（分析化学专业论文）电化学法测定超氧化歧化酶活性的研究.pdf

首都师范大学硕士论文 文摘 中文摘要 在生命活动的 代谢过 程中 不 断 产生 各 种氧自 由 基， 超氧阴 离子自 由 基( o 2 ) 和y = 基自由基( h o -) 是具有代表性的重要的活性氧自由 基，它们与生物体的衰 老、 心脑血管病、风湿性关节炎、 癌症等许多病理都有重要的关系。生物体中 一些具有抗氧化活性的酶可以控制生物体中自由基的量，如超氧化歧化酶 ( s o d ) 和过氧化物酶 ( p o ) 。 众所周知一些非酶活性的物质也具有抗氧化活 性， 如维生素、中草药和黄酮类化合物等。 近年来， 从生物体中 清除过量的自 由 基，以及寻找一些能清除自由 基的抗氧化剂倍受重视，因此，s o d活性测 定和抗氧化剂清除自由基的能力的研究显得尤为重要。 本文建立了快速简便测 定s o d活性的四种方法， 论文包括以 下四部分: 1 、 介绍了活性氧自由 基与疾病、 超氧化歧化酶和超氧阴离子自由基之间 的关系。 综述了 近年来国内 外超氧化歧化酶活性测定及中草药清除活性氧自 由 基的发展和应用。 2 、 在n a 2 c 0 3 - n a h c o 3 ( p h 8 .9 ) 缓 冲 溶 液 电 s d s 对 把( 1 1 ) 与8 - 9 基 哇 琳 - 5 - 磺酸 ( 8 - o x s a ) 络合物峰电 流有明显的增敏作用，其反应机理与电极表面 生 成的。 犷 有关。由 于超 氧化歧化酶 ( s o d ) 可 催化 。 厂 发 生歧化反应， 使i - 8 - o x s a - s d s 体系的峰电 流降低， 本文依此建立了 测定s o d活性的方法，并 研究了几种常见的黄酮类化合物清除o z 豹作用。 3 , 盐酸轻胺在碱性水溶液中发生自 氧化反应， 可产生。 2 一 ，自 身被氧化为 亚硝酸根离子， 在酸性介质中s c n 一 催化亚硝酸根离子与二苯胺或二苯胺- 4 - 磺 酸反应生成具有电活性的亚硝基化合物， 在- 0 .6 7 v和一 0 . 6 0 v处有一波形很好的 二阶极谱峰。 在一定条件下， 极谱峰电流的大小与亚硝酸根离子的浓度呈线性 关系。 s o d可使。 少 发生歧化反应， 体系中 加入s o d ， 使生成的亚硝酸根离子 的量减小， 由此建立了通过检测亚硝酸根离子的生成量来测定超氧化歧化酶活 性的电 化学方法。 测定了 酶活力曲 线， 并 研究了 常见的 黄酮类化合物对o z 的 清除作用。 4、邻苯三酚在碱性条件下， 可以发生自 氧化反应， 产生 0 2 ， 其自 氧化 产物在一 0 .9 6 v和一 1 .4 4 v ( s c e ) 有两个还原波，用极谱法研究了 邻苯三酚在 首都师范大学硕士论文 中文摘要 t ri s - h c i( p h 8 .3 0 ) 缓 冲 溶液中自 氧 化 机 理 及自 氧 化反 应的 各 种 影 响因 素. s o d 可 催 化。 z 的 歧化反应， 使 邻苯三酚自 氧化反 应的 速率降 低， 通过测定 加入不 同量s o d时邻苯三酚自 氧化反应速率的变化来测定s o d活性。 建立了一种简 单、高灵敏度测定 s o d活性的电 化学方法，并研究了黄酮类化合物对邻苯三 酚自 氧化产生的o z 一 的 清除作用。 研究结果表明， 一 。 . 9 6 v处测定s o d活性的灵 敏度高于一 1 .4 4 v处。 总结了四种方法得到的实验结果， 并探讨了 黄酮类化合物 清除自由基的机理，即它们的分子结构与其清除自由 基能力之间的关系。 关键词:超氧化歧化酶，活性，超氧阴离子自由基，清除，黄酮 首都师范大学硕士论文 abs tract t h e r e i s n o d o u b t t h a t o x y g e n s p e c i e s o c c u r i n b i o l o g i c a l s y s t e m s . s u p e r o x i d e ani o n r a d i c a l ( o 2 ) a n d h y d ro x y l r a d i c a l ( h o - ) a r e t y p ic a l o n e s .t h e y a r e p r e s u m e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n a n u m b e r o f b i o l o g i c a l p h e n o m e n a s u c h a s a g i n g , o r o n a ry h e a rt d i s e a s e ,r h e u m a t o i d a r t h r i t is , c anc e r and o t h e r p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s . t h e s e f r e e r a d i c a l a r e c o n t r o l l e d i n b i o l o g i c a l s y s t e m s b y s o m e e n z