（分析化学专业论文）共振光散射技术在核酸蛋白质及稀土离子分析中的应用.pdf

摘要 核酸是生命现象的物质基础，它是遗传信息的载体，是生物物种延续、物种 进化的决定因素。蛋白质分析是生命科学中的重要课题。蛋白质在人体代谢中 扮演极为重要的角色，人类绝大多数疾病都是由蛋自质异常引起的。蛋白质的 定量分析在生命科学、生化药物、食品分析及临床检验中都有着重要作用。深 入研究小分子物质与核酸和蛋白的作用，建立核酸，蛋白快速简便的分析方 法，对分子水平上阐明生命的奥秘、新型药物的开发、攻克许多疑难病症以及 促进信息科学的发展都具有重要的意义，是当前生物分析化学研究的前沿和热 点。 稀土元素由于具有特殊的4 f 电予结构，因而具有特殊的电学、光学、磁学 和化学性质，某些稀土化合物还具有良好的生物活性，这使稀土元素在地质学 发光材料，生命科学等众多领域具有重要用途，而且稀土元素的化学性质都非 常接近，因此寻找灵敏度高的测定稀土元素的方法将对稀土元索的研究应用有 很大意义。稀土元素同某些有机化合物配体通常表现出许多光学特性，目前已 受到分析化学家和其他相关科学研究者的注意，并且已将其作为光学探针用于 分子生物学，材料和环境科学等。因此寻找新型的稀土元素光学探针对于提高 生物分子测定的灵敏度和选择性，对于研究其与生物分子的作用机理具有重大 意义。 本文主要利用共振光散射技术，研究了稀土元素一喹诺酮药物配合物、 s c h i f f 碱与核酸的相互作用：偶氮类染料一表面活性剂与蛋白质的相互作用： 稀土元素与b 一二酮类有机配体的相互作用。发现了测定核酸，蛋白，稀土元 素d y 的新的高灵敏的探针，建立了核酸，蛋白以及稀土元素镝的快速、准确、 简便、灵敏的分析方法。同时应用吸收光谱技术，表面张力测定技术，激光光 散射技术，核磁共振等手段研究了蛋白质，刚果红与t x 一1 0 0 三者的相互作用方 式本论文共分为四部分： 论文的第一部分主要综述了共振光散射技术基本原理及应用于与核酸，蛋 白，稀土离予的测定的研究进展和发展趋势。 论文的第二部分介绍了金属离子有机配合物用于核酸共振光探针的研究。 首先以e u 4 4 一嚼喹酸一核酸共振光散射体系的分析应用建立了以e u ”一o a ( 铕一 嚼喹酸) 为探针测定核酸的新方法。在t r i s h c l 缓冲溶液( p h = 9 7 5 ) 中，核 酸的加入使乳“一o a 体系的共振光散射( r l s ) 增强，最大散射峰位于3 6 8 n m ， 此r l s 信号与核酸的浓度在定范围内成正比。在最佳实验条件下，f s d n a 、 c t d n a 和y r n a 的线性范围分别为1 0 1 0 一1 0 1 0 一，8 0 1 0 1 叱1 o x1 0 “， 1 0 1 0 叫| 1 0 1 0 一g m l ，检出限( s n = 3 ) 分别为0 ，0 2 0 ， 0 0 1 1 ，0 o l o n g m l 。该方法已用于实际样品的测定，其结果令人满意。同时初 步探讨了体系共振光散射增强的机理。 其次，对s c h i f f 碱一水杨醛缩乙醇胺合锌一核酸共振光散射体系进行了研 究。讨论了水杨醛缩乙醇胺合锌一核酸体系的共振光增强效应。在p t l = 8 5 的条 件下，水杨醛缩乙醇胺合锌的加入可使体系的共振光强度大大增强。在最佳实 验条件下，共振光强度与核酸的浓度成正比，线性范围分别为3 0 1 0 8 1 0 x l o 一，1 0 1 0 - 8 _ 1 o 1 0 一，1 0 x1 0 - 8 1 0 1 0 。5g m l ，检钡4 艰( s n = 3 ) 分别为 1 3 ，1 0 ，1 o n g m l 。该方法已用于合成样品的测定，其结果令人满意。同时 初步探讨了体系共振光散射增强的机理。 论文的第三部分完成t n 用共振光散射技术，在表面活性剂t x 一1 0 0 存在 下，将染料刚果红用于蛋白质的测定，并研究了三者的相互作用。在p h = 2 7 5 时蛋白质与非离子表面活性剂t x - 1 0 0 可协同增强刚果红的共振光散射强度， r l s 的增强强度与蛋白质的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。在最佳实验 条件下，b s a 和h s a 的线性范围分别为5 0 1 0 一一1 0 x1 0 “g m l 和1 o 1 0 1 6 0 1 0 一g m l ，检出限( s n = 3 ) 分别为1 4 x1 0 1 9 m l 和2 8 1 0 。o g m l 。该 方法已用于合成样品的测定，其结果令人满意。同时采用共振光散射技术，表 面张力测定法。电视显微电泳法，激光散射，核磁共振法探讨了蛋白质与刚果 红- - t x - 1 0 0 体系相互作用及共振光散射增强的机理。 论文的第四部分初步研究了稀土元素与b 一二酮类化合物1 ，6 一双( 1 一苯 基一3 一甲基一5 一吡唑酮一4 一基) 己二酮( b p m p h d ) 的共振光散射特性，并建 立了用b p m p h d 为共振光散射探针测定稀土元素镝的新方法。在t r i s h e l 缓冲 溶液( p h = 5 5 ) 中，d y 3 + 的加入使b p m p h d 体系的共振光散射( r l s ) 增强，最大 散射峰位于3 5 0 n m ，此r l s 信号与d y ”浓度在一定范围内成正比。