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上海交通大学 博士后学位论文 基因治疗用腺病毒载体的研究 姓名：王慧萍 申请学位级别：博士后 专业：肿瘤分子生物学 指导教师：黄倩 20060920 【| 海交通大学博士后站t 作报告 y 基因治疗用腺病毒栽体的耐f 究 第一部分腺病毒外壳纤维改造技术平台的建立 中文摘要 【研究背景】：腺病毒载体具有较高的感染效率，一直在基因治疗中扮演重 要角色，是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。截止2 0 0 6 年1 月，全球已实施的11 4 5 项基因治疗临床试验方案中，使用腺病毒作为载体 的有2 8 7 项，占2 5 ，已超过了逆转录病毒载体( 2 7 6 项，占2 4 ) ，其中选用 最多的是2 型和5 型腺病毒载体。然而腺病毒载体介导基因转导仍面临两大难题： 一是对某些细胞的转染效率较低。由于某些靶细胞表面与腺病毒特异结合的受体 表达不足或缺乏，导致腺病毒载体不能将目的基因有效地导入这些细胞( 例如： 肿瘤细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、 外周血细胞、造血干细胞、树突状细胞 等) ；二是缺乏靶向性。由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感 染其他正常组织，体内应用时存在明始的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝 脏内聚集，产生毒副作用。所以迫切需要改变其天然嗜性，构建针对特定组织、 细胞的靶向性腺病毒。 【目的】：本研究的目的是建立一种方便、快捷的腺病毒外壳纤维改造的技术平 台。 【方法】：在对腺病毒基因组顺序进行分析的基础上，我们采用多步亚克隆方法， 先用限制性内切酶逐步消化并分离含腺病毒f i b e r 基因的d n a 片段，采用 q u i k c h a n g e 。s i t ed i r e c t e dm u t a g e n e s i sk j t ( s t r a t a g e n e ) 试剂盒，通过定点 诱变的方法在f i b e r 头部h i l o o p 区插入单一限制性内切酶s w al 识别位点；再 逆向将改造后的d n a 片段逐层放同腺病毒的基因组中。具体如r ：首先从腺病毒 a d 5 的骨架质粒p b h g l o x 一e 1 ，e 3 c r e 的c l a l 和p a c i 问切出一6 6 k b 片段，此 片段包含了腺病毒a d 5 完整的f i b e r 基因，将其插入到p c e p 4 的c 1 a i 和p a c i 卜海交通大学博上后出站工作报告基圳治疗川腺病毒载体的研究 之间，产生质粒p c e p 47 6 6 k bf i b e r 。然后质粒p c e p 4 一6 6 k bf i b e r 经k p n i 酶切，得到一约2 8 k b 片段，此片段含有腺病毒a d 5 完整的f i b e r 基因，将其 插入到p c i 的k p n i 之间，产生质粒p c i 一2 8 k bf i b e r 。以p c i 一2 8 k bf i b e r 为 模板，采用定点诱变的方法在纤维圆头的h i l o o p 区插入单。s w a i 限制性内切 酶位点，产生质粒p c i 一2 8 k bm f i b e r 。最后逆上述步骤将突变的f i b e r 逐层放 回，产生质粒p c e p 4 一6 6 k bm f i b e r 和p b h o l o x x e l ，3 c r e s w a i 。将穿梭质 粒p d c 3 1 5 一e g f p 和改造后的腺病毒骨架质粒p b h o l o x a e l ，3e r e s w a i 共转染 2 9 3 包装细胞，通过在2 9 3 细胞内重组产生f i b e r 突变的腺病毒a d s w a i 。 【结果】：所有的构建均完成并经酶切鉴定及测序证实。a d s w a i ( 在纤维圆头 的i t il o o p 区插入了单一s w a i 限制性内切酶位点) 已在2 9 3 细胞内包装成功并 经p c r 检测证实。 【结论】：成功建立了- i o 方便、快捷的腺病毒外壳纤维改造的技术平台，只需 一步简单的体外连接和转化即可完成腺病毒外壳纤维的改造。 