（特种经济动物饲养专业论文）家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究.pdf

摘要 家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶 抑制剂的研究 特种经济动物饲养硕士研究生：王凌燕 指导教师：赵萍教授 夏庆友教授 摘要 家蚕丝腺是合成丝蛋白的重要器官，家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类重要的蛋 白酶抑制剂，有研究报道其可能和家蚕丝蛋白的合成和保护有关。要阐明家蚕丝蛋白高效特 异合成的机理，家蚕丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控作用是关键问题之一，但目前其相关 研究报道还较少。2 0 0 3 年本实验室成功绘制了家蚕基因组框架图，2 0 0 6 年完成了家蚕全基因 组的寡核苷酸芯片的研制以及从基因水平、表达水平和蛋白质水平建立了功能基因组研究平 台，为我们系统分析家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类、结构特征和进化关系提供了研究 基础和技术保障。本研究首先利用蛋白质研究方法对家蚕丝腺中的胰蛋白酶抑制剂多态性进 行了调查，然后利用分子生物学和生物信息学方法对家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行 了全基因组数据鉴定，对其中重要的抑制剂基因进行了克隆和原核表达。主要结果如下： 1 家蚕丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂的多态性调查 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( n a t i v e p a g e ) 和胰蛋白酶抑制剂( t i ) 活性染色方法 对2 5 个家蚕品系丝腺的胰蛋白酶抑制剂的多态性分布进行了调查，电泳图谱分析表明在家蚕 丝腺中共检测到6 种t l s ，按迁移度分别命名为：1 1 1 、耵i i 、1 r i i 、t i 、t i v 和1 r i v i ， 不同品系中所含的1 r 1 种类不同。以家蚕大造为例，我们对同一品系不同组织器官中的t i 类型 进行调查发现，1 1 在组织间存在多态性，丝腺中的1 r 1 种类与其它组织含有的1 1 种类不同， 具有特异性。以家蚕品系大造和2 1 8 7 2 为例，对不同品系5 龄不同发育时期丝腺的t 1 种类进 行调查发现，品系不同，1 r 1 种类不同；而不同的t 1 种类其活性检n - n 的发育时期不同，但所 有1 r 1 种类的活性都随着发育时期的进行而逐渐增强，吐丝第2 天达到最大，后慢慢降低，蛹 第1 天时几乎检测不到活性。 2 家蚕茧壳中丝氨酸蛋白酶抑制剂的理化性质初探 西南大学硕十学何论文 利用n a t i v e p a g e 和t i 活性染色方法，我们对家蚕陈旧茧壳中的1 r i 活性进行了调查， 发现家蚕陈旧茧壳中的1 1 活性较新鲜茧壳相对降低，个别1 1 种类活性甚至消失。利用不同 p h 和温度处理家蚕茧壳发现，t 1 种类不同，其对酸碱和温度的稳定性不同，其中t 1 对p h 和温度最稳定。 3 家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类、结构特征和进化关系 利用家蚕全基因组数据、基因芯片和e s t 数据，对家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进 行了全基因组数据鉴定，在家蚕丝腺中共鉴定了1 4 种丝氨酸蚩白酶抑制剂特异高量表达，分 别命名为：b m s p i s l b m s p i s l 4 ，都有e s t 证据。利用n c b i 中的b l a s t 工具和结构预测工 具s m a r t 对这1 4 种丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构进行了预测，结果显示b m s p i s 3 、b m s p i s 4 、 b m s p i s 5 、b m s p i s 6 、b m s p i s 7 和b m s p i s 8 具有s e r p i n 型结构域；b m s p i s l 、b m s p i s 2 和b m s p i s 9 具有t i l 结构域；b m s p i s l 2 、b m s p i s l 3 和b m s p i s l 4 属于k u n i t z 型结构域；b m s p i s l l 属于 k a z a l 型结构域；而b m s p i s l 0 既有s e r p i n 又有1 r i l 结构域。采用c l u s t a l w 程序和m e g a 程 序中的邻接法对这1 4 种丝氨酸蛋白酶抑制剂与其它物种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂构建进化树 发现，相同结构域的抑制剂首先聚在一起，说明家蚕丝腺特异高量表达的这四种结构域的丝 氨酸蛋白酶抑制剂在物种间是比较保守的。 