y m e s p o s s e s s i n g ant i o x i d ant a c t i v i t i e s s u c h a s s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) a n d p e r o x i d a s e ( p o ) . i t i s w e l l k n o w n t h a t n o n - e n z y m a t i c s u b s t a n c e s s u c h a s v i t a m i n s , c h i n e s e t r a d i t io n a l and h e r b a l d r u g s ( c t h d ) and fl a v o n o id s , a l s o s c a v e n g e fr e e r a d i c a l . r e c e n t l y , t h e i m p o r t a n c e o f r e m o v i n g e x c e s s i v e a c t i v e o x y g e n s p e c ie s fr o m l i v i n g o r g ani s m s i s b e c o m i n g i n c r e a s i n g r e c o g n i z e 氏t o g e t h e r w i t h a g r o w i n g i n t e r e s t i n f i n d in g a n t i o x i d ant s t h a t c an s c a v e n g e t h e f r e e r a d ic a l s . h e n c e t h e d e t e r m i n a t i o n o f s o d a c t i v it y an d t h e s t u d y o f s c a v e n g i n g a c t i v i ty o f t h e an t i o x i d ant s a r e n e c e s s a ry . h e r e w e p r e s e n t f o u r s i m p l e and r a p i d m e t h o d s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s o d a c t i v i ty . t h i s t h e s i s r e s e a r c h i n c l u d e s f o u r p a rt s a n d t h e m a i n re s u lt s c o u l d b e e x p r e s s e d a s f o l l o w s : 1 . t h e r e l a t i o n b e t w e e n a c t i v e o x y g e n r a d i c a l and i l l n e s s , s u p e r o x i d e d i s m u t a s e and s u p e r o x id e a n i o n r a d i c a l w e r e i n t r o d u c e d . t h e re c e n t a d v anc e o f d e t e r m i n a t i o n o f s o d a c t i v it y a n d s c a v e n g i n g a c t i v e o x y g e n r a d i c a l 妙c t h d i n t h e w o r l d w e r e s u m m a r i z e d 2 . i n t h e b u f f e r s o l u t i o n o f n a 2 c 几- n a h c 0 3 ( p h 8 .9 ) , t h e c u r r e n t o f t h e p a l l a d i u m ( i i ) - 8 - h y d r o x y q u i n o l i n e - 5 - s u l f o n i c a c i d ( 8 - o x s a ) s y s t e m w i t h a n ani o n i c s u r f a c t a n t ， s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( s d s ) w a s i n c r e a s e d m a r k e d l y c o m p a r e d t o t h a t o b t a i n e d w i t h o u t s d s . t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m w a s r e l a t e d t o t h e f o r m a t