在最佳实验条 件下，d y ”的线性范围为1 o 1 0 “o 1 0 x 1 0 一m o l 1 ，检出限( s n = 3 ) 为5 6 1 0 1 2m o l 1 。该方法已用于合成样品的测定，其结果令人满意。 本论文的主要特点是： 堡耋；型：丛塑些盔盔堂亟主堂包盗塞地塞 ( 1 ) 在已报道的核酸共振光散射体系中，其探针大多为阳离子染料，而应 用金属离子与有机配体形成的配合物作共振光散射探针的报道很少。本论文分 别发现了两种金属离子有机配合物探针。首先以e u 3 + _ o a ( 铕一噫喹酸) 为探 针，应用于核酸的测定中，此方法灵敏度很高，检出限可达到1 0 。1 9 m 1 ，是目 前测定核酸的最灵敏的方法之一。另外，本文首次提出了用s c h i f f 碱一水杨醛 缩乙醇胺合锌一核酸共振光散射体系测定核酸的灵敏方法。 ( 2 ) 运用了多种手段探讨酸性条件下t x 一1 0 0 ，刚果红( 偶氮类染料) 和 蛋白质之间的相互作用，提出了他们的作用方式，说明蛋白质和表面活性剂 t x 一1 0 0 可协同增强网0 果红染料的共振光散射强度，并将此现象应用于蛋白质的 测定中，具有较高的灵敏度。 ( 3 ) 首次提出了以共振光散射技术研究b 一二酮类化合物与稀土离子d y 的相互作用，并将该方法用于稀土离子的检测，检出限低，灵敏度高。 关键词：共振光散射，核酸，蛋白质，曝喹酸，铕离子，刚果红，t x 1 0 0 ，s c h i f f 碱，稀土d y ，b 一二酮 a b s t r a c t n u c l e i ca c i di st h em a t e r i a lb a s eo f1i f e i ti st h ec a r r i e ro f g e n e t i c i n f o r m a t i o n ， a n di sa l s ot h ed e t e r m i n a t i v ef a c t o rf o r s p e c i e s c o n t i n u a t i o na n de v o l u t i o n t h ea n a l y s i so fp r o t e i ni st h e i m p o r t a n tt h e s i s o f1 i f es c i e n c e ，s i n c ep r o t e i np l a yas o i m p o r t a n t r o l ei nt h em e t a b o li s mo fh u m a n b o d y ， a n d t h em o s td i s e a s e o f h u m a n b e i n g i sc a u s e db yt h ea b n o r m a lo fp r o t e i n s ot h eq u a n t i t a t i v e a s s a yo fp r o t e i n i s p i v o t a l t ol i f es c i e n c e ，b i o c h e m i c a lm e d i c a m e n t a n a l y s i s o ff o o da n dc i i n i ca n a l y s i s i ti s v e r yi m p o r t a n t f o r r e s e a r c h e r st oe x p l o r et h es e c r e to f lif e ，t od e v e l o pn e wf u n c t i o n a l m e d i c i n ef o r c u r i n gm a n y d i f f i c u l td i s e a s e sa n d p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n to f i n f o r m a t i o ns c i e n c e w h a tw es h o u l dd oi st of u r t h e r p e n e t r a t e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dn u c l e i ca c i d s a n dp r o t e i n ，a n dt od e v e l o pr a p i da n dc o n v e n i e n ta s s a y sf o rn u c l e i c a c i d sa n d p r o t e i n t h e r e f o r e ，i t i sah o t p o i n t i n b i o a n a l y t i c a l c h e m ic a lr e s e a r c h t h er a r ee a r t he l e m e n t sh a v es p e c i a l4 fe l e c t r o ns t