4 家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆和原核表达 利用r t - p c r 技术，我们对家蚕丝腺特异高量表达的b m s p i s 5 、b m s p i s 6 、b m s p i s 8 、 b m s p i s l 3 和b m s p i s l 4 五种抑制剂进行了组织表达谱验证，进一步对这5 个基因进行了t a 克 隆，获得了完整的编码序列。利用大肠杆菌表达系统，表达了b m s p i s 6 ，获得了较纯的b m s p i s 6 蛋白样品。 我们希望通过对丝腺特异高量表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究，为了解其在丝腺生长 发育中发挥的重要作用和阐明丝蛋白高效特异合成的机理提供理论数据支持。 关键词：家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂特异高量表达 a b s t r a c t r ”o ，1 l1 s s u e s p e c l t l ca n c i h l g h - l e v e le x p r e s s l o no f s i l k g l a n d s e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r s i nt h es i l k w o r m ，b o m b y xm o r i r a i s i n go fs p e c i a le c o n o m i ca n i m a l ：w a n gl i n g y a n s u p e r v i s o r ：p r o f z h a op i n g p r o f x i aq i n g y o u a b s t r a c t s i l kg l a n di sas p e c i f i co r g a nf o rs y n t h e s i z i n gs i l kp r o t e i ni nt h es i l k w o r m s e r i n ep r o t e a s e i n h i b i t o r sa r eo n eo fi m p o r t a n tp r o t e a s ei n h i b i t o r si ns i l kg l a n d ，w h i c hm a yb ec o n c e r nw i t h s y n t h e s i z i n ga n dp r o t e c t i n gs i l kp r o t e i n r e g u l a t i o no fs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r sp l a y sak e yr o l ei n t h eh i g he f f i c i e n ts i l kp r o t e i n - s y n t h e s i ss y s t e m ，o nw h i c ht h e r ei sal i t t l er e p o r ta tp r e s e n t i n2 0 0 3 ， t h ed r a f ts e q u e n c ef o rt h eg e n o m eo fb o m b y xm o r ih a db e e nf i n i s h e ds u c c e s s f u l l y i n2 0 0 6 ，t h ef i r s t w h o l e - g e n o m em i c r o a r r a yc o v e r i n gt h ep r e s e n t l yk n o w na n dp r e d i c t e dg e n e si nt h es i l k w o r m g e n o m eh a dd e s i g n e da n dt h es t u d yp l a t f o r mo ff u n c t i o ng e n o m ew a sc o n s t r u c t e da tg e n ea n d p r o t e i nl e v e l s ，w h i c hp r o v i d et h er e l i a b l et e c h n o l o g yg u a r a n t e ea n ds t u d yb a s i cf o ra n a l y z i n g s y s t e m i c a l l yt h et y p e s ，s t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i ca n de v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i p so fs e r i n ep r o t e a s e i n h i b i t o r si nt h es i l kg l a n d i np r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ep o l y m o r p h i s mo ft r y p s i ni n h i b i t o r s o fs i l kg l a n di ns i l k w o r mw i t ht h em e t h o