i o n o f s u p e r o x i d e a n i o n s r a d i c a l ( o z ) p o l a r a g r a p h i c d e t e r m i n a t i o n o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e a c t i v i ty and t h e s t u d y o f s c a v e n g i n g o f s u p e r o x i d e a n i o n s b y fl a v o n o id s w a s d e s c r i b e d w h i c h i s b a s e d o n t h a t s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) c a t a l y z e d t h e d i s m u t a t i o m o f s u p e r o x i d e r a d i c a l a n d re d u c e d t h e p e a k c u r r e n t o f t h e 8 - o x s a - s d s s y s t e m. 3 . i n a n a l k a l i n e m e d i u m， h y d r o x y l a m m o n i u m c h l o r i d e r e a c t e d w i t h o x y g e n t o f o r m s u p e r o x i d e r a d i c a l a n d w a s o x i d e d t o n it r i t e i o n . a t l o w p h w i t h t h i o c y ana t e a s c a t a ly s t , n i t r i t e i o n r e a c t e d r a p i d ly a n d q u an t i t a t i v e ly w i t h d i 帅e n y l a m i n e o r d i p h e n y l a m i n e - 4 - s u l f o n i c a c i d t o 首都师范大学硕士论文 一些 b s t r a c t_ f o r m n it r a t e c o m p l e x w i t h e le c t r o c h e m i c a l a c t i v i ty , w h i c h g a v e s e n s it i v e s e c o n d - o r d e r d e r iv a t i v e r e d u c t io n w a v e w it h t h e p e a k p o t e n t ia ls o f 一 ，6 7 v a n d - 0 .6 0 v ( s c e ) . u n d e r t h e c e rt a i n c o n d i t i o n s t h e p e a k c u r r e n t w a s d i re c t l y p r o p o rt i o n a l t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f n i t r i t e i o n . s u p e r o x i d e d i s m u t a s e e n z y m e c a t a l y z e d t h e d i s m u t a t i o n o f s u p e r o x i d e r a d i c a l ( 氏) i n t o h 2 0 2 a n d o 2 , t h e s y s t e m w it h s o d i n h i b i t e d t h e f o r m a t io n o f n i t r i t e i o n . t h e e l e c t r o c h e m i c a l m e t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f s o d a c t i v i t y w h i c h w a s b a s e d o n t h e d e t e c t i o n o f t h e f o r m a t i o n o f n i t r i t e i o n d u r i n g a u t o x i d a t i o n o f h y d r o x y l a m m o n i u m c h l o r i d e w a s d e s c r i b e d . t h e c u rv e o f t h e s o d a c t i v i t y w a s d e t e c t e d . t h e m e t h o d h as b e e n a p p l i e d i n t o t h e r e s e a r c h o f s c a v e n g i n g a c t iv i ty o f s o m e fl a v o n o i d s . 