r u c t u r e ，s o t h e yp o s s e s sv e r ys p e c i a l p r o p e r t i e s o f e l e c t r i c i t y ，p h o t i c s ， m a g n e t i c s a n dc h e m i s t r y ，a n ds o m eo ft h e m a l s o h a v es o m eb i o l o g i c a l p r o p e r t y r a r e e a r t he l e m e n t sp l a yas i g n i f i c a n tr o l ei nt h ef i e l d s o fg e o l o g y ，l u m i n i f e r o u sm a t e r i a l sa n dl i f es c i e n c e s c o n s e q u e n t l y ， s e a r c hf o rt h em o r es e n s i t i v ep r o b e so fq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f r a r ee a r t he l e m e n t si sv e r yi m p o r t a n t r a r ee a r t he l e m e n t sc o m p l e x e s w i t hs o m eo r g a n i c1 i g a n d so f t e ns h o ws t r o n go p t i c a lp r o p e r t i e s i n r e c e n t y e a r s ，t h e r e i sc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t i nt h e s t u d y o nt h e s e c o m p l e x e s f o rt h e i r p o t e n t i a la p p l i c a t i o n f o r t h ed e t e r m i n a t i o no f t h er a r ee a r t he l e m e n t s ， a n d e m p l o y t h e c o m p l e x e s i n t ot h e d e t e r m i n a t i o n o f b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e sa n d s oo n i ti s v e r y i m p o r t a n t t of i n dn e wc o l u m i n e s c e n c es y s t e mi n o r d e rt oi m p r o v et h e s e n s i t i v i t ya n dt h es e l e e t i v i t yo ft h ed e t e r m i n a t i o no fr a r ee a r t h e le m e n t sa n ds t u d yt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo ft h eo p t i c a l s y s t e m b a s e do nt h er e s e a r c ho f a n a l y t i c a lc h e m i s t r y a n dm o l e c u l a r b i o l o g y ，t h i s t h e s i s p e n e t r a t e s t h en e w p r o b e s o fn u c l e i ca c i d p r o t e jna n dr a r ee a r t he l e m e n t d y s p r i u m ，s t u d i e s t h e i ri n t e r a c t i o n a n dl u m i n e s c e n c e m e c h a n i s m p a r t i c u l a r l y ，t h i s t h e s i ss t u d i e dt h e m e c h a n i s mo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i n t x 一1 0 0 一c rb ya s i n g t h er e s e a r c h t e c h n i q u e s o fr e s o n a n c e 1 i g h ts c a t t e r i n g ，a b s o r p t i o n s p e c t r u m ，e l e c t r o p h o r e s i sb yt v ，d e t e r m i n a t i o