do fs t u d yo np r o t e i n ，a n di d e n t i f i e dt h et y p e so fs e r i n e p r o t e a s ei n h i b i t o r sb yt h eg e n o m e - w i d es c a n n i n gw i t ht h em e t h o d so fm o l e c u l a rb i o l o g ya n d b i o i n f o r m a t i c s t of u r t h e rs t u d y ，w ec l o n e da n de x p r e s s e ds e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r so ft h es i l kg l a n d 1 n h em a i nr e s u l t sa r ea sf o u o w s 1 i n v e s t i g a t et h ep o l y m o r p h i s mo ft r y p s i ni n h i b i t o r so fs i l kg l a n di nt h es i l k w o r m b yu s i n gn a t i v e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sf o l l o w e db yt ia c t i v i t ys t a i n i n g ，w e i n v e s t i g a t e dt h ep o l y m o r p h i s mo ft r y p s i ni n h i b i t o r so fs i l kg l a n di n2 5s i l k w o r ms t r a i n s t h e r ea r e6 t l sw h i c hw e r en a m e dt i i ，t i - i i ，t i i i i ，t i 1 v ，t i va n dt i w ef o u n dt h a tt h e r ea r ed i f f e r e n t 两南大学硕十学位论文 t l si nd i f f e r e n ts t r a i n s t a k es i l k w o r ms t r a i nd a z a of o ri n s t a n c e ，w ei n v e s t i g a t e dt h et y p e so f 1 1 si n d i f f e r e n tt i s s u e sa n df o u n dt h a tt h e r ei st h ep o l y m o r p h i s mo ft l si nd i f f e r e n tt i s s u e s t h et y p eo f t i s i ns i l kg l a n di sd i f f e r e n tf r o mt h eo t h e rt i s s u e s t a k es i l k w o r ms t r a i nd a z a oa n d2 1 8 7 2f o r i n s t a n c e ，w r ei n v e s t i g a t e dt h et y p e so ft l si ns i l kg l a n dd u r i n gt h e5 t hi n s t a rs i l k w o r ml a r v a ，a n d f o u n dd i f f e r e n tt y p eo ft 1 si nd i f f e r e n ts t r a i n s w ea l s od i s c o v e r e dt h a tt h ea c t i v i t yo ft h e1 1 sw a s d e t e c t e di nd i f f e r e n td e v e l o p m e n tt i m e s ，t h ea c t i v i t yo ft l sb e c o m es t r o n g eg r a d u a l l yw i t ht h es i l k 酉a n dd e v e l o p m e n ta n dg e tt h ep e a ko fa c t i v i t ya tt h es e c o n dd a yo fs p i n n i n g ，t h e nr e d u c eg r a d u a l l y 2 s t u d yo rt h ep h y s i c sa n dc h e m i s t r yc h a r a c t e ro fs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r si nt h es i l k w o r m c o c o o n u s i n gn a t i v e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s f o l l o w e d b yt ia c t i v i t ys t a i n i n g ，w e i n v e s t i g a t e