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生命科学技术在法医学中的应用研究 ( 中文摘要) 第一章 成都地区嗜尸性苍蝇数据库建设、尸体生物学分解规律及其与死亡时 间的关系研究 目的本研究旨在通过对成都地区嗜尸性苍蝇种类、季节活动规 律、尸体生物学分解进行研究，探讨成都地区嗜尸性苍蝇种类、季节 活动规律及其与死亡时间的关系，初步建立成都地区常见嗜尸性苍蝇 种类及其生长发育规律数据库；研究成都地区尸体生物学分解规律与 死亡时间的关系；研究依据嗜尸性苍蝇体长及蝇壳来推断死亡时间的 效果；探讨影响嗜尸性苍蝇生长发育的主要因素；探讨嗜尸性苍蝇样 本采集方法。方法观察3 1 1 月7 种环境下兔、狗尸上嗜尸昆虫种 类变化，重复试验两年；研究从1 3 例室内高度腐败尸体的现场提取 嗜尸性苍蝇、蛆及蝇壳样本。结果发现3 1 1 月兔尸上出现的嗜尸 昆虫种类主要有舍蝇、丝光绿蝇、大头金蝇、赭尾麻蝇、巨阿尾丽蝇； 其中，巨阿尾丽蝇见于3 、4 月，舍蝇出现于4 月中旬至l o 月初，而 大头金蝇、丝光绿蝇、赭尾麻蝇则自3 月至1 0 月中下旬均可见到， 1 1 月中下旬以后乃至暖冬季节，仍可见到少量丝光绿蝇；幼虫的出 现晚于成虫1 - - 4 天不等，与季节及环境有关；成都地区动物尸体分 解可分为5 个阶段。结论初步建立了成都地区嗜尸性苍蝇生长发育 规律数据库；研究表明利用本地区嗜尸性苍蝇的生长发育规律可以推 断死亡时间；本研究表明，嗜尸性苍蝇生活周期和尸体生物学分解受 地理环境因素包括地区、温度、湿度、风力、日照时间、现场和尸体 状况等影响，根据尸体生物学分解情况也可以初步推断死亡时间；本 研究表明，在腐败尸体早期，可根据嗜尸性苍蝇的蛆长推断死亡时间， 而在腐败尸体中期可根据现场周围有无蛹壳等情况来推断死亡时间； 本研究表明，正确采集嗜尸性苍蝇标本并及时送检对于推断死亡时间 是非常重要的。 关键词：成都地区；嗜尸性苍蝇：兔；狗；死亡时间：尸体生物学分 解 第二章 大鼠肝脏、骨骼肌、心肌、脑组织d n a 降解与死亡时间的关系 目的本研究旨在通过实验探讨大鼠死后肝脏、骨骼肌、一t l , 肌、 脑组织d n a 降解与p m i 的关系；评估计算机图像分析技术在检测死后 脏器组织d n a 含量变化中的应用效果；探讨检测何种脏器组织d n a 含 量来推断p m i 效果好；探讨环境因素在死后脏器组织d n a 含量变化中 影响程度；探讨影响大鼠死后脏器组织d n a 含量的因素。方法实验 选择2 5 c 和4 c 两种环境，分别取2 1 只大鼠，分为7 组，每组3 只， 一组即时处死作为对照，余六组处死后，分别于死后2 、4 、8 、1 2 、 2 4 、3 6 小时取肝脏、骨骼肌、心肌、脑各一块，福尔马林固定，f e u l g e n 和r o s s e n b e c k 改良法染色，自动医学图像分析系统测量，统计学处 理数据。结果2 54 c 环境，肝脏f e u l g e n 和r o s s e n b e c k 改良法染色 效果较好，随着死后时间延长，核内d n a 染色强度下降，骨骼肌、心 肌、脑组织染色及图像分析效果欠佳；d n a 降解的幅度在不同时间存 在不一致的现象；4 c 环境，肝细胞等核内d n a 染色强度无明显下降。 结论本研究证实细胞核d n a 降解与p m i 在统计学上存在回归拟合关 系，利用计算机图像分析技术测定细胞核d n a 含量变化推断p i v l i 效 果好，肝脏相对心肌、骨骼肌和脑组织而言，其计算机图像分析结果 即d n a 含量与p m i 相关性较强，是检测d n a 降解的最合适的组织，影 响大鼠死后脏器组织细胞d n a 含量的因素包括：环境因素、制片因素 等。 关键词死亡时阐；d n a 降解；大鼠；肝脏；骨骼肌；心肌；脑；计 算机图像分析系统 第三章 d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因座等位基因分型标准物的构建：d 2 0 s 1 6 1 基因座等位基因命名修正 目的构建d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因座等位基因分型标准物， 解决短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 分型上存在的准确 性和标准化问题。方法先用p c r 扩增出d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因 座的各等位基因片段，将其插入p u c 重组质粒中，经转染大肠杆菌、筛 选、确认、放大培养、测序分析；等位基因片段采用国际标准即核心 序列重复数进行命名，最后以重组d n a 为模板，p c r 扩增，将扩增产 物混合即制各出标准的d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因座等位基因分型 标准物；应用上述等位基因分型标准物分别在四川大学基础医学与法 医学院物证实验室和成都市公安局刑侦局d n a 实验室对1 0 份陈旧精 斑检材进行d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因座分型。