4 . i n a w e a k ly a l k a l i n e m e d i u m， p y r o g a l l o l r e a c t e d w it h o x y g e n t o f o r m s u p e ro x i d e r a d i c a l a n d s e v e r a l i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s w h i c h g a v e t w o w a v e s a n d t h e p e a k p o t e n t i a l s w e r e 一 0 . 9 6 v a n d一 1 .4 4 v ( s c e ) . i n t r i s - h c i ( p h 8 . 3 0 ) b u ff e r s o l u t i o n , t h e m e c h a n i s m o f t h e a u t o x id a t i o n o f p y r o g a l l o l a n d t h e o p t i m u m e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e i n v e s t i g a t e d . s u p e r o x i d e d i s m u t a s e e n z y m e c a t a l y z e d t h e d i s m u t a t i o n r e a c t i o n o f s u p e r o x i d e r a d i c a l s o t h a t d e c re as e d t h e r a t i o o f p y r o g a l l o l a u t o x i d a t i o n , w h i c h c o u l d d e t e r m i n a t e s u p e r o s i d e d i s m u t a s e e n z y m e a c t i v i t y b y d e t e c t t h e c h a n g o f t h e r a t i o o f t h e p y r o g a l l o l a u t o x i d a t i o n i n w i t h d i ff e r e n t s o d . a s i m p l e a n d s e n s i t i v e e l e c t ro c h e m i c a l m e t h o d w as d e s c r i b e d . t h e m e t h o d h as b e e n a p p l i e d i n t o t h e r e s e a r c h o f s c a n v e n g i n g a c t i v i ty o f s o m e fl a v o n o id s . t h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e r m i n a t i o n o f s o d a c t i v i ty i n -0. 9 6 v r王f卫 oo w as b e tt e r t h a n i n - 1 .4 4 v .t h e r e s u lt s o f f o u r m e t h o d s w e r e s u mm a r i z e d . t h e m e c h a n i s m s c a v e n g i n g a c t i v e o x y g e n r a d i c a l s b y f l a v o n o id s ， t h e r e l a t i o n o f t h e fl a v o n o i d s a n d t h e s c a v e n g i n g a c t i v i t y w a s d i s c u s s e d . f e a t u r e s :s u p e r o x i d e d i s m u t asea c t i v ity , s u p e r o x id e a n i o nr a d i c a l , s c a v e n g i n g , fla v o n o i d i v 首都师范大学硕士论文 第一章 绪论 第一章绪论 1 . 活性氧自由 基与疾病 在生命活动过程中， 氧气参与新陈代谢、 线粒体的呼吸和氧化磷酸化， 产 生能量，它几乎是一切生命活动的基础物质之一。 但是， 氧气在参与生命活动 的同时也产生了 各种氧自 由 基，主要包括超氧阴离子自由 基o z 轻基自由 基 o h - 、脂自 由 基r o o - 、一 氧化氮n o 、 过氧亚硝基阴离子 ( o n 0 0 - ) 。