no f s u r f a c et e n s i o n ， n m re t c t h em a i nc o n e l u s i o na r el i s t e db e l o w ： i nt h ef i r s ts e c t i o n ，w es u g a r i z et h em e c h a n i s mo fr e o s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) m e t h o da n dt h er e c e n td e v e l o p m e n t so fr l sp r o b e o fb o t hn u c l e i c a c i d s ，p r o t e i n a n d r a r e ，e a r t h e l e m e n t sa n dt h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e np r o b e sa n dt a r g e tm o l e c u l e sa n di o n s i nt h es e c o n d s e c t i o n ， w ef o u n dt w ok i n d o fm e t a l o r g a n i c c o m p o u n da n de m p l o y e d t h e ma st h e p r o b e o fd e t e r m i n a t i o no fn u c l e i c a c i d s ，a n ds t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t a lo r g a n i cc o m p o u n da n d d n a f i r s t l y ，t h er l sp r o p e r t yo f e u 一0 a d n aw a sf o u n d a t p h9 7 5 ， t h er e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) i n t e n s i t yo fo a e u 3 + s y s t e m i s g r e a t l ye n h a n c e db yn u c l e i ca c i d ，w h i c hi s c a u s e db yt h ef o r m a t i o no f t h e b i gp a r t i c l e s f o r m e d b y d n a a n do a e u ”u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e dr l si sp r o p o r t i o n a l t ot h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i di nt h er a n g eo f1 0x1 0 1 t o1 o xi 0 6 9 m lf o r h e r r i n g s p e r md n a 8 o x i 0 一”t oi o x1 0 1 9 m lf o rc a l ft h y m u sd n aa n d1 o x1 0 。 t o1 0 x1 0 。g m lf o r y e a s tr n a ，a n d t h ed e t e c t i o n1 i m i t sa r e0 0 2 0 ， 0 0 1 1a n d0 0 1 0 n g m l 。r e s p e c t i v e l y a c t u a ls a m p l e s w e r ed e t e r m i n e d s a t i s f a c t o r il y a tt h es o m et i m e 。t h er l s s p e c t r a a n d a b s o r p t i o n s p e c t r a w e r e a p p l i e d t o s t u d y t h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nb e t w e e n n u c l e i ca c i da n do a e u “ s e c o n d l y ，w e s t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no fs c h i f f b a s e ( z n s a p ) a n d n u c l e i ca c i d s u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ea d d i t i o no fd n ac a n i n c r e a s et h er l s i n t e n s i t yo fz n s a