结果应用此法制备 出大量的d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因座等位基因分型标准物，两个 d n a 实验室对于同一组样本进行d 2 0 s 1 6 1 和d 8 s 3 8 4 两个基因座分型， 均获得一致的结果，修正了d 2 0 s 1 6 1 基因座等位基因的命名。结论该 法制各的s t r 基因座等位基因分型标准物重复性能好，质量可靠。 关键词等位基因分型标准物；d 2 0 s 1 6 1 ；d 8 s 3 8 4 ；短串联重复序列： 聚合酶链反应；遗传多态性 a na p p l l e ds t u d yo fl i f es c i e n c e sa n dt e c h n o l o g yi nf o r e n s i c c h a p t e r 1 m e d i c i n e ( a b s t r a c t ) f o r e n s i cr e l e v a n c eo ft h e s a r c r o s a p h a g o u s f l i e sf o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h ep o s t m o r t e mi n t e r v a li nc h e n g d u o b j e c t i v et h ed a t a b a s e so fs a r c o s a p h a g o u sf li e sa n dt h e b i o l o g i c a ld e c o m p o s i t i o no fc a d a v e ra r ev e r yi m p o r t a n tf o rt h e d e t e r m i n a ti o no ft h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l i no r d e rt oe v a l u a t e t h er e l e v a n c e ，t h e s t u d yf o rl o n gt i m e ，t w oy e a r s ，o b s e r v a t i o n w a sc a r r i e do u t m e t h o d ss t u d i e sw e r ec a r r i e do u ti n2 0 0 1 2 0 0 3 i n c h e n g d ur e g i o n o n6 9 s u b j e c t s o fw h i c h5 6h a db e e n p u r p o s e f u l l yd e l i e v e r e dt ot h es i t eo ft h ee x p e r i m e n ta n d1 3 f o u n di nn a t u r a le n v i r o n m e n t t h e r ew e r e2 8 c a d a v e r so fb i g a n i m a l s ( d o g s ) ，2 8o fm e d i u m s i z eo n e s ( r a b b i t s ) f 1 i e sf r o m t h ec a d a v e r sw e r eo b s e r v e da n di d e n t i f i e d r e s u l t sp e r i o d so f d e v e l o p m e n to fm a i n l y5f l ys p e c i e sa td i f f e r e n te n v i r o n m e n t w e r ed e t e r m i n e de x p e r i m e n t a l l y f r o mm i d t i m eo fa p r i it ot h e b e g i n n i n go fo c t o b e r 。 m u s c ad o m e s t i c a u i c i n ac o u l db es e e no n t h ec a d a v e r s ，h o w e v e r ，a l d r i c h i r ag r a h a m i o n l yc o u l db es e e n b e f o r et h e b e g i n n i n g o f m a y 。