dt h ea c t i v i t yo ft i so ft h es i l k w o r md a t e dc o c o o n w ed i s c o v e r e dt h a tt h ea c t i v i t yo f t l s o fd a t e dc o c o o ni sl o w e rt h a nt h a to ff r e s hc o c o o na n dt h ea c t i v i t yo fs o m et l sh a sd i s a p p e a r e di n d a t e dc o c o o n w ei n v e s t i g a t e dt h ea c t i v i t yo ft l st h es i l k w o r mc o c o o nt r e a t e dw i t hp ha n d t e m p e r a t u r ea n df o u n dt h a td i f f e r e n tt l sh a st h ed i f f e r e n ts t a b i l i t yo fp ha n dt e m p e r a t u r e ，t i - v ii s t h em o s ts t a b l et if o rp ha n dt e m p e r a t u r e 3 t h et y p e s ，s t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i ca n de v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i p so fs e r i n e p r o t e a s e i n h i b i t o r si nt h es i l kg l a n d b a s e do nt h ee n t i r eg e n o m ef i n em a po fs i l k w o r m ，m i c r o a r r a yd a t aa n de s t , w eh a v ei d e n t i f i e d 1 4g e n e se n c o d i n gs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r s ，w h i c he x p r e s ss p e c i a l l ya n dh a v eah i g he x p r e s s i o ni n t h es i l k w o r ms i l kg l a n d t h e yw e r en a m e da sb m s p i s l - b m s p i s l 4r e s p e c t i v e l ya n dh a v et h e e v i d e n c eo fe s t s w ep r e d i c t e dt h e i rp r o t e i nd o m a i n su s i n gb l a s ti nn c b ia n ds m a r t w e d i s c o v e r e dt h a tb m s p i s 3 ，b m s p i s 4 ，b m s p i s 5 ，b m s p i s 6 ，b m s p i s 7a n db m s p i s 8h a v es e r p i n d o m a i n ，b m s p i s l ，b m s p i s 2a n db m s p i s 9h a v et i ld o m a i n ，b m s p i s l 2 ，b m s p i s l 3a n db m s p i s l 4 h a v ek u n i t zd o m a i n ，b m s p i s l lh a sk a z a ld o m a i na n db m s p i s l 0h a ss e r p i na n dt l ld o m a i n s p h y l o g r a m so fb e t w e e n1 4s e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r sa n dt h o s eo fo t h e rs p e c i e sw a sd i s p l a y e db y n e i g h b o r - j o i n i n ga n a l y s i si nc l u s t a l wa n dm e g a w ef o u n dt h a tt h es a m ed o m a i n sg a t h e r e d t o g e t h e r ，w h i c hs u g g e s t e df o u rs t r u c t u r e so fs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r si nt h es i l kg l a n da r eh i d e b o u n d a m o n gs p e c i e s 4 c l o n d i n ga n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fs