【关键词】腺病毒：靶向性腺病毒；基因治疗 上海交通大学博上后出站工作报告 皋园治疗用腺病毒载体的研究 a b s t r a c t s e c t i o ni ：c o n s t r u c t i o no ft a r g e t i n ga d e n o v i r u sv e c t o r t e c h n i c a lf l a t 毋a c k g r o u n d 】：a d e n o v i r u s ( a d ) v e c t o r sh a v e b e e ne x p e c t e dt op l a ya p r o m i n e n t r o ei n g e n et h e r a p y b e c a u s eo ft h e i r e x t r e m e l yh i g h t r a n s d u e t i o ne f f i c i e n c y h o w e v e r ，t h e r ea r et w oh u r d l e sc o n f r o n t i n ga d v e c t o r m e d i a t e dg e n et r a n s f e r o n ei st h e i ri n e f f i c i e n tt r a n s d u c t i o nt o t a r g e tc e l l sl a c k i n gs u f f i c i e n te x p r e s s i o no ft h ec o x s a c k i e v i r u sa n d a d e n o v i r u sr e c e p t o r ( c a r ) a n o t h e ri st h e i rn o n s p e c i f i cd i s t r i b u t i o ni n t i s s u ea f t e r7 1 7 订v og e n et r a n s f e r t a r g e t e da ds h o u l db ec o n s t r u c t e di n o r d e rt om o d i f yv e c t o rt r o p i s m 【0 b j e c t i v e 】：t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yi st oe s t a b l i s hac o n v e n i e n ta n d r a p i dt e c h n i c a lf l a to fc o n s t r u c t i n gt a r g e t e da dv e c t o r m e t h o d s 】：t e c h n i c a lf l a t o ft a r g e t e da dv e c t o rw a sc o n s t r u c t e db y m u l t is t e pc l o n i n g a6 6 k bf r a g m e n te n c o d i n gf i b e rg e n eb e t w e e nc l a ia n d p a c lw a si s o l a t e d f r o mp b h g l o x e 1 ，3c r e ( a dg e n e m i cp l a s m i d ) ，t h e n i n s e r t e di n t op c e p 4 t og e n e r a t ep c e p 47 6 6 k bf i b e r a2 8 k bf r a g m e n t w i t hf i b e rg e n eb e t w e e nk p n lw a si s o l a t e df r o mp c e p 47 6 6 k bf i b e ra n d i n s e r t e di n t o p c i t o g e n e r a t ep c i 一2 8 k b f i b e r w h i c hw a su s e df o r m u t a g e n e s i s as i n g l es w a ir e s t r ic t i o ne n d o n u c l e a s ec u t t i n gs i t ew a s i n s e r t e di n t oh i 一1 0 0 po ff i b e rk n o bb ys i t ed i r e c t e dm u t a t i o nt og e n e r a t e p c i 一2 8 k bm f i b e r f i n a l l y t h em u l a n t r ib e tw a sr e t u r n e d b a c kt ot h e p l a s m i d sw h i c hc o m ef r o mt og e n e r a t ep c e p 4 7 6 6 k bm f i b e ra n dp b h g lo x e 1 ，3 c r es w a i s h u t t l ep 】a s midp d c 3 l5 - e g f pa n dp b h g l o x e 1 ，3e r e s w a i 4 上街交通人学博士后站t 作报告 基罔治疗用腺病毒载体的研究 w e r ec o t r a n s f e c t e di n t oe 1 一c o m p l e m e n t i n g2 9 3c e l l st op r o d u c e f i b e r m u t a n ta d ( a d e n o v i r