o t h e r w i s e ，l u c i l i as e r i c a t a ， ，8 一 c m e g a e e p h a l a ，s f u s c i e a u d a c o u l db es e e no nt h ec a d a v e r sf r o m m a r c ht ot h ee n d o fo c t o b e r a f t e rt h em id ti m eo f n o v e r m b e r ，o n l yaf e wo fs a r c o s a p h a g o u sf l i e sc o u l db es e e no n t h ec a d a v e r s0 nt h eo t h e rh a n d，m a g g o t so fs a r c o s a p h a g o u s f li e sc o u l db es e e no f t e no nt h ec a d a v e r sa f t e ra d u l t so f s a r c o s a p h a g o u s f l i e s i n t r u d i n g 1t o4 d a y s ，r e l a t i n g t o t e m p r e t u r eo fe n v i r o n m e n t t h ep r o c e s so fc a d a v e rd e c o m p o s i t i o n i ss u b d i v i d e di n t of i v es t a g e sa n de a c hs t a g ec o r r e s p o n d st o ac e r t a i nd e g r e eo fc a d a v e rt i s s u e d e c a y c o n c l u s i o nt h i ss t u d y s h o w e dt h a taf o r e n s i cd a t a b a s e so fs a r c o s a p h a g o u sf 1i e sa n d t h eb i o l o g i c a l d e c o m p o s i t i o n o fc a d a v e ra r eu s e f u lf o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l k e y w o r d ：c h e n g d u ，s a r c o s a p h a g o u s f l i e s ，s p e c i e s ，r a b b i t s d o g s ，p o s t m o r t e mi n t e r v a l ，b i o l o g i c a ld e c o m p o s i t i o no fc a d a v e r c h a p t e r2 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np m ia n dt h ed n ad e g e n e r a ti o no ft h e 1 i v e r 、s k e l e t o nm u s c l e 、h e a r tm u s c l e 、b r a i no fr a t s o b j e c t i v et oe x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np m ia n dt h e d n ad e g e n e r a t i o no ft h e1 i v e r 、s k e l e t o n m u s c l e 、h e a r tm u s c l e 、 9 b r a i no fr a t s a tt h es a m et i m e ，w ee v a l u a t et h em e t h o d so ft e s t a n dt h ef a c t o r sw h i c hi n f l u e n c et h ec h a n g eo fd n ac o n t e n t m e t h o d san u m b e ro f4 2r a t sw e r ed e v i d e di n t o2k i n d so f e n v i r o n m e n t ( 2 5 ca n d4 c ) a n d7 g r o u p sa tr a n d o m o n eg r o u p i se x e c u t e d r i g h t n o wa sc o n t r 0 1 t h eo t h e r6 g r o u p sw e r e e x e c u t e da t2 、4 、8 、1 2 、2 4 、3 6h o u r sa n dw et o o ks a m p l e s r e s p e c t i v e l y a 1 1s a m p l e sw e r ef i x e dw i t hf o r m a l i na n ds t a i n e d w i t hf e u l g e na n dr o s s e n b e c km e t h o d t h er e s u l t so fs t a i nw e r e a n a l y s i d e db ym i a s ( i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ) r