e r i n ep r o t e a s ei n h i i t o r ss p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di nt h e s i l kg l a n d s e m i q u a n t i t a t i v er t p c rw a se m p l o y e df o rc o n f i r m i n gt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so ft h ef i v e g e n e sw h i c ha r eb m s p i s 5 ，b m s p i s 6 ，b m s p i s 8 ，b m s p i s l 3a n db m s p i s l 4 t h er e s u l ts h o w e dt h a t i v a b s i r a c i t h e yd oe x p r e s sh i g h l ya n ds p e c i a l l yi nt h es i l kg l a n d 1 1 他f u l lo r ff r a m e so ft h e s ef i v eg e n e sw e r e c o m p l e t e db y1 ad o n i n g i na d d i t i o n ，w eg o tar e c o m b i n a n tp r o t e i no f 目胁砺6b yp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o ni nv i t r o w eh o p et h a tt h es t u d yo fs e r i n ep r o m a s ei n h i b i t o r so ft h es i l k 四a n dc o u l dp r o v i d et h e o r i e sa n d d a t e ss u p p o r tf o re l u c i d a t i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo ff i b r o i nh i g he f f i c i e n c ys y n t h e s i s k e yw o r d s ：s i l k w o r m ；s i l kg l a n d ；s e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r ；t i s s u e - s p e c i f i ca n d h i g h - l e v e le x p r e s s i o n v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：王嘘堕 签字日期：研 年月，丐日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：王凌煦 签字日期：砌7 年乡月f 弓日 导师签名： 签字日期：年月 日 第章文献综述 第一章文献综述 1 1 概述 丝腺是家蚕幼虫末龄体山最人的器官，是合成、分泌丝物质的外分泌腺。家蚕丝腺从形 态帛l 功能上可分为前部丝腙、中部蝗腺和_ l 亓部丝腺如图11 。前部丝腺是左右对称的两条输丝 管，它没有台成和分泌的作州是丝物质流经的导管；中部丝腺连接在前部造腺的后端，足 鼙个丝腺中蛀粗人的部分，又可分为前区、中医及后区，它合成分泌多种丝胶蛋白；后部丝 腺娃枯腺中虽而多弯曲的部分，分泌丝豪蛋白。牲腺虽然在胚胎期就开始发生，但是到了 家蚕5 龄捌随着进食桑叫量的大大增加，才迅速膨大，这时丝蛋白也大鼍台成。丝蛋白是以 水溶液的状态存在的，是种蛋白复合物，由丝亲蛋白、丝胶蛋白和一些小分子化台物即非 纤维多肽组成o 。丝索蚩白和丝胶蛋白由不同的基因编码。丝素蚩白土要由丝豪重链( 肋- h ) ， 丝素轻链0 胁- l ) 和髓基因编码：而丝胶蚩白 要由丝腔基阿i 、丝胶基因2 ，3 、4 转录不同 的m r n a 形成几种不同的丝胶蛋白目。 a l l p 图1 1 丝腺的各个部分 f i 9 1 i t n ev a r i o u s p a r t so fs i l k g l a n d i n t h es i l k w o 皿 前部脾a m中部腺前匣：中船! 腺中区 咖：中“腺后b ：p ：i * 地臃 丝腺在5 龄中、后期，能以惊人的高效率将桑刖蚩白转变成丝蛋白这种高效合成的机 制一直是科学家们研究的热点。从9 0 年代，以_ 凡娄墓闻组计划完成为标志，分于生物学研究 全匝i 进入基闪组时代，国内外科学家也竟相埘家盎的基刚组胜开研究。1 9 9 5 年日奉科学家开 始对包括丝麒在内的家盘上辈日织、器官的琏附表达序删标箍( e s t ) 址 i 分忻 ”i 。2 0 0 3 年 两南大学硕十学位论文 本实验室开展了家蚕全基冈组框架图绘制工作，完成了覆盖家蚕全基因组9 5 的高质量序列 图谱，鉴定了约2 万个家蚕功能基因【5 l o 在此基础上，2 0 0 6 年刘春等人在对家蚕丝腺特异表 达的基因进行研究时发现有1 8 5 个丝腺特异表达的基因【6 1 。其中就有一群基冈是丝氨酸蛋白酶 抑制剂基因。