u s s w a i ) b yr e c o m b i n a t i o ni n2 9 3c e l l r e s u l t s 】：a 1 lc o n s t r u c t i o nh a v eb e e nc o m p l e t e da n dc o n f o r m e db yd i g e s t e d w i t he n d o n u c l e a s ea n ds e q u e n c ed e t e c t i o n a d e n o v i r u s s w a i ( as i n g l es w a l r e s t r i c t i o ne n d o n u e l e a s ec u t t i n gs i t eh a sb e e ni n s e r t e di n t oh i l o o po f f i b e rk n o b ) h a sb e e np r o p a g a t e di n e 1c o m p l e m e n t i n g2 9 3 c e l l sa n d c o nf o r m e db yp c rd e t e c ti o n c o n c l u s i o n s 】：w eh a v eb e e ne s t a b l i s h e dac o n v e n i e n ta n dr a p i dt e c h n i c a l f l a to fc o n s t r u c t i n gt a r g e t e da dv e c t o rs u c c e s s f u l l y w ec a nr a p i d l y c o n s t r u c tat a r g e t e da d e n o v i r u sv e c t o rt h r o u g hi n s e r t e da1 i g a n di n t os w a i r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ec u t t i n gs i t ei nh i l o o po ff i b e rk n o bb yo n es t e p s i m p l y k e y w o r d s a d e n o v i r u s ；t a r g e t e da d e n o v i r u s ：g e n et h e r a p y 上海交通人学博上后出站工作报告毕斟治疗用腺病毒载体的研究 h u 舌 恶性肿瘤是危害人类健康的最主要的疾病。传统的手术、化疗和放疗等方法 目前仍然无法明显改善人们对这类疾病相对无奈的局面。基因治疗经过十几年的 发展，作为一种新的治疗肿瘤的手段越来越受到人们的关注，截止2 0 0 6 年1 月， 全球已实施的1 1 4 5 项基因治疗临床试验方案中，用于肿瘤治疗的有7 6 2 项，占 6 6 6 。 肿瘤基因治疗成功与否极大程度上取决于治疗基因能否被有效传递到肿 瘤组织，即基因传递载体的肿瘤靶向性。腺病毒( a d e n o v i r u s ，a d ) 是目前基因治 疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。在已实施的基因治疗临床试验方 案中，使用腺病毒作为载体的有2 8 7 项，占2 5 ，己超过了逆转录病毒载体( 2 7 6 项，占2 4 ) ，是最常使用的病毒载体。2 0 0 4 年1 月及2 0 0 5 年1 0 月我国s f d a 在国际上率先批准了二个以腺病毒作为载体的治疗恶性肿瘤的i 类新药。 腺病毒载体用于基因治疗有许多优点：如可插入较大的外源基因片断 ( 8 5 k b ) 、容易制备且病毒滴度较高、宿主范围广、可介导外源基因短时高水平 表达、基因转移效率不受细胞增殖状态影响、其基因组通常不会整合入宿主细胞 染色体，故不易发生插入突变，较安全等。但腺病毒载体在应用特别是体内应用 时仍存在一些问题，主要集中在两方面：一是对某些细胞的转染效率较低。由于 某些靶细胞表面与腺病毒特异结合的受体表达不足或缺乏，导致腺病毒载体不能 将目的基因有效地导入这些细胞( 例如：肿瘤细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、外 周血细胞、造血干细胞、树突状细胞等) ；二是缺乏靶向性。由于腺病毒的宿主 范围较广，在感染靶组织的同时也感染其他f 常组织，体内应用时存在明显的组 织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生毒副作用。以上问题随着腺 病毒在临床实践中的应用而几见突出，因此，临床应用时大都直接或通过介入方 式将腺病毒注射到肿瘤内。然而，我们和其他研究者的观察表明，即使是肿瘤内 给药，大量的腺病毒仍然会_ 7 | f f 漏到循环血液巾，产生非特异性分布。这一问题已 海变通大学博上后出站工作报告 基冈治疗用腺病毒载体的研究 成为制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈，迫切需要提高腺病毒载 体的靶向性。 