e s u l t s t h ee x t e n to fd n ad e g e n e r a t i o na r ed i s a c c o r da td i f f e r e n tt i m e o fd e a t h ，a n dt h e r ea r e as t a t i s t i c a lf o r m u l a t i o n b e t w e e nt h e m c o n c l u s i o nt h e r e a r er e g r e s s i o ni m i t a t i o nb e t w e e nt h e e x t e n to fd n ad e g e n e r a t i o na n dp m i d e t e r r m i n i n gt h eq u a n t i t y o fd n ai nn u c l e a rs h o u l db e a no b j e c t i v ea n de x a c tw a yt o e s t i m a t et h ep m lw i t ht h ea u t o i m a g ea n a l y s i st e c h n i q u e w ec a n d e d u c ep m ib yt h i sw a y ，b u ti ti s n e c e s s a r yt os t u d yf u r t h e r k e yw o r d s p m i ；d e g e n e r a t i o no f d n a ；r a t s ；l i v e r ：s k e l e t o n m u s c l e ；h e a r tm u s c l e ；b r a i n ；a u t o i m a g e a n a l y s i st e c h n i q u e 1 0 - c h a p t e r3 s t u d y o nt h ec o n s t r u c t i o no fs t a n d a r dd 2 0 s1 61a n dd 8 s 3 8 4 a l l e l i cl a d d e r ：a m e n d m e n tt ot h ed e s i g n a t i o no fd 2 0 s 1 6 1a l l e l e s o b j e c t i v e t or e s o l v et h e p r o b l e m o ft h e a c c u r a c y a n d s t a n d a r d i z a t i o no fs h o r tt a n d e m r e p e a t p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( s t r p c r ) t y p i n gi nf o r e n s i cp r a c t i c e ，a n e wm e t h o d o fp r o d u c i n gs t a n d a r dd 2 0 s 1 6 1a n dd 8 s 3 8 4a l l e l i cl a d d e rw a s d e s i g n e d m e t h o d s d i f f e r e n tp c ra m p l i f i e da l l e l i cf r a g m e n t s o fd 2 0 s 1 6 1a n dd 8 s 3 8 4w e r ei s o l a t e df r o mt h eg e l ，e l u t e di n t o t h ed i s t i l l e dw a t e ra n d r e a m p l i f i e db y p c r t h e p u r i f i e d a ll e li cf r a g m e n t sw e r et h e nb l u n t e n ds u b c l o n e di n d i v i d u a l l y i n t ot h ep u cp l a s m i dv e c t o r sa n dt r a n s f e c t e di n t o c o m p e t e n t e c o l id h 5a ”c e l l s t h es e q u e n c i n gr e s u l t sc o n f i r m e dt h a tt h e s i z ea n dt h es t r u c t u r eo ft h ei n s e r t s w e r ec o r r e c t t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d sd n aw e r et h e nu s e da s t e m p l a t e sf o rp c r r e a m p l i f i c a t i o n t o g e n