正常人 体内存在少里氧自由基，不但对人体不构成威胁，而且在人体的氧化分解中， 适量自由基能促进细胞增殖， 刺激白 细胞和吞噬细胞杀灭细茵， 消除炎症， 分 解毒物。一旦氧自由 基过多， 就会引 起细胞损伤和衰老，导致疾病发生 0 .2 1 一方面， 由于自由基极强的氧化性， 会干扰人体内的正常物质代谢; 另一方面， 还会进攻其相近的生物大分子如核酸、 蛋白 质以 及膜的脂质结构， 引起细胞损 伤， 使其丧失正常的生理功能. 细胞功能的丧失， 又会降低其清除活性氧自 由 基的能力， 使体内的自由基越来越多， 形成恶性循环， 从而诱发各种疾病。 引 起人体内 氧自由 基增多的因素很多， 紫外线和宇宙射线照射、 环境污染、 体内 代谢紊乱、 创伤、 感染、 缺血和吸毒等， 都能引 起体内 氧自 由 基增多 3 1 。 因此， 适当水平的活性氧自由 基是机体维持良 好免疫能力的基础， 但当活性氧自 由 基 大量存在时对人体是有害的。 目 前的研究结果表明， 氧自由 基几乎和人类大部分常见的几种主要疾病都 有关系， 癌症是人类可怕的疾病， 严重威胁着人的生命健康， 而实验已经证实， 多 环芳烃、 黄曲霉素川 等的 致癌作用中 有活性氧自 由 基的参与，而且在癌变组 织中自 由 基的 含量一 般 要比 普通 人高 出3 - 5 倍 5 ,6 1 ， 在 肿瘤 形 成 初 期自 由 基 含 量会急速增加，当肿瘤长大到一定程度时，自由基的生成量达到一个最大值， 然后随着肿瘤的生长，自由基的含量不仅不再增加， 反而呈下降趋势， 这种现 象进一步表明自由 基在肿瘤的生长和发 展过程中 起着重要的作用 7 l 。 众所周 知， 心脏病是人类死亡率最高的一种疾病， z w e ie r 等人提出心肌缺血再灌注时 鱼 鲤 型 塑 醚 鱼 匕 一 一 一 一 一 一 一一 一 会 产生 氧自 由 基、 半 酿自 由 基 和含 氮自 由 基 8 ,9 。 溶 血 性贫血 可能 是由 于 血液 中f e ( i i ) 的f e n t o n 反应所产生的 经基自 由 基对红细胞的破坏所造成的p o l 。 眼的 晶 体在紫外光的 照射下， 其中的 水分发生紫外光解产生的活性氧自 由 基对蛋白 质成分的损伤则直接引 起白内障， 所以白内 障的形成和视网 膜的损伤是自由 基 和 脂 质 过 氧 化的 直 接结 果 u 。 各种 辐 射 病的 发生 与 人体内 的 水 分受 到 辐射 产生 的 经 基自 由 基密切相关 1 1 2 1 。 各种 肺病的 产生与 肺组织中的中 性 粒细胞 所产生的 活性氧自 由基存在直接的联系。 由于活性氧自由 基对细胞的损伤而造成的细胞 的凋亡则直接引起衰老。 最近己出现一些关于艾滋病和自由基的报道， 艾滋病 会感染免疫系统的各个部分， 最后导致进行性的行为缺陷，自由基与艾滋病之 间的关系主要表现在两个方面， 一方面艾滋病细胞产生氧自 由 基减少， 可能使 免疫能力降低， 艾滋病患者容易感染各种疾病: 另一方面，氧自由基可以刺激 艾 滋 病病毒复 制， 导致 病情加 重 13 帕 金森综合 症是一 种以 中 枢神经系 统多巴 胺能神经元功能障碍为病因的神经功能紊乱症， 近几年的研究表明自由基与这 种疾病的关系也很密切回。 近年来的 研究还表明，自 由 基能与正常细胞膜上的 不饱和脂肪酸发生过氧化反应， 溶溃细胞膜， 破坏线粒体，断绝细胞能源， 毁 坏溶酶体， 使细胞自 溶。 另外， 自 由 基对人体的非细胞结构也有极大破坏作用。 它可使胶原肤链断裂， 使透明质酸解聚。 这些血管壁上的连接粘合物质一经破 坏， 完整密封的血管就会变得千疮百孔而渗液漏血， 从而导致水肿， 血肿或紫 瘫等 病症。自 由 基还是造成 基因 突变， 致畸的重 要因素 l 5 。 由 此可见， 从人类 死亡率最高的心脑血管疾病， 到人类最可怕的癌症， 以及近年来对人类造成巨 大威胁的爱滋病，无一不和氧自由 基有着密切的关系。 有关自由基的研究己 经涉及到像癌症治疗、 心血管病防治、 预防衰老和器 官移植等临床医学的重大疑难问题。 活性氧自由基对生物体的损伤作用虽然己 经逐步获得公认，在2 。 世纪受到了 极大关注 1 6 ， 然而，由于生物体内 活性氧 自由基的寿命非常短， 导致通常情况下稳态浓度极低， 而短寿命和低浓度意味 着自 由基的测定异常困难， 特别是在生物活体内 ( in v i v o ) 与直接原位( i n s i t u ) 的 检测目 前尚未有突破。 另外生物体内 还存在着预防自由 基损伤的内在抗氧化防 护体系， 因而至今为止人们尚无法直接动态观测到某些器官中活性自由基的产 首都师范大学硕士论文 第一章 绪论 生， 对它们的生成机制， 生理作用及其动态损伤生物机体的过程都缺乏足够的 认识和充分的实验证据，以至在临床上直接影响和限制对许多疾病的治疗效 果。 因此， 针对生物活体内自由基开创新的分析与检测技术是分析化学学科发 展中具有挑战性的前沿课题之一。 2 . 超氧化歧化酶与超氧阴离子自由基 超氧 化歧化酶 ( s u p e ro x i d e d i s m u t a s e ) 简称s o d . 