腺病毒载体的靶向性改造是近几年来基因治疗研究较活跃的领域之一也是 一个有相当难度的课题，主要技术难度在于改造步骤繁琐，耗时耗力。 本课题拟在真核细胞( 2 9 3 细胞) 内同源重组( a d m a x 系统) 基础上建立一 种方便、快捷的腺病毒外壳纤维改造的技术平台，只需一步简单的体外连接和转 化即可完成腺病毒外壳纤维的改造。 上海交通大学博十后 站t 作报告 基阏治疗用腺病毒载体的研究 材料 一质粒载体 1 1 p d c 3 1 5 1 2 p b h g l o xae 1 ，3 c r e 1 3 p c i 1 4 p c e p 4 1 5 p e g f p n 1 二细胞株 材料和方法 m i c r o b i x 公司 m i c r o b i x 公司 i n v i t r o g e n 公司 i n v i t r o g e n 公司 c l o n t e c h 公司 2 1 腺病毒包装细胞a d 一2 9 3 购自s t r a t a g e n 公司 三、主要仪器设备 3 i p c r 扩增仪：p t c 一1 5 0 ，p t c 一2 0 0 ( m jr e s e a r c h 公司) 3 2 e p p e n d o r fc e n t r i f u g e 5 4 1 7 c 型离心机：e p p e n d o r f 公司 3 3 e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 8 1 0 r 型、5 4 1 5 r 型低温离心机：e p p e n d o r f 公司 3 4 凝胶成像与分析系统：p h a r m a c i ab i o t e c h 公司 3 5 电泳仪：b i o r a d 公司 3 6 紫外分光光度仪( u t r o s p e c 3 0 0 0 ) ：p h a r m a c i ab i o t e c h 公司 3 7 h z c 型台式恒温振荡器：江苏太仓科教器材厂 3 8 d i i p9 0 5 2 型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司 ：j 9 z h w y i o o a 型摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司 3 1 0 微量加样器：g i s o r l 公司 8 f 一海交通大学博士后“；站t 作报告 基凼治疗用腺病毒载体的研究 3 11 c o 。培养箱：s a n y o 公司 3 1 2 a x i o v e r ts 1 0 0 倒置荧光显微镜：购自z e i s s 公司 3 1 3 超低温冰箱：s a n y o 公司 四材料及试剂盒 4 1 大肠杆菌d h 5d 为本实验室保存 4 2 d l 2 0 0 0 ，d l l 5 0 0 0 ，1 k bl a d d e r 购自t a k a r a 公司 4 3 p c r 产物纯化试剂盒( 华舜公司) 4 4 限制性内切酶( b i o l a b s 公司及t a k a r a 公司) 4 5 凝胶回收纯化试剂盒( q i a g e n 公司) 4 6 质粒抽提试剂盒( i n v i t r o g e n 公司，q i a g e n 公司) 4 7 1 i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染试剂盒为i n v i t r o g e n 公司产品 4 8 高保真p f u 酶购自s t r a t a g e n e 公司 4 9 胎牛血清及o p t i m e m 无血清培养基为购白i n v i t r o g e n 公司 4 1 0 新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司 4 1 1 q u i k c h a n g e s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s sk jt ( s t r a t a g e n e ) 五实验试剂 5 1 l b 液体培养基： t r y p t o n e 1 0 0g b a c t oy e a s te x t r a c t5 0 g n a c l1 0 0g 加d d h ：0 定容至1 0 0 0 l 灭菌条件为1 2 1 ，高压湿热灭菌2 0m i n 。 5 2 0 7 、i 5 琼脂糖电泳胶：琼脂糖0 7 9 、1 5 9 分别溶于1 t a e i o o m l ， 微波炉加热完全溶解，室温冷却至5 0 。c 左右，加入l o m g m le b5ul ( 浓 上海交通大学博上后出站工作报告基因治疗用腺病毒载体的研究 度：o 5ug u 1 ) ，搅匀灌胶。 5 3 1 0 m g m le b 的配制：戴手套秤取e b 2 0 0 m g ，入棕色试剂瓶，加d d l l 2 0 溶解， 配成2 0 m l 溶液，保存备用。 