e r a t ed 2 0 s 1 6 1a n dd 8 s 3 8 4s t a n d a r d l a d d e r t h eo l ds e m e ns t a i n sh a v eb e e na n a l y z e d u s i n gt h el a d d e r i nt w od n al a b r e s u l t sw eg e n e r a t ed 2 0 s 1 6 1a n dd 8 s 3 8 4s t a n d a r d l a d d e r w i t ht h es t a n d a r dl a d d e r ，t w ol a b sr e s u l t so ft h es a n l e s a m p l e ss h o w e d n od i f f e r e n c e s c o n c l u s i o n t h er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h es t a n d a r dl a d d e ro fd 2 0 s 1 6 1a n dd 8 s 3 8 4l o c i g e n e r a t e dw i t ht h i sm e t h o da r ee x c e l l e n t k e yw o r d st h es t a n d a r da l l e l i cl a d d e r ： s h o r tt a n d e mr e p e a t s ； p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ；d 2 0 s 1 6 1l o c u s ；d 8 s 3 8 4l o c u s ； g e n e t i c p o l y m o r p h i s m 1 2 引言 生命科学发生巨变，缘起于2 0 世纪初。由于数学、物理、化学 广泛深刻地渗入，给现代生物科学奠定了基础；孟德尔( m e n d e l ) 遗传 学说和摩尔根( m o r g a n ) 染色体基因学说先后创立，特别在1 9 5 3 年沃 森( w a t s o n ) 和克里克( c r i c k ) 发现了d n a 分子双蠓旋结构后，从7 0 年 代开始，分子生物学逐步形成，生命科学面目为之一新。到了2 0 世 纪后2 0 年，前沿的分子生物学和基础的生物化学出现了惊人的进展， 并扩及到整个生命科学，它不仅引起了学术界的极大关注，而且很大 地影响了人类的生活，生命科学遂成了自然科学领域的带头学科。法 医学是一门应用性和实践性很强的学科，将生命科学技术的有关知识 和进展用于法医学，为提高侦查破案率和证据的采信度有着重要的意 义。本课题旨在以下几个方面探讨生命科学技术在法医学中的应用。 首先，生物学中的昆虫是动物界中数量最多的类群，迄今为止已 定名的种类就有1 0 0 万种以上，占世界已知动物的三分之二。昆虫与 人类有着密切关系，作为构成生态系统食物链中的重要成员，千百年 来，人们一直在想方设法了解各种昆虫，以期达到有效控制其危害和 充分利用其资源的目的。在这漫长的过程中，随着对昆虫知识的不断 积累，一门学科法医昆虫学也逐步发展起来。 昆虫在法医学中的应用，最早的记载见于中国宋代的洗冤集 录，而近代法医昆虫学的兴起，却始于西方国家。诸多国外学者 研究表明，陆地、水中及海洋中的昆虫均可应用于法医学实践，因 为自然界中的昆虫自身的大部分的生命历程是利用尸体组织来完 成的，在一定的地理范围内的昆虫种类有其相对的稳定性和特异 性，尸体上的昆虫种类的组成与尸体分解程度和尸体地点相互影 响，随着季节的变化，昆虫的种类也会变化，昆虫的活动从春季开 始到秋季结束，其从过度期到停滞期要受温度、光照时间、本身对 地理的依赖性和其种族的特异性的影响，动植物生命周期的调节受 到了物种特异性热量参数的影响，自然界中昆虫的角质上皮能长期 保存：基于以上几个方面特点，法医学家可以据此对死亡时间 p m i ( p o s t m o r t e mi n t e r v a l ，简称p m d 、死亡原因及死亡地点进行推 断。 第二，d n a 是1 8 6 9 年由f r i d r i e hm i e s h e r 首先发现的。从理论上 讲，机体死亡以后，组织细胞内的d n a 随之降解，其含量应下降，随 着p m i 的延长，d n a 降解的速度要发生变化，因此根据d n a 降解速度 可以推断p m i 。二十世纪末，有人开始对d n a 降解进行研究，发现机 体在死后组织细胞d n a 含量随p m i 的延长而逐渐下降。随着d n a 组织 化学显示方法的建立，d n a 含量检测方法及d n a 降解与死亡时间关系 又将成为热门的研究方向。 第三，采用聚合酶链反应技术( p c r ) 扩增s t r 基因座产生的d n a 纹印对于法医个人识别和亲子鉴定具有更高的灵敏度。因此，s t r 基 因座的p c r 分型是国内外法医个人识别和亲子鉴定最主要的技术。欧 盟法医d n a 分型标准化委员会认为，虽然新技术与新遗传标记不断 涌现，今后相当长时期内，s t r 将仍然是最主要的常染色体遗传标记。 