p ，w h i c h i s p r o p o r t i o n a l t ot h e in c r e a s i n go ft h ec o n c e n t r a t i o no fd n a t h eli n e a r r a n g e t o f s d n a ， y r n aa n dc t d n k a r e3 0 x i 0 1 i 0 1 0 一，i 0 x 1 0 - 8 _ i 0 x 1 0 一，1 0 x i 0 1 0 1 0 一g m 1 ，r e s p e c t i v e l y a n dt h ed e t e c t i o n1 i m i t sa r e 1 3 ，1 0 ， 1 o n g m l ，r e s p e c t i v e l y s y n t h e t i cs a m p l e s w e r ed e t e r m i n e d s a t i s f a c t o r i l y i nt h et h i r ds e c t i o n ，i ti sf o u n dt h a ti nt h es o d i u mc i t r a t e h c i b u f f e r ( p h = 2 7 5 ) ，t h e w e a kr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g o fc rw a s e n h a n c e d g r e a t l yb y b o t h p r o t e i na n d t x 一1 0 0 t h em a x i m u mp e a ki sa t 3 6 0 h m t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo fr e s o n a n c e1 i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) w a s i n p r o p o r t i o n t ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n t h e 1 i n e a r r e l a t i o n s h i pw a s o b t a i n e db e t w e e nt h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) i n t e n s i t ya n dp r o t e i n i nt h er a n g 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a c a u s e st h ee n h a n c e dr l s i ti so n eo ft h em o s ts e n s i t i r e m e t h o d si n d e t e r m in i n go fn u c l e i ca c i d t h ed e t e c t i o n1 i m i t i si o wt oi 0 1 g m 1 a n dt h e n ，w e p r o p o s e d t h e a p p l i c a t i o n o fs c h i f fb a s e i nt h e d e t e r m i n a t i o no fd n ai nf i r s tt i m e 2 i nt h e s t u d y o fc r t x 一1 0 0 一b s ar l s s y s t e m ，s e v e r a le x p e r i m e n t m e t h o d sw e r eu s e dt o p e n e t r a t e t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m o f i n t e r a c t i o n a m o n gs u r f a c t a n t ，b s a a n dd y e t h ee x p e r i m e n t r e s u l t s s h o w st h a tb s aa n dn o n - i o ns u r f a c t a n t c a nc o o p e r a t ei n c r e a s et h er l s o fc rd y e a n dt h ei n t e r a c t i o np a t t e r no f t h e mw a sp r o p o s e dw h i c h h a v ec o n s i d e r a b l em e a n i n gf o rt h es t u d yo fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s a n dm i c r o m o l e c u l e s 3 f i r