5 4 d m e m 培养基：( 购自g i b c o 公司) d m e m 干粉1 袋，加入i t e p e s 6 9 ，青霉素 0 1 2 9 ，链霉素0 2 9 ，加双蒸水至1 0 0 0 m l ，以n a h c 0 3 调p h 值为7 4 ，0 2 2 um 微孔滤膜过滤除菌，分装后，一2 0 冰冻保存。 5 5 新生牛血清：( 购自杭州四季青生物有限公司) 5 6 。c 水浴灭活3 0 分钟， 4 冰箱保存。 六、计算机分析软件 6 1 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n b l a s t 6 2 核酸及蛋白质序列分析软件： v e c t o rn t i 软件包，c h r o m a s d n a s t a r 软件包 6 3 图象处理软件 p h o t o s h o p7 0 和s n a g i t8 0 a x i o v i s i o n 图像分析软件 6 4 引物设计软件： p r i m e rp r e m i e r5 0 6 5 凝胶电泳成像系统 g e n e g e n i u s b a n d s c a n 上海交通人学博士后站t 作报告基困治疗用腺病毒载体的研究 实验方法 一腺病毒载体外壳纤维编码基因的改造 1 1 构建质粒p c e p 4 - - d c i ai 将p c e p 4 用c l ai 切开，p f u 酶补齐，然后再连接，破坏p c e p 4 在5 5 2 3 b p 处 的c l ai 内切酶位点，产生质粒p c e p 4 - - d c l ai ，酶切鉴定。 1 2 构建质粒p c e p 4 7 p c e p 4 - - d c l ai 用k p n i b a m hi 双酶切，插入带有57 一k p n p a ci n o ti c l a l i b a m h l - 37 内切酶位点的寡核苷酸，从而将p a c i 、c l a i 两个单一限制性 内切酶位点引入其多克隆位点处，产生质粒p c e p 4 ，酶切鉴定。 1 3 构建质粒p c e p 47 6 6 k bf i b e r 腺病毒a d 5 的骨架质粒p b h g l o x a e l ，e 3 c r e 经c l a i 和p a ci 双酶切，得到 约6 6 k b 和2 7 4 k b 两个片段，其中6 6 k b 片段包含了腺病毒a d 5 完整的f i b e r 基因，回收此片段并将其插入到p c e p 4 的c l a i 和p a ci 之间，产生质粒p c e p 4 7 6 6 k bf i b e r ，酶切鉴定。 1 4 构建质粒p c i 一2 8 k bf i b e r 质粒p c e p 4 一6 6 k bf i b e r 经k p n l 酶切，得到约2 8 k b 和1 4 2 k b 两个片 段，其中2 8 k b 片段包含了腺病毒a d 5 完整的f i b e r 基因，回收此片段并将其插 入到p c i 的k p n l 之间，产生质粒p c i 一2 8 k bf i b e r ，酶切鉴定。 1 5 构建质粒p c i - 2 8 k bm f i b e r 通过定点诱变方法在f i b e rh 1 一l o o p 区插入s w al 识别位点，产生质粒 p c i2 8 k bm f i b e r 酶切鉴定+ 测序。 1 6 构建质粒p c e p 4 一6 6 k bm f i b e r ( h if o o d 区捅入s w ai 识别位点) 将质粒p c l 一2 8 k bm f i b e rk p n l 间2 8 k bm f i b e t 片段放回到质粒p c e p 4 7 6 6 k bf i b e rk p n lf h j 置换其2 8 k bf i b e r 片段，得到质粒p c e p 4 6 6 k bm f ib e r ， 酶切鉴定。 上海交通大学博+ 后出站t 作报告茸吲治疗用腺病毒载体的研究 1 7 构建质粒p b h g l o x - a e l ，e 3 c r e s w ai ( h i l o o p 区插入s w at 识别位点) 将质粒p c e p 4 一6 6 k bm f i b e rp a c i c l a i 间6 6 k bm f i b e r 片段放回到质粒 p b h g l o x a e l ，e 3 c r ep a c i c l a i 问置换其6 6 k bf i b e r 片段，得到质粒p b h g l o x 一 e i ，e 3 c r e s w ai ，酶切鉴定+ 测序。 l _ 8 构建质粒p d c 3 1 5 一e g f p 将p d c 3 1 5 一b a m hi 切开一p f u 酶末端补齐一e c o ri 切开，p e g f p n 1 一n o ti 切开一p f u 酶末端补齐一e c o ri 切开，然后连接转化，得到质粒p d c 3 1 5 一e g f p ， 酶切鉴定+ 转入2 9 3 细胞一e g f p 表达。 