目前，国外大多数实验室和国内条件较好的单位都采用了商品化试剂 与仪器进行s t r 分型。商品化试剂有较好的质量保证体系和标准化操 作规程，容易推广应用。但是，其制各技术保密，价格昂贵，在中国 的全面推广应用存在困难；另一方面，外国公司不能提供一些在中国 群体中识别机率和非父排除概率高的s t r 基因座的分型标准物；因此 s t r 分型试剂国产化闯题也成为国内研究的热门课题，而法医遗传学 作为- - i 新兴学科也随之出现。 总的看来，进入2 1 世纪，从生物学、分子生物学到生命科学， 特别是生命科学自身的变革和突破，使人类越来越接近于了解生命的 本质。同时，生命科学仍将继续作为自然科学的领头学科，与其他学 科间相互作用、相互渗透，使自然科学出现一个崭新的、繁荣的局面。 法医学与生物学、分子生物学和生命科学存在有紧密的联系。当 今社会正处于转型时期，犯罪态势依然居高不下，由于犯罪分子狡猾、 高科技犯罪、人口流动量大等原因，采用过去那些老一套摸底排查等 手法来侦破刑事案件、打击犯罪已经落伍了。法医学作为应用基础学 科急需引入现代科学技术特别是生命科学技术。本人将从3 个方面引 入生命科学技术到法医学中进行应用研究。 插图及附表清单 图1 丝光绿蝇 图2 蝇蛆的长短 图3 蛹 图4 灰度与时间关系回归拟合图 图5 面积与时间关系回归拟合图 图6 d 2 0 s 1 6 1 基因座等位基因分型标准物电泳分型结果 图7 d 8 s 3 8 4 基因座等位基因分型标准物电泳分型结果 表1 动物尸体种类、所处环境、实验开始月份及实验持续时间表4 表2 成都地区室内高度腐败尸体现场嗜尸性苍蝇生长发育规律 8 表3d 2 0 s 1 6 1 等位基因基于分子量标准物和测序命名的差异 5 6 5 6 6 船 盯 鹃 第一章 成都地区嗜尸性苍蝇数据库建设、尸体生物学分解及其与死亡时间的 关系 1 前言 昆虫在法医学中的应用，最早的记载见于中国宋代的洗冤集 录，而近代法医昆虫学的兴起，却始于西方国家。诸多国外学者研 究表明，陆地、水中及海洋中的昆虫均可应用于法医学实践，如对死 亡时间p m i ( p o s t m o r t e mi n t e r v a l ，简称p m i ) 、死亡原因及死亡地点的 推断。有人对金蝇发育速率进行了研究，认为在一定温度下金蝇的发 育速率是可以预测的，故可比较准确地进行死亡时间的推断。在腐 败早期( 即死后3 4 周内) 的时间推断，主要根据丽蝇和麻蝇等昆虫 在尸体上的繁殖及发育过程进行推断；而对于腐败晚期的尸体，则主 要根据尸体上昆虫群落结构及演替规律进行推断。 在法医学中应用昆虫学的科学依据有：1 自然界中的昆虫自身的 大部分的生命历程是利用尸体组织来完成的：2 在一定的地理范围内 的昆虫种类有其相对的稳定性和特异性；3 尸体上的昆虫种类的组成 与尸体分解程度和尸体地点相互影响；4 随着季节的变化，昆虫的种 类也会变化；5 昆虫的活动从春季开始到秋季结束，其从过度期到停 滞期要受温度、光照时间、本身对地理的依赖性和其种族的特异性的 影响；6 动植物生命周期的调节受到了物种特异性热量参数的影响： 7 自然界中昆虫的角质上皮能长期保存。 最近，国内外法医学家和昆虫学家包括英国的s m i t h ( 1 l 、比利时 的l e c l e r c q 、芬兰的n u o r t e v a 。、奥地利的r e i t e r “ 5 1 6 ”、比利 时的l e c l e r c q 伯1 ”、美国的r o d r i q u e z ( 1 0 , i i , 1 2 ) i 芬兰的n u o r t e v a ( 1 3 , 1 4 ) 、 日本的n i s h i d a “5 ，“3 、意大利的i n t r o n a ”、德国的b e n e c k e “8 ”1 等 都对昆虫学做了进一步的研究；虽然法医昆虫学作为应用昆虫学的一 个独立分支，很有希望成为能解决死亡时间推断问题的- - f 学科；目 前还存在以下几个方面的问题或争议： 1 在法医学实践中，作为与尸体关系最为密切的昆虫即嗜尸性苍 蝇，种类繁多，其生长发育受环境影响而变化，需要专家参与，普及 推广应用困难； 2 依据体重、体长或活体培养来推断死亡时间，何种效果好； 3 研究表明，不同地区内昆虫种类不同，甚至在同一地区，室内 与室外嗜尸性昆虫也不完全一样。，因此，查明各地区嗜尸昆虫的种 类在法医学领域有重要作用。”；我国幅员辽阔，不同地域环境差异 甚大；目前我国各地区嗜尸性苍蝇研究基础数据不全； 4 如何应用尸体生物学分解规律来推断死亡时间”1 2 8 17 本研究旨在通过对成都地区嗜尸性苍蝇种类、季节活动规律、尸 体生物学分解进行研究，探讨以下几个方面的问题： 1 探讨成都地区嗜尸性苍蝇种类、季节活动规律及其与死亡时问 的关系，初步建立成都地区常见嗜尸性苍蝇种类及其生长发育规律数 据库； 2 探讨成都地区尸体生物学分解规律与死亡时间的关系； 3 探讨依据嗜尸性苍蝇体长及蝇壳来推断死亡时间的效果； 4 探讨影响嗜尸性苍蝇生长发育的主要因素： 5 探讨嗜尸性苍蝇样本采集方法。 