在五龄中后期，家蚕丝腺开始大量合成丝蛋白，丝蛋白在中部丝腺储存到蚕成 熟后才以茧丝的形式分泌到体外，在这期间，许多蛋白酶基因也在丝腺内大量的表达。有研 究认为，为了防止蛋白酶对丝蛋白的降解，丝腺组织特异表达了各种类型的蛋白酶抑制荆， 通过对蛋白酶活性的抑制，防止蛋白酶对丝蛋白的降解【7 8 】。丝腺中特异表达的这些丝氨酸蛋 白酶抑制剂基因是不是有防止丝蛋白不正常降解的作用呢，目前还不清楚。 1 2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类 蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物及微生物中。目前，在自然界中共发现了四种蛋白酶 抑制剂：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋 白酶等的巯基蛋白酶抑制剂( 半胱氨酸蛋白酶抑制剂) ，抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶 抑制剂和抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶d 等的羧基蛋白酶抑制剂( 酸性蛋白酶抑制剂、天冬氨 酸蛋白酶抑制剂) 【9 1 。其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂种类最多，最早由h u n t 和d a y h o f f 发现【1 0 1 ， 它是一个大的蛋白质超家族，其成员拥有保守的三级结构，相似的氨基酸序列和独特的作用 机制。 目前，已经在动、植物和微生物中发现了丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在，这个超家族已拥 有几百个成员【1 l 1 2 】。根据它们之间的序列同源性，半胱氨酸数目和分子中二硫键与作用位点 之间的拓扑学关系可将丝氨酸蛋白酶类抑制剂分为以下几类： 1 2 1k u n i t z 家族 k u n i t z 型丝氨酸蛋白酶抑制剂来源非常广泛，目前从高等生物到低等生物均已分离到。它 们的氨基酸个数从几十到几百，相对分子质量从几千到十几万道尔顿不掣1 3 】。经典的k u n i t z 型丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子内有6 个半胱氨酸，形成3 对保守的二硫键，其中一对二硫键 位于分子表面，另外两对二硫键位于分子内部。由于二硫键不容易被破坏，k u n i t z 型丝氨酸蛋 白酶抑制剂都具有高的热稳定性和p h 稳定性。k u n i t z 型丝氨酸蛋白酶抑制剂最主要的结构特 征是有很明确的b 折叠和c 端a 螺旋。它们与酶的相互作用主要由p 1 位点残基来完成，因 此它的专一性主要由p 1 位点氨基酸残基的性质决定的，p 1 位置是l y s 或a r y 的抑制剂对胰 蛋白酶有作用，p 1 位置为h i s 、a s n 、l e u 、p h e 和t y r 的疏水残基时，抑制剂对胰凝乳蛋白酶 起作用【1 4 1 。 1 2 2k a z a l 家族 k a z a l 型丝氨酸蛋白酶抑制剂一般由一个或多个重复保守的k a z a l 结构域构成，其分为经 典类和非经典类( 图1 2 ) 。经典类的k a z a l 型丝氨酸蛋白酶抑制剂由5 0 - 6 0 个氨基酸残基构 2 第一章文献综述 成，含有6 个半胱氨酸残基，这6 个半胱氨酸残基形成3 对二硫键，并且有一个较为保守的 序列模型：c l - x ( 1 3 ) 一c 一x c s ) - p v c m g x ( 4 ) 一t y - x n - x c i v - x ( 2 6 ) - c v - x ( 9 - 1 6 ) c v l ( x ( n ) ：( x 和1 1 分 别表示任意氨基酸残基及个数) 。和k u n i t z 型丝氨酸蛋白酶抑制剂一样，p 1 位置是酶抑制剂 专一性结合的关键位点，一般来说是第二个半胱氨酸后的第二个氨基酸残基【1 5 】。 1 9 9 9 年m a g e a 等在人类丝氨酸蛋白酶抑制剂l e k t i 中首次发现了非经典类的k a z a l 型丝 氨酸蛋白酶抑制剂，该类抑制剂只有两对二硫键，二硫键c y s m c y s 是缺失的【1 6 1 。2 0 0 5 年 t i a n 1 7 】等在研究重组蛋白e p l l 和e p l l 0 ( 都含有经典型和非经典型的k a z a l 结构域) 时发现 非经典的k a z a l 结构域对枯草杆菌蛋白酶有强的抑制作用，在这种现象的产生过程中，推测进 化压力扮演了主要的角色。 疗烹霉啊仃2 雾霉墨和_ e 8ee0 e0 cec 图1 2k a z a l 型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构特征 f i g 1 2t h es t r u c t u r e c h a r a c t e ro fk a z a l t y p es e r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r s 除了上面描述的单个k a z a l 类型的抑制剂，研究者还发现了多个k a z a l 结构域的类型。在 1 9 9 4 年，j a h a n s s o n 等人纯化了一种具有4 个k a z a l 结构域抑制胰凝乳蛋白酶的丝氨酸蛋白酶 抑制刹1 8 1 。