二定点诱变 2 1 突变链的合成 2 1 1 合成两条互补的带有预先设计的突变位点的寡核苷酸引物。 p r i m e r1 57 一g g ta c ac a g g a aa c ag g a g a tt t a a a tg a ca c a a c t c c aa g tg c3 7 p r i m e r2 5 7g ca c tt g g a g t t g tg t ca t t t a aa t c t c ct g tt t cc t g t g ta c c 一3 7 ( 下画线为插入的s w a i 切点，位于f i b e r5 4 2 5 4 3 a a 处) 2 1 2 以p c i 一2 8 k b f i b e r 为模板，通过p c r 反应合成突变链。 p c r 反应体系： 试剂用量 1 0 b u r 上e r t e m p l a t e ( 1 0 n g u 1 ) p r i m e r 1 ( 1 3 6 n g 1 ) p r i m e r2 ( 1 3 4 n g 1 ) d n 1 pm i x d d h 。o 补充至总体积 5 0u 1 5 0l l l 1 0u l 1 0i j , 1 1 5u l 5 0 u l 2 上海交通大学博+ 后出站丁作报告接凼治疗用腺病毒载体的研究 s t e p l p l a s m i dp r e p ar a t i o n s t e p2 t e m p e r a t u r ec y c i i n g s t e p3 d i g e s t i o n s l e o4 h a n s f or m a l i o n u t a q e 一” j ”u ics t e dn | n s f ，、“ j c o l i t cn sn i c k e d c i 使l t l a rs t r a l l d 曲 g e n ei np1 0 s , h i dw i l t t ar g e ls i t e 国) f 。rm u 矧l 。r 1 d e n a t u , et h ep i a s m i da n da n n e a lt h e a l i a o n u c l e o t i d ep r i m e r s jc o n t a i n i n g t h ed e s i r e dm u t a f i o n ：) u s i n gt h en a n s t r a n d a i s pa c i n g a c to no fp f d b f b od n ap o l y m e r o s e e x t e n da n di n c or p o r a t et h e m u l a g e n i cp r i m e r sr e s u l t i n g l nn i c j ( o dc i r c u l a rs r a n d s d i g e s tt h em e h “a l e a n o n m u t a t e d p ar e n a id n at e m p l a t ew i 小d p nl n o i s f orr n ，h ec i r c u ar n l c k e dd s d n a i n t ox l l 一b l u es u d e r c o m o e f e n tc el s a f l e rt r a n s f o r m a t i o n ，t h ex l i b l u e s u p er c o m o e t e n tc e l l sr e p a i rt h e n i c k si nt h em u t a t e dp l a s m i d o v e r v i e wo ft h eq u i k c h e n g e 。st e - d i r e c t e dm u t a g e n e sj sm e t h o d 卜海交通大学博上后出站工作报告基困治疗用腺病毒载体的研究 p c r 扩增反应条件： 9 5 2m i n 8 2 3 0s e c 9 5 3 0s e c 5 5 lm i n 6 8 1 2a i n 6 8 1 0m i n 2 2 电泳鉴定扩增结果 取1 0 lp c r 产物通过0 9 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 2 3 d p n i 消化亲本链 取l o 1p c r 产物，加1 ld p n i ( 1 0 u h i ) ，3 7 。c 消化2 小时。 2 4 转化 取1 ld p n i 消化后的p c r 产物，与5 0 a lx l l 一b l u e 感受态菌混匀，冰浴 3 0 m i n 后置4 2 。c9 0 s ，冰浴冷却2 m i n ，然后加l m ll b ( 不含a a n p ) 培养液，3 7 振荡培养l 小时，取2 0 0 i i 涂布在含有1 0 0 u m 1a m p 的l b 琼脂平皿上，吸收 3 0 分钟后，3 7 倒置培养。 2 5 鉴定突变质粒 分别接种多个单一菌落转化子于2 m ll b 培养液( 含1 0 0 u m la m p ) e p ， 3 7 。