1 9 3 8 年k e i l i n 从牛 血 中分离出一种含c u 的血铜蛋白，1 9 5 3 年又从小牛肝、 鲸肝分离出 肝铜蛋白。 1 9 6 8 年f ri d o v i c h 发 现。 z 一 使 细胞色素c的 还原 受 到一种蛋白 因子的 抑 制 1 7 1 1 9 6 9 年m c c w r d 及f ri d o v i c h 根据血 铜蛋白 、 肝 铜蛋白、 脑铜蛋白 皆 有。 犷 歧 化活性，故将此酶命名为超氧化歧化酶。 至今为止，人们已从细菌、原生动物、藻类、霉茵、植物、昆虫、鸟、鱼 类和 哺乳动物等各种生 物体内 分离得到了s o d . s o d属酸 性蛋白 酶， 对p h . 热和蛋白 酶水解等反应比 一般酶稳定。 按照结合的金属离子种类不同， 将s o d 分为3 种类型:第一种类型含c u 和z n ， 呈蓝绿色， 定名为c u z n - s o d ， 其主 要存在于真核细胞的细胞浆内; 第二种类型含m n ， 呈粉红色， 故称m n - s o d , 目 前已从真核细胞的线粒休和原核细胞浆分离得到; 第三种类型含f e ， 呈黄色， 故 称f e - s o d ， 只存在于原核细胞内。 超氧化歧化酶是大分子生物酶， 由于它有特殊的抗氧化功能， 又称抗氧化 酶。 s o d广泛存在于自 然界的生物体内。 该酶能 够催化生物体内o z 一 发生歧化 反应:0 2 - + o 2 - +2 h -h 2 0 2 + 0 2 ， 所以 s o d具有清除o z 一 的能力，从 而在 抵抗氧的毒性、 抗辐射损伤以 及预防衰老等方面 起着重要的作用 1 8 ,1 9 1 由 于s o d具有预防衰老的作用，s o d化妆品在国际上十分流行。许多学 者通过对不同年龄的试验动物进行实验研究了 皮肤防皱与s o d化妆品的作用 原理2 0 1 。 研究表明随着年龄的增长， 机体皮肤组织中s o d含量及其活 性明 显 下降， 从而使体内超氧自由基致老因子不断产生和积累。自由基的 增加对 皮肤组织中的胶原纤维、网状纤维、弹力纤维的组织细胞以 及血管、皮脂腺、 首都师范大学硕士论文 第一章 绪论 汗腺等有着严重影响， 特别对皮肤组织中的生物大分子、蛋白质、 核酸、透明 质酸、 糖类、 脂肪等进行强氧化性损伤， 使皮肤组织的生理结构遭受破坏， 新 陈代谢发生障碍，营养吸收受阻，最终导致皮肤的衰老。s o d化妆品的使用， 就是为了试图补充皮肤中的 s o d , s o d能随化妆附着在皮肤上并逐渐向皮下 组织渗透而被皮肤吸收，在皮肤组织中补充 s o d和清除自由基，从而达到护 肤及延缓衰老的目 的。 氧气在生物体内生成氧自 由 基时， 产生的 第一个自由 基便是。 于 ， 它不仅 自 身具有毒性， 而且可以经过一系列反应生成其它氧自由基， 进一步对生物产 生损害作用。因 此对0 2 的 研究在生物的 损伤和衰老方面有着重要的意义。由 于s o d是0 2 一种重要的 清除剂， 是生物体防御氧化损伤的重要酶。 在医疗上 具有广泛的应用前景。因此，s o d活性的测定也倍受关注。 3 . 超氧化歧化酶活性的测定方法 由 于 0 2 是超氧化歧化酶作用的底物， 测定 s o d活性时经常要用到检测 0 2 ， 测定。 2 一 与 测定s o d的活性密切相关。 因此， 用于测定s o d活性的方法 都可以 用来测定0 2 ， 所以 本文主要论述一下s o d活性测定的 方法。 常用的 测 定s o d活性的方法有分光光度法、荧光法、 化学发光法、电化学方法及电子 自 旋共振 ( e s r ) 等。 3 . 1 分光光度法 经典的分光光度法中0 2 一 是靠脉冲辐射分解法产生，并应用快速混合停留 技术与灵敏的检测光吸收装置。采用脉冲辐射分解法产生 0 2 一 时，使用产生 1 -3 0 兆电子伏能量电子脉冲的加速器， 将测定液中的水辐射分解，使分解产 物可与o : 反应产生。 2 一 ， 0 2 一 对2 5 0 n m光 波有很强的吸收。 在一定实验条件下， 根据s o d量与2 5 0 n m光吸收变化量之间的定量关系，可以测定s o d的活性， 但由于。 2 气 在水溶液中存在的时间很短，因 此要求在极短的时间内灵敏地检测 出2 5 0 n m光吸收变化量。 首都师范大学硕士论文 第一章 绪论 借助于一些物质自 氧化时也可以 产生02 ， 采用化学法代替脉冲辐射分解 法产生o z ， 从而简 化实 验条 件. 最 经典的 是邻苯三酚自 氧化法2 1 -2 3 1 。 在 碱性 条件下，邻苯三酚会发生自 氧化生成红桔酚，同时生成 0 2 。邻苯三酚自 氧化 的 机理十分复杂， 其在自 氧化过程中形成一系列在4 0 0- 4 2 5 n r n 处有光吸收的 中间 产物。 在经典的邻苯三酚自 氧化法测定s o d活力的方法中， 选择4 2 0 n m 波长的吸光度， 但选用依据未作说明。 通过测定加入不同 浓度 s o d时 邻苯三 酚自 氧化速率的变化来测定s o d活性， 此法称为邻苯三酚自 氧化法( 4 2 0 0 m ) a 由于反应产物在 4 2 0 n m处的光吸收很低，测定结果的准确性受到很大影响。 