在1 9 9 9 年，m e n d e 等人克隆了一个具有6 个k a z a l 结构域抑制凝血酶的丝氨酸蛋 白酶抑制剂【1 9 1 。在2 0 0 6 年，z h a n g 等人在大肠杆菌中表达纯化了一种具有3 个k a z a l 结构域 的家蚕蛹丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子量为3 3 6 4 2 k d a ，序列模型为c - x 3 c - x 9 c - x 6 - y x t c x - 3 c x 1 1 c 结构特征及序列比对如图1 3 【捌。 3 弓伽 专碧 图1 3a ，3 个k a z a l 结构域的家蚕蛹丝氨酸蛋白酶抑制剂结构 b ，k a z a l 结构域丝氨酸蛋白酶抑制剂多序列比对 f i 9 13 ab m s p ic o n t a i n s 血优k a z a ld o m a i n s b ，s e q u e n c ea l i g n m e n t o f k a z a l f a m i l y i n h i b i t o r d o m a i n s 1 2 3b o w m a n b i r k 家族 b o w m a n - b i r k 型丝氮酸蚩白酶抑制剂l 泛存在于般于叶和单子叶植物中。坝子叶植物中的 b o w m a n - b i r k 型抑制剂( b b i s ) 相对分子质量大约为8 k d a ，拥有两个活性位点。单子时植物中 的b b i s 义町分为阿个家族：一娄分子量人约为8 k d a ，有一个活性位点另一类分子鼍大约为 1 6 k d a ，有两个活性位点2 ”。般子叶植物中b b i s 有1 4 个半胱氰酸残基，单子叶植物b b i s 失去r 烈，叶植物b b j s 的两埘二硫键( c 3 c ，c 1 0 c ) ，有1 0 个半胱氨酸残基如幽14 。 什。翮佣 图1 4 双于叶植物b b i s 和8 k d a 单子叶植物b b i s 的二硫键图谱 f i g1 4 d i s u l f i d e e c t i v i t y i nd i e o t b b i sa n d8 k d a m o n e t b b i s l2 4 s e r p i n 家族 s e r p i n 家族的蛋白酶抑制剂是一群分子量人约为4 0 - 5 0 k d a 的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它广 第一章文献综述 泛存在于生物体中，但至今没有被在真菌中发现。它参与了许多生物学过程，例如：凝血、 补体活化、纤溶、血管生成、细胞程序性死亡、炎症和抑制肿瘤等【2 3 1 。s e r p i n 的活性中心环 ( r e a c t i v ec e n t r el o o p ，r c l ) 大约由位于c 端的2 0 个氨基酸残基组成，它在酶和抑制剂结合 的过程中起着重要作用，当p 1 和p 17 在酶的作用下断裂时，r c l 就牵引酶转向s e r p i n 的另 一侧引诱酶，引起酶大的构象改变，因此s e r p i n 型抑制剂也被称为自杀性抑制剂。另外，我 们可以从r c l 的结构判断该抑制剂是否有抑制活性【2 4 1 。 1 2 5t i l 家族 t i l 家族的蛋白酶抑制剂是一群小分子量的丝氨酸蛋白酶抑制剂，含有1 0 个半胱氨酸， 形成5 对二硫键，经典的二硫键组成形式是1 7 、2 - 6 、3 - 5 、4 1 0 和8 - 9 。但是，由于进化的 需求，这个家族成员为了适应环境自身结构也在发生着变化，出现了含有4 对二硫键的抑制 剂。例如1 9 9 6 年，i t o h 等人利用原核表达系统表达了家蚕的一种真菌蛋白酶抑制剂f ，该抑 制剂就属于这个结构域嘲。 1 2 6 其它 除了以上这几种抑制剂类型外，研究者还发现了其它几种比较少见的抑制剂类型。例如： 马铃薯蛋白酶抑制剂i 和马铃薯蛋白酶抑制剂( p o t a t op r o t e a s ei n h i b i t o r ，p i i i ) 家族，这 两类家族都属于创伤诱导类型表达的蛋白酶抑制剂。p i 1 家族是一类单键非共价键的四聚体抑 制剂，有一个链内二硫键键桥，只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酣2 6 1 。p i - i i 家族有 两个活性中心，可同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 2 7 1 。还有一些丝氨酸蛋白酶抑制剂只存 在于吸血性生物体中，主要有水蛭素( h i r u d i n ) 、扁虱抗凝血肽( t i c ka n t i c o a g u l a n tp e p t i d e ，t a p ) 、 钝缘蜱素( o m i t h o d o r i n ) 等，其分子量在6 - - - 8 k d a 左右，该类抑制剂只对x a 因子或凝血酶具 有极强和专一性的抑制作用。 1 3 昆虫中丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究 昆虫体内没有淋巴细胞和免疫球蛋白来防御外界的侵染，因此在长期的进化过程中形成 了独特的防御体系，如黑化反应、分泌抗菌肽杀死微生物等。