c 振荡过夜。碱裂解法小量抽取质粒，琼脂糖电泳分析质粒大小，将初步检 验的阳性质粒酶切鉴定分析，送测序。 三重组腺病毒的包装 采用a d m a x 腺病毒系统包装腺病毒。该系统是由d r f r a n kg r a h a m 在1 9 9 9 年创建的一套重组腺病毒构建系统，基本原理足通过c r el o x p 或f l pf r t 重组 酶，使共转染到2 9 3 细胞中的腺病毒绒体穿梭质粒和辅助质粒( 腺病毒基因组质 粒) 在重组酶的作用下产生蕈组腺病毒，得到的重组病毒是e 1 e 3 缺失的复制缺 型腺病毒。 3 1 将早代的2 9 3 细胞铺6 孔培养板培养，接种2 1 0 5 每孔，第二天细胞生 叫 叭咖 皓 m 哪 p 8 。 一 上海交通大学博士后出站t 作报告 基冈治疗用腺病毒载体的研究 长汇合度达到6 0 - - 8 0 。 3 2 采用脂质体l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 将穿梭质粒p d c 3 1 5 一e g f p 与改造后的腺 病毒骨架质粒p b h g l o x ae 1 ，e 3 c r e s w a i 共转染入2 9 3 腺病毒包装细胞中，以 无血清培养培养4 h 后换为新鲜有血清培养基。 3 3 转染后第3 天观察细胞，添加新鲜培养基。 3 4 5 7 天后待细胞长满培养板时，胰酶将其消化并转移至1 0 c m 细胞培养 盘中，继续培养观察。 a d m a x 。| t i t g e l l m r a t i o nm + a d e n o v i r u s 、韫? t m 。i 精嚣i 黔 厶雠一。”“ ；j | i c 删cp i n , m i d l + 。 i i 二，v i 。| 1 1 ，圳 y 5 憎1 i 自棚甜m h i i “n - t 哪 _ 一 a e la m 3 5 继续培养4 5 天即可观察到病毒病变斑出现，再培养1 2 天使病变斑 扩大。 3 6 将病变细胞用吸管吹下后，1 0 0 0 9 离心5 m i n 收集细胞，将细胞上清转 移至另外的离心管一8 0 保存。 3 7 细胞沉淀用少量上清悬浮，于- - 8 0 。c 并t 3 7 。c 反复冻融3 次后，1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，上清即为初次收获得的病毒液。 ：海交通大学博e 。后站t 作报告基闭治疗用腺病毒载体的研究 四重组腺病毒的鉴定 取1 0 9 l 病毒液加等量病毒裂解液混匀，9 8 | 。c 煮l o 分钟释放病毒基因组d n a ， 取l g l 作模板，腺病毒a d 5 的骨架质粒p b h g l o x 一k e l ，e 3 c r e 作阴性对照，用 p e r 法鉴定a dm f i b e r ( s w a i ) 重组腺病毒。鉴定用引物如下： 上游弓l 物：5 一c a ca g gm ac a gg a g ! ! ! 里一3 下游引物：5 一t g tg g tg g tg g gg c ta t ac t 一3 序列才能扩增出片断。产物2 3 0 b p 。 9 4 3 0s c o + _ 1 5 0 。c 3 0s e e3 0c y c l e s 7 2 1m i n _ j 上海交通人学博士后m 站工作报告基i 封治疗用腺病毒载体的研究 结果 一质粒p c e p 4 的改造 p c e p 4 为一约1 0 4 k b 的较大质粒，我们对质粒p c e p 4 改造的目的是在其多 克隆位点处引入p a ci 、c l ai 两个单一限制性内切酶位点，为下一步克隆腺病毒 基因做准备。由于p c e p 4 在5 5 2 3 b p 处有一c l ai 内切酶位点，所以改造必须分 两步进行，克隆方案见图1 。 1 1 构建质粒p c e p 4 - - d c i ai 首先，将p c e p 4 用c l ai 切开，p f u 酶补齐，然后再连接，破坏p c e p 4 在 5 5 2 3 b p 处的c l ai 内切酶位点，产生质粒p c e p 4 - - d c l ai ，经c l a i 和h i n d l i i 双酶 切鉴定正确( 图2 、图3 ) 。质粒p c e p 4 - - d c l ai ，经c l a l 和h i n d l h 双酶切仅得 到一约1 0 k b 片段，而对照p c e p 4 却得到约5 k b 和5 5 k b 两个片段( h i n d l h 和c l a l 分别位于4 4 2 b p 及5 5 2 3 b p 处) 。 m12 图2 p c e p 4c l a l 酶切鉴定图谱 f i g2 e l e c t r o p h o r e s i sm a po fp c e p 4 d i g e s t e dw i t hc l a le n d o n u c l e a s e m ：l k bl a d d e r l a n e1 ：p c e p 4 l a t i e2 ： p c e p 4d i g e s t e dw i t hc l a l ( p c e p 4h a s u n i q u ec l a ls i t ei n5 5 2 3 b p ) ：海交通大学博十后出站i 作报告基治i ，h j 腺病毒载体的研究 崔d ：。