在 这 之 后 ， 人 们 逐 渐 建 立了 改 进 的 邻 苯 三 酚自 氧 化 法 ( 3 2 5 n m法 ) 2 4 ,2 5 1 ， 加 入 适 量的金属鳌合剂，取 3 2 5 ru n为测试波长，可进一步提高测试灵敏度。 近来有 报 道 从 邻苯 三酚自 氧化法 衍 化而 来的 一 种新 方 法 一 一终止 剂 法 12 6 , 2 7 1 。 其 测定 步骤与经典的及改良 的邻苯三酚自 氧化法基本相同， 整个反应是在2 5 水浴中 进行， 邻苯三酚自 氧化准确反应3 分钟以 后， 以 微量注射器迅速加入5 0 a l 5 % 维生素c或二硫苏糖醇 ( d t t )溶液，立即混匀， 室温下放置5 m i n以 终止自 氧化反 应， 然后再 测定4 2 0 n m或3 2 5 m n 处的 吸光 度， 终止剂 维生素c ( v c ) 和 二 硫苏 糖醇 ( d t t ) 对 s o d酶活力的 测定无影响。 此 测定方法称之为邻苯三酚 nc 终止法和邻苯三酚/ d t t终止法。 终止法保留了 邻苯三酚自 氧化法的一般特 点， 并且比 原法更加简便。 张宏等人2 s 对四种邻苯三酚自 氧化法测定超氧化歧 化酶活性方法作了比较， 并计算了不同 测定方法之间的转换系数， 通过比 较发 现3 2 5 n m法与v c 法灵敏度较高， 可用于s o d活力 较低的 样品。 赵云 斌等 2 9 , 3 0 1 为改 善目 前 s o d活性测定结果 混乱的 现状， 提高测定结果的可比 性， 对邻 苯三酚自 氧化法测定超氧化歧化酶活性的方法进行了研究， 就测量波长、 底物 浓度、 加样量等因素对测定结果的影响进行了 探讨，同时讨论了抑制率、 指示 反应速率差与s o d浓度之间的关系， 确定了s o d活性定值的方法。 杨林莎3 1 1 研究了从黄瓜、 菠菜、 芹菜和西葫芦等蔬菜中提取s o d ， 并用邻苯三酚自 氧化 法测定其活性。 蔺新英等3 2 1 用邻苯三酚法测定了 大蒜及蒜芽、 蒜苗、 蒜苔、 韭 菜、 大葱、 洋葱等七种青葱属食物中s o d恬性， 探讨了影响大蒜s o d活性的 因素。 虽然邻苯三酚自 氧化法已 研究的比 较成熟， 但几种邻苯三酚法共同的缺 首都师范大学硕士论文 第一章 绪论 点 是 受p h 的 影响 很 大， 反 应 体 系的p h 相 差 t 0 . 1 单 位， 测活 误 差 达2 0 %左 右 3 3 1 。 方林求13 4 1等研究了以 间 苯三酚自 氧 化代替 邻苯三 酚自 氧 化测定了s o d活 性，有较好的重复性， 得到了 较为满意的结果， 但灵敏度不如邻苯三酚体系， 所需试剂量比较大。 此 外， 肾 上 腺 素自 氧 化 法 13 5 , 3 6 1 、 没 食 子 酸自 氧 化3 7 1 . 6 - 轻多巴 胺 法自 氧 化 3 8 1 和经胺自 氧化都可以 产生o z ， 可用于测定s o d活性。 在酸性溶液中肾上腺 素 很稳定， 但当p h 超过8 . 5 以 后 其自 氧化 速度随p h 增加而 增强， 其自 氧化 产 物为肾上腺素红，在4 8 0 n m处有光吸收峰。如果改用3 1 0 n m波长可使灵敏度 提高4 倍，但由于肾上腺素自 氧化过程o z 产生的 机制复杂， 在实际应用中 必 须 考虑 干 扰因 素。 在 此 基 础上， s u m 3 9 1 改 进了 肾 上 腺 素自 氧 化 法 测 定s o d活 性，改用3 1 0 n m波长使灵敏度提高了6 -1 0 倍，而且比4 8 0 n m波长测定的 准 确 度高， 用光 度法测定了s o d活性， 并 讨论了 时间、 p h与s o d对肾 上腺 素 自 氧化反应的 抑制率之间 的 关系. 没 食子酸自 氧化法的 测定 结果 受p h与没 食 子 酸浓度的 影响 较显著， 所以 测定时 要严 格控制p h且 要准确配 制规定 浓度的 没食子酸溶液。 此方法的另一个缺点是样品中的低分子量氧化还原物质也会直 接与 。 2 一 反应， 从而影响测定结果的 准确性。 6 - 轻多巴 胺法自 氧化法的优点是 可在生理p h值 ( p h 7 .4 ) 环境下测定s o d活性， 较为真实 地反映生物体内 的 反应情况， 这是其他一些测定方法所不具备的。本法的缺点在于， 相对于肾上 腺素或邻苯三酚而言， 6 - 轻多巴 胺氧化的线性时限区间非常有限.改 变p h值 可以改善这一缺陷。 而且此方法的测定结果易受杂质干扰， 轻自由基也和0 2 - - 样可使 6 - 轻多巴 胺自 氧化。理论上此方法可以测定样品中的 s o d ， 但由于上 述缺点， 在实验室中不大采用此法。 以上光度法的基本原理都是基于 o z 一 或产生 。 2 一 的物质本身的性质测定 o z 一 的歧化量，可以直接测定s o d活性。光度法中常用的测定s o d活性的另 一 种方法是利用o z 一 的 还原或氧化性质， 这一类方法的 共同 特点是既要有o z 一 的 产生体系， 又需要被o z 一 还原或氧化的可供检测的体系。 一般常用黄嗓吟一 黄嗦 吟氧化酶发生单电子反应产生o z 。 再 选择合适的 检测体系测定s o d活性。 建 立的方法主要有细胞色素 c还原法1 4 0 1 、黄嗦吟氧化酶一 氯化硝基四哇氮蓝 ( n b t ) 还原 法 “ 】 、 亚 硝 酸a 形 成法 4 2 1等。 