2 材料和方法： 2 1 材料 2 1 1 标本 5 6 只大型动物狗； 5 6 只中型动物兔； 1 3 例室内高度腐败尸体及从现场采集的嗜尸性苍蝇、蛆及蝇壳样本； 以上动物均由四j | i 大学华西实验动物中心提供。 2 1 2 主要实验环境、试剂及设备 城区室内、城区室外、油菜田、河边、山坡、恒温箱等7 种实验环境： 乙基乙二醇： 恒温孵箱； 电子温度计； s o n y 数码相机； o l y m p u s 生物显微镜。 2 2 方法 2 2 1 将5 6 只大型动物和5 6 只中型动物分为5 6 组，每组各一只大 型动物和中型动物，每次处死各一只。 2 2 2 这些尸体被放置在5 种不同的环境中，主要是城区室内、城区 室外、油菜田、河边、山坡；其中7 2 具被放置在地面上，2 4 具被放 置在床上，1 2 具被悬挂在离地面1 m 的地方，2 具被放置在恒温室内， 2 具被分别埋在不同深度的泥地里( 见表1 ) 。 表1 动物尸体种类、所处环境、实验开始的月份以及实验持续时间表 所处环境 尸体种类每年实验开始的月份实验持续的时间( 天) 狗兔 3456 7 891 0 1 1 1 02 03 04 04 0 以上 城区室内 1 21 22 44 4 2222261 2420 城区室外 1 21 224442222261 2420 油菜田 1 21 224442222261 2420 河边 1 21 2244422 2 2261 2420 山坡 66l222lll1l26220 恒温室 111lll 地下1l1l2 2 2 3 每天两次对狗、兔尸体上及相关位置出现的苍蝇成虫、幼虫和 卵进行观察采集，直至尸体白骨化后，以相同方法进入下一组实验。 连续观察2 年。 2 2 4 从1 3 例室内高度腐败尸体的现场提取嗜尸性苍蝇、蛆及蝇壳 样本；记录现场环境数据。 2 2 5 排卵的蝇可放置在常规化学试管内，有几类蝇可放置在同一试 管内，并在管内塞上棉花或羊毛；幼虫与成虫应分别放置，并标明其 收集的日期，应单独放在一个含有养分或有湿土的阔口瓶内，避免它 们过早变干；幼虫保存在7 0 0 的乙基乙二醇中。 2 3 观察记录尸体腐败分解情况。 2 4 昆虫种类鉴定：将采集到的昆虫标本进行分类鉴定。 3 结果 3 1 嗜尸性苍蝇种类、季节活动规律 3 1 1 第一年( 2 0 0 1 年) 3 1 i1 1 嗜尸性苍蝇与季节的关系 自4 月底至1 0 月中旬，每具尸体上均发现丝光绿蝇、大头金蝇、 赭尾麻蝇、舍蝇。1 0 月中旬以后，则只可见到丝光绿蝇、大头金蝇、 赭尾麻蝇。1 1 月中下旬以后乃至暖冬季节，仍可见到少量丝光绿蝇。 3 1 1 2 各嗜尸性苍蝇侵袭尸体的时间 舍蝇多出现于死亡2 天以上的尸体，而丝光绿蝇( 图1 ) 、大头金 蝇、赭尾麻蝇于动物死后7 9 小时即在尸体上出现，这三种蝇类昆 虫在出现于尸体上的时间顺序上无规律性。5 9 月成蝇在死后1 3 天内数量最多，以后渐少。 ( 图1 ：丝光绿蝇) f i g u r e ll u c i l i as e r i c a t a 3 1 1 3 嗜尸性苍蝇成虫与幼虫的时间关系 5 9 月，幼虫在死后2 4 小时即可见到，死亡2 天后，幼虫数量 最多( 图2 ) ，此后渐少。死后4 7 天即可在尸体及其周围观察到蛹 ( 图3 ) 。9 月以后，幼虫在死后3 天才开始出现，死后4 7 天幼虫 数量最多。在各组尸体上均未采集到赭尾麻蝇幼虫。 ( 图2 ：蝇蛆的长短) f i g u r e 2t h el e n g t ho fm a g g o t ( 图3 ；蛹) f i g u r e 3l u c i l i as e r i c a t a sp u p a 3 1 1 - 4 嗜尸性苍蝇与天气变化的关系 雨天，嗜尸性苍蝇少见；气温降低时，各种嗜尸性苍蝇活动减少。 3 1 2 第二年( 2 0 0 2 年) 6 3 1 2 1 嗜尸性苍蝇与季节的关系 自3 9 月，每具尸体上均发现丝光绿蝇、大头金蝇、赭尾麻蝇； 3 月至4 月底，尸体上另可见巨阿尾丽蝇；舍蝇出现于4 月中旬至9 月中旬。暖冬季节，可见到少量丝光绿蝇。 3 1 2 2 各嗜尸性苍蝇侵袭尸体的时间 丝光绿蝇、大头金蝇、赭尾麻蝇于动物死后7 9 小时即在尸体 上出现，这三种蝇类昆虫在出现于尸体上的时间顺序上无规律性。巨 阿尾丽蝇多见于死亡时间为l 天以上的尸体；而舍蝇多出现于死后两 天以上的尸体。成蝇在死后1 3 天内数量最多，以后渐少。 3 1 2 3 嗜尸性苍蝇成虫与幼虫的时间关系 3 5 月，幼虫于动物死亡4 8 9 6 小时以后才可见到，死亡3 5 天后，幼虫数量最多，此后渐少。5 9 月，则可在死亡2 4 小时的 尸体上见到嗜尸性苍蝇的幼虫。死后4 7 天即可在尸体及其周围观 察到蛹。在多数尸体上未采集到赭尾麻蝇幼虫，各组尸体上均未采集 到巨阿尾丽蝇幼虫。 3 1 2 4 嗜尸性苍蝇与天气变化的关系 雨天，嗜尸性苍蝇少见；气温降低时，各种嗜尸性苍蝇活动减少。 3 2 室内高度腐败尸体现场嗜尸性苍蝇生长发育规律 表2 成都地区室内高度腐败尸体现场嗜尸性苍蝇生长发育规律 编号衣着温度湿度 蛆长蝇壳推断实际 ( )( )( 锄) ( 天)( 天) 3 3 尸体的生物学分解 实验研究发现，成都地区动物尸体分解可分为5 个阶段，而且每 个阶段都与尸体组织分解程度相对应。 