： 盂暑多芒量 lu d m 1 堋d 1 1 0 x 1h 1 3 lh u o n 佐 一 一一一一一一= 一 l 蠹星；童! 多重墨 芷帅x ，工一：_ 2 _【oh t z 麓t v i ，1 _ 】 上海交通大学博上后出站工作报告基闻治疗用腺病毒载体的研究 1234m 图3 p c e p 4 一d c l a lc l a l h i n d l i i 酶切鉴定图谱 f i g3 e l e c t r o p h o r e s i sm a po fp c e p 4 一d c l a i d i g e s t e dw i t hc l a l h i n d i i ie n d o n u c l e a s e m ：l k bl a d d er l a n el ：p c e p 4 一d c l a ld i g e s t e d w i t hc l a l h i n d l i i l a n e2 ：p c e p 4 一d c l a il a n e 3 ：p c e p 4d i g e s t e dw i t hc l a i h i n d l i i l a n e4 ： p c e p 4 ( p c e p 4h a su n i q u ec l a is i t ei n5 5 2 3 b p a n du n i q u eh i n d h is i t ei n4 4 2 b p ) 1 2 构建质粒p c e p 4 p c e p 4 - - d c l a i 用k p n i b a m h i 双酶切，插入带有5 - k p n p a c i n o t l c l a i i b a m h l - 3 内切酶位点的寡核苷酸，从而将p a c i 、c l a i 两个单一限制性 内切酶位点引入其多克隆位点处，产生质粒p c e p 47 。经c l a i 和e c o rv 双酶切 及p a c i 单酶切鉴定正确( 图4 、图5 ) 。质粒p c e p 4 经c l a l 和e c o r v 双酶切， 得到约l k b 和9 k b 两个片段( c l a i 和e c o r v 分别位于4 6 0 b p 及9 8 0 4 b p 处) ，对 照质粒p c e p 4 - - d c l a1 只能切成约1 0 k b 的线性分子( 图4 ) ；同时质粒p c e p 4 7 也能被p a ci 切开，产生约1 0 k b 的线性分子，而对照质粒p c e p 4 - - d c l ai 却不能 被p a c i 切开( 图5 ) 。 海交通人学博上后出站_ 作报告 基凼治疗用腺病毒载体的研究 图4 p c e p 4 c l a l e c o rv 酶切鉴定图谱 f i g4 e l e c t r o p h o r e s i sm a po fp c e p 4 d i g e s t e d w i t hc l a i e c o rve n d o n u c l e a s e m ：l k bl a d d e ll a n e1 ：p c e p 4 7 d i g e s t e dw i t h c l a l e c o rv l a n e2 ：p c e p 4 一d c l a ld i g e s t e d w i t hc l a l e c o rv ( p c e p 4 7 h a su n i q u ec l a l s i t ei n4 6 0 b pa n du n i q u ee c o rvs i t ei n9 8 0 4 b p ) 图5 p c e p 4 p a c i 酶切鉴定图谱 f i g5 e l e c t r o p h o r e s i sm a po fp c e p 4 d i g e s t e d w i t hp a de n d o n u c l e a s e m ：l k bl a d d e nl a n e1 ：p c e p 4 d i g e s t e dw i t h p a c l l a n e2 ：p c e p 4 一d c l a id i g e s t e dw i t hp a d ( p c e p 4 7 h a su n i q u ep a cis i t e ) 二质粒p b h g l o x a e l ，e 3 c r e 的改造 p b h g l o x a e l ，e 3 c r e 为腺病毒a d 5 的骨架质粒，约3 4 k b ，我们对其改造 的目的是在其h i 1 0 0 p 区引入币一限制性内切酶位点s w a l ，从而建立一种方便快 捷的腺病毒外壳纤维改造的技术平台。改造分多步进行，克隆方案见图6 。 海交通大学博士后山站1 ：作报告基i i ；】治疗用腺病毒载体的研究 f i g 6 clo i l n gs c h e