黄 嚓 吟 一 黄 嗓吟 氧 化 酶 体 系 产生 的 首都师范大学硕士论文 第一章 绪论 0 2 ， 使一定量的氧化型细胞色素c还原为还原型细胞色素c ，其还原反应速 度应是稳定的。还原型细胞色素c在5 5 0 n m有光吸收峰，根据加入不同s o d 时其还原速度的变化来测定s o d活性。 此法是间接法中经典的方法，如用此 法测定生物样品中s o d活性，可以将细胞或组织的粗提取液透析，同时加入 5 x 1 0 - 5 m o l几氰化物可消除杂质对测定结果的影响。在碱性条件下，二甲 亚枫 可以 产生0 2 ， 可作为s o d活性测定方法中的 产生0 2 一 的体系，与检测。 犷 的 细 胞 色素c 还原 等反 应 结 合， 建 立了 碱性 二甲 亚 矾法 测定s o d活 性 4 3 1 。 降 低 温度可以 增加测定的灵敏度， 此方法的 优点是生 物样品中常见的氧化酶对测定 结果的干扰较小，可以应用于 s o d酶活力的自 动化分析。亚硝酸盐形成法是 基于 黄嗓吟 一 黄嗦吟 氧化酶 体系 产生的份能 使 y s 胺氧化为亚 硝酸盐， 亚硝酸盐 与氨基苯磺酸、 盐酸蔡乙二胺发生重氮反应生成红色化合物。因而可以按照测 定n 0 2 . 的 方法测定s o d活性， 根据抑制率的高 低， 计算出样品中s o d的活 力。反应生成的红色化合物较为稳定， 测定波长为5 5 0 n m。亚硝酸盐形成法的 灵敏度与化学发光法类似， 是所有比 色法中最高的。 而且用此方法测定红细胞 内的s o d , 结果不受血浆内正常量的 抗坏血酸、 尿酸、 还原型谷光甘肤等的 干 扰。 但o h 也可与n h 2 o h起反应，所以 此方法不能区别o h和。 2 对n h 2 o h 作用。 但在s o d存在下， 可显示s o d对。 犷 引起n h 2 0 h氧化反应的抑制， 所以 此方法在原理上依然是可行的。氮化硝基四哇氮蓝 ( n b t )可被 。 犷 还原 为显色物质， 在 5 3 0 n m -5 8 0 n m呈最大光吸收。当 采用黄嗓吟一 黄嗦吟氧化酶 体系产生0 2 ， 建立的方法就是黄嗦吟氧化酶- n b t 还原法， 温度对其测定有影 响， 温度越高， 反应速率加大， 但达到对n b t 还原抑制5 0 % 所需的s o d量越 多;温度过低，测定的灵敏度下降。此方法测定 s o d活性的灵敏度较细胞色 素c还原法高， 将黄o x 吟浓度降低可进一步提高灵敏度。 当以光照核黄素的方 法作为。 2 一 的 产生体系， 建立的 方法为 核 黄素 一 n b t 还原 法4 4 1 ，由 于 光照强 度、 n b t 及核黄素用量等因素难以控制， 所以此方法测定结果的重现性较差。 也可 以 用轻胺自 氧化作为0 2 的产生体系， 在 e d t a存在下，与n b t光度法结合 测定s o d的活性4 5 1 g a e t a (4 6 1 等用光度法测定了 小孩血液中的s o d和谷肮甘酞过氧化酶活性， 主要是通过测定红细胞中的 s o d和全血中的谷肤甘酞过氧化酶活性，从而确 壑# 型* 型i$ 7 c 一 一 一 一 一 一 一 一 一 定了 健 康儿 童的 血 液中 酶活 性的 参 考 值。 杜 鸣 14 7 1等 合 成的 双 对 经基 苯甲 醛 硫 代 碳nt(r , ( b h b t z ) 和双香兰素 硫代碳lft r . ( b m h b t z ) 能与 。 2 一 发生显 色反 应， 生 成蓝色的化合物， 由此建立了流动注射一 光度法测定。 2 一 的方法， 合成的试剂稳 定，与0 2 一 反应灵敏，产生的 蓝色物质在测定血液样品时干扰少、 空白 小。 结 合流 动注射法使测定更为 简便， 便于 成 批样品的 测定。 唐波等4 s 研究了 催 化光 度法测定 。 犷 和 s o d活性，在辣根过氧化酶催化下，以 。 少 作为氧化剂， n , n 二甲基苯胺与4 - 氨基安替比林反应， 在此反应的基础上， 可于5 5 4 n m处 光度法测定光照维生素b 2 产生的0 2 。 此方法已 成功地用于测定人血液和老鼠 血液中的 s o d活性.他们还合成了 s h i ff碱 2 - 轻基- 1 - 蔡醛缩一氨基唾哇 ( h n a t s ) 及 其 铜 配 合 物 4 9 1 ， 发 现 配 合 物c u ( i i ) - ( i -in a t s ) 2 具 有 显 著 的 过 氧 化 物模拟酶活性， 可催化h 2 0 2 氧化4 - 氨基安替比 林与2 , 4 一 二抓苯酚偶联反应. 研 究了 p 一 环糊精对模拟酶催化活性的影响，建立了 新的测定。 2 的 分光光度法， 并用此方法测定了人体血液中的s o d活性。 选择性和灵敏度高。 在此基础上， 他们又建立了 新的 s d s - s c h i ff碱铜( i i ) 配合物模拟酶催化光度法测定 份和 s o d活性的方法5 0 1 o y a n n g u i 用 七 种光 度法 测定了s o d 活 性， 列 举了 各 种 方 法 的 条 件、 , s o , 及其受牛血清白蛋白的影响情况，发现亚硝酸盐形成法最适合于制作 s o d活 性测定的工具箱，此方法经改进后灵敏度更高，且降