂处理，这些都需要通过特定的计算机软件来完成。2 2 蛋白质芯片的应用及其技术优势西北大学硕士论文 嘣口e n ，a n i i 啪 | l i g e l l i i b o d yp 吲f 卜d d d np t e f r 卜i 虹0 s o m ep 峨e i n _ d m 口e 几! y m e s u b 啦f d er e 删。卜叼a n da 删b o d v c 笛b o h v 雷a l e图2蛋臼芯片的应用蛋自芯片相对于基因芯片而言，发展相对较慢，但比较容易发展成l i 岛床有诊断价值的低密度芯片【8 。1 ) 用于疾病诊断和疗效判定，即生物学标志的检测蛋白质芯片能够同时检测生物样品中与某种疾病或环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量变化情况，即表型指纹( p h e n o m i c f i n g e r p r i n t ) 对于疾病的诊断或筛查来讲，表型指纹要比单一标志物准确可靠得多。表型指纹对监测疾病的进程和预后，判断治疗的效果也具有重要意义。蛋白质芯片的探针蛋白的特异性7西北大学硕士论文高、亲和力强，受其它杂质的影响较低，因此对生物样品的要求较低，简化了样品的前处理，甚至可以直接利用生物材料( 血样、尿样、细胞及组织等) 进行检测。由于蛋白质芯片的高通量性质，加快了生物标志物发现和确认的速度【1 4 1 。c i p h e r g b i o s y s t e m s 公司利用蛋白微阵列检测了来自健康人和前列腺癌患者的血清样品，在短短的3 天内发现了6 种潜在的前列腺癌的生物学标志。如果利用过去的方法也许要花费数月到数年的时间。2 ) 用于研究蛋白质相互作用近年来，研究蛋白质相互作用的主要方法是酵母双杂交系统技术。该技术是体内方法，易于操作实施并且应用范围广，但存在着许多局限性，如假阴性和假阳性酵母体内表达的外源蛋白质不能正确折叠、蛋白质翻译后修饰及表达过程的条件( 离子浓度、存在或缺失辅助因子、温度等) 难以控制等。蛋白质芯片技术由于是在体外条件下进行操作，直接检测目标蛋白质，不需要酵母作为中介，突破了酵母双杂交系统技术的局限性，必将成为研究蛋白质相互作用的理想工具。随着蛋白质组研究的不断展开，人们需要一种高通量的检测技术对细胞或组织所表达的众多蛋白质进行研究，蛋白质芯片正适合进行此项研究。m a c b e a 也g 等人【1 2 】研制出一种新型的蛋白质芯片，他们利用与基因芯片制作相似的点样技术，将纳米级的蛋白质样品点于醛基化的玻璃片表面，蛋白质中的氨基基团和玻璃片表面的醛基形成共价键从而实现蛋白质的固定。在点样的过程中为保持蛋白质的水溶性并防止其变性，在样品中加入4 0 的甘油。在一张2 5锄x 7 0 锄的玻璃片上可以固定1 0 0 0 0 个蛋白质样品，从而保证其实现高通量的检测功能。点样之后将玻璃片孵育3 h ，然后将玻片浸入含有牛血清白蛋白的缓冲液中封闭未反应的醛基。利用这种芯片进行蛋白质检测时，灵敏度可达1 5 0 p 咖l 。他们还证明用这种芯片可以进行蛋白质间相互作用、确定蛋白激酶底物、分析蛋白质与其它小分子物质相互作用的研究。3 ) 用于发现药物或毒物新靶点及其作用机制研究疾病的发生发展与某些蛋白质的变化有关，如果以这些蛋白质构筑芯片，对众多候选化学物进行筛选，直接筛选出与靶蛋白作用的化学物，将大大推进药物的开发。另外，蛋白质芯片有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。蛋白质芯片技术也允许对化学物( 药物或毒物) 作用机制细节不够清楚的情况西北大学硕士论文下，直接研究蛋白质谱，这可能将化学物的作用和疾病联系起来，并进一步建立和发展外源化学物与蛋白质表达谱的数据库，促进药理学和毒理学的研究。4 ) 免疫检测及酶活性测定目前许多临床检验及环境毒物检测均是基于抗原、抗体反应进行的，如果将多种检测集中在一块芯片上进行，就会极大的提高检测效率、降低检测成本。a i 蛐k o vp 等人【b 1 研制出一种用于免疫检测及酶活性测定的蛋白质芯片。他们在玻璃片表面制备了1 0 呶1 0 0 x 2 咖大小的聚丙烯酞胺凝胶垫，在凝胶内固定蛋白质分子，这种固定方法属于三维固定，其特点是固定容量大，比普通的二维固定容量大1 0 0 倍，因此灵敏度有很大的提高，在凝胶内进行的反应属于均一的液相反应，固定的分子相互干扰小。在进行免疫检测时，这种芯片可以重复使用1 0 次，但信号并没有明显的降低。e w a l t l 等入【9 】首次利用“主动式”芯片进行葡萄球菌肠毒素b 及霍乱毒素b 的检测，证明利用这种芯片进行蛋白质检测具有许多优点，如检测所需时间少、整个分析所需样品少( 1 0 1 1 1 ) ，不需要封闭等。5 ) 抗体筛选利用抗原与抗体可以进行特异性的结合反应，可以对噬菌体抗体库进行筛选。w 埘t r m 等人【1 0 】用带有抗体基因的高密细菌阵列进行重组抗体的筛选，一次可以对1 8 3 4 2 个不同的抗体克隆进行高通量的检测。尽管蛋白质芯片应用越来越广泛，但是发展蛋白质芯片技术是比较困难的。