第一阶段：细菌引起的早期分解，该阶段从蝇产卵持续到孵出幼 虫，从5 月到9 月该阶段的平均持续时间是1 5 天( 0 5 3 天) 。 第二阶段：昆虫造成尸体分解的活跃期。该阶段从孵出幼虫并同 时伴有细菌引起的分解持续到幼虫期的结束。在此阶段中，尸体组织 大部分被破坏，从5 月到9 月该阶段的平均持续时间是4 天( 2 7 天) 。 第三阶段：昆虫造成尸体分解的进展期。该阶段从幼虫化蛹持续 到成虫幼虫出现。在此阶段，残余的软组织几乎被破坏殆尽。同时细 菌引起的分解会继续并伴有菌类的活动。该阶段的持续时间从4 天到 i 0 0 天不等。 第四阶段：细菌引起尸体分解时期。该阶段从成虫幼虫离开尸体 残骸持续到骨架分解为单独的骨骼。该阶段的持续时间从1 4 天到2 0 0 天不等。 第五阶段：在长达2 年的观察中，骨组织并未完全分解。 4 讨论 4 1 嗜尸性苍蝇种类、季节活动规律 p m i 推断一直是法医学研究的重要课题，迄今尚未完全解决。传 统用于推测p m i 的根据，是基于尸体现象的发生及其演变，诸如尸冷、 尸斑、尸僵等的发生和发展进行推测。但由于这些尸体现象受许多因 素干扰，且无量化指标，并在较大程度上受观测时主观因素的影响。 因此，无法确切推断死亡经过时间。 现阶段法医昆虫学的发展主要致力于蝇科生物学的研究。其原因 在于蝇科是第一个进入尸体的，且此过程发生快速。所以蝇科的组成 与尸体分解程度和分解过程形式的变化相对应。在尸体上，蝇科在数 量上占据统治地位，并且破坏了大部分组织。诸多国外学者研究表明， 陆地、水中及海洋中的昆虫均可应用于法医学实践。6 。3 7 3 “，不同地区 昆虫种类不完全一样，如果在某地尸体上出现了该地不曾有的昆虫种 类，则该尸体应系外地转移而来“1 ，故有助于法医学实践的案情分析。 因此，对一个地区内常见的嗜尸昆虫及其变化规律进行研究是十分必 要的。 本研究结果发现，成都地区常见的嗜尸昆虫有丝光绿蝇、大头 金蝇、赭尾麻蝇、舍蝇及巨阿尾丽蝇。其中丝光绿蝇、大头金蝇，赭 尾麻蝇常于死后7 9 小时就可在尸体上见到，这三种昆虫在到达尸 体的时间顺序上无规律性；巨阿尾丽蝇，多出现于3 、4 月份死亡时 间为1 天以上的尸体，而舍蝇则出现于4 月中旬至1 0 月初死后2 天 以上的尸体，1 0 月中下旬乃至暖冬季节仍可见到嗜尸性苍蝇。根据 阿尾丽蝇或舍蝇侵袭尸体的规律，也有助于早期死亡时间的推断。3 5 月，幼虫在死后4 8 9 6 小时后才可见到，死亡3 5 天后，幼虫 数量最多，此后渐少。死后4 7 天即可在动物尸体及其周围观察到 蛹；5 9 月，死亡2 4 小时的尸体上则可见到苍蝇幼虫的存在，3 4 天数量最多，而9 月以后，幼虫在死后3 天才开始出现，死后4 7 天幼虫数量最多。尸体白骨化，所有蝇类昆虫均消失。因此，应根据 各种昆虫不同季节和不同环境下的生活周期、发育状况及各种嗜尸性 苍蝇的演替情况，对死亡时间进行大致推断，至于这些昆虫的生命周 期及生长发育速率，尚需进一步研究。 g o f f n “1 的研究表明，无论室内还是室外，嗜尸昆虫中丽蝇科类 昆虫常先侵入尸体，其次是麻蝇科类昆虫：室内，死亡6 7 天，尸 体上昆虫种类最多，而室外则在死亡8 1 0 天的尸体上，昆虫种类最 多。而本研究采用狗、兔作为实验对象，由于兔体重较小，环境温度 较高时，6 7 天则已白骨化，故死后3 5 天的兔尸嗜尸昆虫最多， 与g o f f 的研究有较大出入。t o m b e r “”等研究表明即使在冬天，尸体 上仍可见到嗜尸性苍蝇。本实验发现，成都地区，1 1 月中下旬以后 乃至暖冬季节，亦可见到少量嗜尸性苍蝇。 本实验中，多数尸体上未采集到赭尾麻蝇幼虫，各实验组尸体 上均未采集到巨阿尾丽蝇幼虫，这可能与赭尾麻蝇幼虫及巨阿尾丽蝇 幼虫在尸体上的数目相对较少所致。就麻蝇科而言，其繁殖是直接产 幼虫而非产卵，而幼虫在母体内停留时间相对较长，故每只母蝇繁殖 的后代较丽蝇科类昆虫少得多。此外，我们观察到，昆虫的出现及其 生长发育速率与环境温度、湿度、天气变化有关。其中温度与天气变 化影响最大，如连续下雨，可以阻止或延缓这些昆虫的入侵，与 m a n n “2 1 等的研究基本一致。因此，在利用昆虫进行死亡时间推断时， 应充分考虑到这些因素。 国外某些地区已建立起常见嗜尸昆虫及其生长发育方面的数据 库，譬如，在夏威夷群岛上，可根据嗜尸性苍蝇如金蝇、麻蝇活动规 律等比较准确地推断死亡时间 3 9 o 而国内这方面研究甚少，成都地 区己初步建立常见嗜尸性苍蝇种类及其生长发育规律数据库，建立嗜 尸性苍蝇种类及其生长发育规律数据库将成为我国法医学家和昆虫 学家努力的方向。 4 2 尸体的生物学分解 在成都地区，不是埋葬的尸体组织的分解包括两个方面：一是动 物的破坏，二是生物学分解( 涉及微生物、菌类及昆虫) 。几乎在所 有的尸体中，微生物及昆虫都参与了分解过程。 本实验表明，成都地区尸体分解可分为5 个阶段，而且每个阶段 都与尸体组织分解程度相对应。毫无疑问，气象因素会影响尸体的生 物分解，但是该问题至今还没有被专门研究过。 尸体白骨化的平均时间因尸体分解开始月份不同而从4 天到2 0 0 天不等。在同一年的5 月到9 月，6 5 的尸体白骨化出现的时间是一 样的。由于在相同的条件下，尸体分解持续时间也会有很大的变化， 从而不可能用尸体分解持续时间的平均值