s tt i m e p r o p o s e d t h eu s eo fr l s t e c h n i q u e t o a s s a y t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nd y s p r i u ma n d6 - d i k e t o n e a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t o fd y s p r i u mi sv e r yl o w ，a n dl i n e a rr a n g ei sw i d e k e y w o r d s ：r e s o n a n c e1 i g h ts c a t t e r i n g ， n u c l e i c a c i d ，p r o t e i n ， o x o l i n i c a c i d ，e u ，c o n g or e d ，t x 一1 0 0 ，s c h i f fb a s e ，d y s p r i u m 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：筮：盘基鲤p 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：五立器绰导师签名：姜壑一日期：递些- 二_ l 堡耋i 型：鳖堡! ：垒鱼叁童望圭耋i 鍪圣篁量堡塑 符号说明 rt s ：共振光散射 t e g ：透射电子显微镜 1 h n m r ：核磁共振氢谱 c l d m ：小牛胸腺脱氧核糖核酸 f s d n a ：鱼精予脱氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 b s a ：牛血清蛋白 h s ；人血清蛋白 c p b ：十六烷基溴化吡啶 c t m a b ：十六烷基三甲基澳化铵 s i n g s ：十二烷基苯磺酸钠 s d s ：f 二烷基磺酸钠 s l s ：十二烷基硫酸钠 t x l ：曲拉通x - 1 0 0 哪t a ：六次甲基四胺 t r is ：三羟甲基胺基甲烷 o a ：恶喹酸 z n s a p ：水杨醛缩乙醇胺合锌 9 p v i p h d ：l ，6 一双( 】1 苯基一3 甲壤5 u 毗畦删一q 。一基 己二酮 1 0 ：空白体系共振光散射的强度 i 。：样品体系共振光散射的强度 i 。：加入样品后体系共振光散射强度的增强值，i “= i “i 一，? 第一章绪论 第一节共振光散射法概述 一、共振光散射现象的产生及其发展 1 共振光散射技术的发展过程： 早在1 9 1 0 年，e i n s t e i n 用宏观波动理论对各向同性透明介质中的光散射 现象，进行了准确描述。1 9 7 5 年，b a u e r 等人 1 开始了对分子吸收体系的光散 射现象的研究，在理论和实验方面均取得了突出的成绩，他们当时用的是特制 的激光散射仪。后来，m i l l e r 用宏观波动理论对共振增强瑞利散射进行了理论 上的研究 2 ，而a n g l i s t e r 和s t e i n b e r g 则通过实验研究了共振瑞利散射强度 和偏振比 3 ，4 。 光散射实验可以提供有关粒子大小、形状等方面的信息，光散射技术已广 泛应用于胶体化学和高分子溶液的研究中。在荧光测定中散射光常作为一种干 扰源而被消除 5 ，6 ；经典的光散射实验应避免光吸收或荧光对于散射光的干 扰。早在1 9 8 4 年，k n o l l 等就提出了以染料键合d n a 引起染料的共振光散射增 强而对d n a 进行光散射标记 7 ；1 9 9 3 年p a s t e r n a c k 8 等使用普通荧光分光光 度计获得了共振光散射光谱，并研究了卟啉类化合物在核酸上的j 型聚集，共 振光散射新技术才开始为人们关注。近年来，李克安、黄承志、刘绍璞等领导 的研究小组将共振光散射技术用于微量核酸、蛋白质等生物大分子的测定以及 一些离子缔合反应光谱特征及其变化的研究 9 2 7 。 近来我们将表面活性剂与生物化学紧密联系起来，利用共振光散射技术， 表面张力测定等技术等手段研究了多种阳离子表面活性剂以及阳离子表面活性 剂敏化下配体与核酸，蛋白质之间的相互作用，并建立了纳克级核酸和微量蛋 白质的分析方法 2 8 3 3 。 2 共振光散射现象的产生 当分子吸收较低能量的光子后，不足以使分子中的电子由基态跃迁到激发 态，而是激发至基态中较高的振动能级，在较短的时间里( 约1 0 1 2 s ) ，电子又返 回原来的能级，并伴随着不同方向上的散射光 3 4 ，这就是瑞利散射。 光散射与质点的不均匀性有关，如果介质中粒子很小，如d 2 0 k ，便产生 以r a y l e i g h 散射为主的分子散射 3 4 ，3 5 。根据入射光与散射光波长的不同 可以分为弹性光散射、非弹性光散射、准弹性光散射 3 6 ，3 7 。瑞利散射是散 射波跃等于入射波长的弹性散射，在远离分子吸收带、各向同性的均匀介质 中，散射光强度与入射光波长的4 次方成反比。