这主要是因为蛋白质很容易变性，其三维立体空间结构复杂而生物活性与空间结构又密切相关。定位固相于载体表面的蛋白质与抗体分子易于改变空间构象而失去原有的生物学活性成为影响蛋白质芯片应用的主要障碍，并且蛋白质的相互作用无规律可循，而是类似抗原抗体相互作用的特异结合性。尽管如此，蛋白芯片仍势不可挡的高速发展。据b i o 泌i g h t 生物技术公司统计【1 1 1 ，2 0 0 6 年全球蛋白芯片的销售额将达到5 亿美元。3 抗体芯片3 1 抗体芯片简介抗体芯片( a n t i b o d ym i d a m y ) ，是将能识别特异抗原的抗体制成微阵列，检测生物样品中抗原蛋白表达模式的方法。这种抗体微阵列可以在一次简单实验9西北大学硕士论文中同时检测样品中的数百甚至数千种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景f 1 5 】。3 2 抗原抗体反应抗原抗体反应( 姐l i g e n 一柚t 狮d y r ca c t i ) 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内( 协v i v o ) ，也可发生于体外( j l lv i 们) 。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用：体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质( 例如电解质、补体、固相载体等) 不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。3 2 1 抗原抗体反应的原理抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素f 如电解质、p h ，温度、补体) 的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。实际上这两个阶段难以严格区分，而且两阶段的反应所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，若反应开始时抗原抗体浓度较大且两者比较适合，则很快能形成可见反应。3 2 2 抗原抗体反应的特点( 一) 亲水胶体转化为疏水胶体抗体是球蛋白，大多数抗原亦为蛋白质，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，这些残基在溶液中带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云。如在p h 7 4 时，某蛋白质带负电荷，其周围出现极化的水分子和阳离子，这样就形成了水化层，再加上电荷的相斥，就保证了蛋白质不会自行聚合而产生沉淀。抗原抗体的结合使电荷减少或消失，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。此时，如再加入电解质，如- h c l ，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。( 二) 抗原抗体结合力1 0西北大学硕士论文有四种分子问引力参与并促进抗原抗体间的特异性结合【1 6 1( 1 ) 电荷引力( 库伦引力或静电引力) ：这是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。例如，一方在赖氨酸离解层带阳离子化的氨基残基( - n h 3 + ) ，另一方在天门冬氨酸电离后带有阴离子化的羧基( c 0 0 ) 时，即可产生静电引力，两者相互吸引，可促进结合。这种引力和两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便很微弱。( 2 ) 范德华c v a n d 盯w a a l s ) 引力：这是原子与原子、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引起的引力。由于抗原与抗体两个不同大分子外层轨道上电子之间相互作用，使得两者电子云中的偶极排布产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。这种引力的能量小于静电引力。( 3 ) 氢键结合力：氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团( 例如0 h ，n h 2 及c o o 哪的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范德华引力强，并更具有特异性，因为它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合。( 4 ) 疏水作用：抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸( 如亮氨酸、撷氨酸和苯丙氨酸1 在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体间