这两个免疫反应过程都需要多 种丝氨酸蛋白酶参与的级联系统来保证信号的传递及放大，s e r p i n 型丝氨酸蛋白酶抑制剂在此 过程中发挥抑制调节作用，使得免疫反应迅速、剧烈地执行，并且把它限定到一定的程度与 范围内以避免对宿主造成危害。目前，果蝇中s e r p i n 调节的丝氨酸蛋白酶级联系统和烟草天 蛾中s e r p i n 调节的酚氧化酶激活途径研究得较为清楚。 果蝇中已经分离纯化了多种丝氨酸蛋白酶抑制剂，研究者也对其中几种的功能进行了研 究。在1 9 8 0 年k a n g 等在黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 体液中纯化了一种相对分子量 为1 2 k d a 、对p h 和热有强稳定型的可抑制a 牛胰凝乳蛋白酶和成年蚊虫胰凝乳蛋白酶的抑制 剂【2 9 j 。1 9 9 4 年d o n g m i n 等人在果蝇中纯化了一种抑制牛胰蚩白酶而不抑制胰凝乳蛋白酶的丝 5 西南大学硕+ 学位论文 氩酸蛋白酶抑制剂，其分f 量8 k d a ，打很强的酸碱稳定性i 。2 0 0 3 年h a s h i m o t o 等人的研究 结果认为，当果蝇受到真茼侵染时，细胞外的s e r p i a 4 3 a c 会调肖t o l l 途径对其做出反应”“。 在2 0 0 4 年r i c h e r 等人的研究认为果蝇s e r p i n 4 a 是一种细胞内丝氯酸蛋白酶抑制剂，它在细胞 分秘途径中起着调节的作用吲。2 0 0 4 年j a k o b s e n 等人利州酶和抑制剂之间的相且作川的黄系， 荧光标记胰凝乳蚩白酶抑制剂和b b i 型的抑制剂定位了成年粜蝇丝氨酸蛋白酶在胚胎发育 过程中的彳了为。随着粜蝇丝氰酸蛋自酶抑制剂的研究深入，住2 0 0 5 年r e i c h h a r t 绘制了果 蝇中s e r p i n 凋符的丝氩酸蛋向酶级联系统( 圈1 5 ) 惮j 。 烟草天蛾血液中也有多种丝氨酸蛋白酶抑制荆，日前研究者已经对一些抑制剂进 j ，分 离纯化和理化性质的研究。1 9 8 8 年r a m e s h 等从烟草大蛾( m a n d u c aj 蹦m ) 血液中纯化了两 种胰蛋白酶抑制剂，其分子量分别为8 3 0 0 k d a 和9 1 0 0 k d a 。| 青都是k u n i t z 类型的蛋白酶抑 制剂，与牛的胰蛋白酶抑制剂相似。能够抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血浆酶和凝血酶的 活性m j 。2 0 0 4 年w a n g 等人从细苗侵染的烟草天蛾幼虫血液中纯化了种s e r p i n 型的丝氪酸 蚩自酶抑制剂，命名为s e r p i n - 6 ，它的分子量和等电点分别为4 6 ，7 1 0 1 0d aa n d5 4 。它的 序列和烟草天蛾s e r p i n 1 、2 和3 但相似，对酚氧化酶原馓活酶( p a p 3 ) 有强烈的抑制亍舌性， i j 对p a p 1 取j2 没有抑制作用o ”j 。2 0 0 5 年t o n g 等人的实验结果认为s e r p i n _ d 和s e r p i n r 5 抑制 血液中酚氧化酶原的话性，显然是通过抑制酚氧化酶原的激活荆的蛋白酶来实现的p “。2 0 0 8 年z o u 等人从烟草天蛾脂肪体中克隆了s e r p i n 6 ，并用大肠杆菌表达系统袁达了s e r p i n i 蛋 向，对其功能研究发现在经细曲侵染后，s e r p i a6 的m r n a 和蚩r i 质水平都会显著升高。 s e r p i n 6 抗体彝免疫亲和屡析发现s e r p i n6 与免疫凝集素2 、丝氢酸蛋白酶同系物、酚氧化酶 原、酚氧化酶和血液蛋n 酶一8 相结台【”i 。这些实验结果意味着s e r p i n 型的丝氨酸蛋白酶抑制 剂d 烟草天蛾血液酚氧化酶激活选径巾扮演着重要的角色。 j e 图1 5 果蝇中s e r p i n 调节的丝氨酸蛋白酶级联系统 f i g1 5s e r p i n - c o n t r o l l e dp r o t e o l y t i ec a s c a d e s 第一章文献综述 另外，研究者也对蝗虫、蜜蜂和大蜡螟等昆虫中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了研究。目 前已经从飞蝗和沙漠蝗中纯化了8 种丝氨酸蛋白酶抑制剂。在蜜蜂中发现了3 种胰凝乳蛋白 酶抑制剂a m c i i a m c i 3 。这3 种抑制剂都含有多个半胱氨酸残基，其中a m c i 1 为单链， 含有5 6 个氨基酸残基分子量为5 9 7 2 d a 。a m c i 2 和3 是双链，a m c i 2 产生于a m c i 1 的第 2 4 - 2 5 肽键断裂，它们的氨基酸组成相同。a m c i 3 比a m c i 1 和a m c i 2 少2 个氨基酸残基。 这三者之间具有很高的同源性，都对牛a 胰凝乳蛋白酶有明显抑制作用【觋4 0 l 。在大蜡螟的茧 壳中纯化了两种丝氨酸蛋白酶抑制剂。一种是k a z a l 型的，成熟肽段有3 6 个氨基酸残基，分 子量为3 9 9 3 d a ；另一个是k u n i t z 型的，成熟肽段有5 6 个氨基酸残基，分子量为6 0 5 6 7 d a 。 推测它们对细菌和真菌蛋白酶有抑制作用【4 1 1 。 1 4 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制