但当入射光波长接近于分子的 吸收带时，即散射光频率接近或等于散射分子电子吸收的频率时，瑞利散射将 偏离瑞利定律，且某些波长的强度将急剧提高，这种现象称为共振瑞利散射或 共振光散射 3 8 4 1 。共振光散射比普通的瑞利散射更灵敏，能提供更丰富的信 息量 4 2 4 5 。 3 共振光散射用于分析测定的原理 在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，以九e x ：x e m 同步扫描，即得共振光散射光谱 5 ，1 2 1 4 。在共振瑞利散射峰处，测量体系的 散射光强度( i ) 和试剂空白溶液的散射光强度( i 。) ，则加入待测物后体系散射光 的增强程度a i = i i 。，据待测物浓度和i 间的线性关系可进行待测物的定量测 定。 由于共振光散射光谱是同步光谱，而散射光是源于等波长入射光束激发散射 粒子而产生的。因此，可认为散射粒子是和入射光相同波长的新发光体，故共 振光散射属于同步发光，其散射光强度遵守同步发光方程 4 ： i s = k c b e 。( 九。，) e 。( 九。+ 九) ( 1 ) 式中e 。是在给定激发光波长处( 。，) 的激发函数，e 。是在对应的发射光波长 处的发射函数( 九。= 。；+ ) 。因为a x = 0 ，所以共振光散射强度： i , 。= k c b e 。；( 九。，) e 。( 九。)( 2 ) k 是与仪器有关的常数，b 是液池厚度。由此可知，当仪器条件一定时，共振光 散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此可对散射粒子进行定量测定。 光散射信号除了与散射质点的大小、形状有关外，还与质点的数目( 浓 度) 有关，利用这种技术，可以研究有机染料诱导核酸分子的构象变化以及核 酸超螺旋结构的形成 4 6 4 8 。有机染料在核酸表面的长距组装也将产生特征的 共振光散射光谱 4 9 - 5 0 。 第二节核酸与蛋白质共振光散射研究概述 一、核酸共振光散射探针研究进展 核酸是生物体内一类重要的大分子，它们不仅起着储存，复制和传递遗传 信息的作用，而且还决定着细胞的种类及其功能，在生命的起源，生物的遗传 缝鲞：盐丛堡出盔厶堂亟主芏焦迨塞笙= 至 变异，物种的进化等方面起着决定性的作用，因此对它们的研究已成为生命科 学的重要内容。从生物分析化学的角度对核酸定性，定量检测及其与探针分子 作用机理的研究引起了分析工作者的极大兴趣 5 卜5 7 。近年来，现代分子生 物学的发展以及分子生物学在临床诊断中的应用，已证明许多疾病的发生，尤 其是目前困扰人类的癌症等都与体内的遗传物质一核酸的变化有着密切的关系 5 8 ，5 9 。核酸光谱探针在现代分子生物学、生物医学等领域是一个极其重要 的工具，有着广泛的应用。利用光谱探针建立核酸准确，灵敏的分析方法并探 讨探针分子与核酸的作用机理，对提供生物体内的核酸浓度或者结构方面的变 化信息，建立人类基因图谱，进而寻找能与核酸分子模板结合并能干扰核酸分 子参与生命过程的物质。对诊断疾病，了解某些药物的作用机理，设计开发和 筛选新型抗癌药物以及改型换代化疗及防癌试剂等，都具有重要意义 6 0 6 7 。 核酸d n a 是由两条多核苷酸链组成的双螺旋结构高分子化合物。每条核苷 酸链通过磷酸与糖基5 和3 位的氧原子形成二酯键联接起来，链之间的作 用力主要为配对碱基之间的氢键。每个糖基的l 位均有嘧啶或嘌呤碱基，g ， a ，c ，t ，相邻两个碱基之间的夹角为3 2 。连接糖基与碱基的c - n 键与碱基的 长链之间有一夹角，使糖基和磷酸基之间形成大沟和小沟两种沟槽 6 8 ，核酸 的分子结构为核酸与其他分子相互作用提供了多种作用的方式。目前用于核酸 光谱分析法主要有吸光光度法 6 9 7 2 ，荧光法 7 3 一l l o ，以及共振光散射法 等。本文主要采用了共振光散射法用于核酸的测定，以下为近年来共振光散射 法用于核酸的研究进展。 近年来，共振光散射技术已被广泛应用于生物大分子的测定。目前用于核 酸的共振光散射探针主要有，有机染料，阳离子表面活性剂，金属离子络合物 及会属离子等试剂。 ( ) 、有机染料探针： 1 水溶性卟啉试剂( m e s o 一四( 对一三甲基氨基卟啉，简称t a p p ) 是首先被用 作核酸光散射分析的染料。它是一个带正电荷的大环共轭分子，它以卟啉取代 基上的正电荷和大环共轭体系与核酸骨架上的磷酸根和碱基等分别发生静电作 用和疏水作用 1 1 1 。t a p p 及质子化t a p p 在核酸表面堆积，导致核酸超螺旋结 构的形成。在超螺旋结构中，堆积在核酸表面的卟啉分子结合产生了染料分子 的线性密度，导致了有效的电子激发离域，共振光散射增强就是由于这种核酸 超螺旋结构中电子激发离域所引起的 1 1 2 。在弱碱性条件下( p h 7 4 8 ) ，利用 核酸时t a p p 及质子化t a p p 的共振光散射增强可以测定纳克级的核酸。 2 三苯甲烷类阳离子染料如乙基紫 1 1 3 ，在5 9 2 n m 处有特征吸收峰，加入d n a 后，该峰消失，在5 0 7 r i m 出现新的吸收峰，并在5 1 0 n m 出现共振散射峰，其强 度与d n a 浓度呈线性关系，检出限为1 5 4 n g m l 。另外用于核酸测定的类似染 料还有甲基紫 1 1 4 ，结晶紫 1 1