拉曼光谱技术在植物细胞壁中的应用以及展望.ppt

拉曼光谱技术在植物细胞壁研究中的应用以及展望,细胞生物学2014年4月8日,2,目录,一、维管形成层及木质部细胞细胞壁概述二、拉曼光谱技术原理及可用于研究植物细胞壁的拉曼显微技术三、如何利用拉曼光谱技术研究植物细胞壁,截至2010年，全世界石油储藏量为13830亿桶，日消耗量为8740万桶；天然气储量为187.1万亿立方米，年消耗量为3.1万亿立方米；煤炭储量为8600亿吨，年消耗量为72.7亿吨（statisticalreviewofworldenergyfullreport2011）。不断增加的能源消耗量使石油，天然气和煤炭资源在最多43年，62年和120年后将枯竭。世界靠科技、工具与能源来改变，工业革命、科技革命和信息革命都改变了世界格局，当今的世界格局是西方掌握的先进科技与发达信息以及石油、天然气的分布划分而成的。而下一场能源革命已经悄悄在美国和加拿大展开页岩气！美国已经拥有了生产页岩气的技术与批量生产的能力，五年之后就将生产出足以替代石油的新型清洁能源，加上美国国内的石油与天然气开发也逐步启动，二战后按石油储藏与生产、使用来划分的世界格局即将破局，中东的地位大幅下降，甚至会沦为一个乱摊子；俄罗斯靠出口石油的经济将会一蹶不振。互联网大数据时代让世界从此没有孤岛，能源革命直接决定世界的未来！仅仅是页岩气革命么？不！核能不可再生而且存在风险，太阳能，风能，地热能，尤其是生物质能植物利用太阳能，通过碳同化的过程将吸收的二氧化碳转变为有机物，储存于植物体内。生物质能的形成过程由植物体自身完成，同时消耗掉大气中的二氧化碳，维持大气平衡。同时全世界范围内生物质资源总量十分丰富。木材是人们利用生物质能源的主要形式。木材即植物的次生木质部，它由木本植物的一种侧生分生组织维管形成层活动而产生，因此对维管形成层发育与遗传调控的研究是使人们了解木材形成，提高木材产量和利用率的基础。,要解决的问题,木材形成与形成层的活动紧密相连木材的次生木质部是形成层细胞分裂形成的,形成层在活动期内的活动变化不仅影响着木质部细胞形成的数量,同时决定着木材的构造和其物理化学性能。形成层紡錘形细胞是如何分化出各种类型样式的木质部细胞?分化出来的木质部细胞是怎么生长的,其在发育过程中会发生什么的变化?而这些变化又与什么因素有关?从细胞生物学和解剖形态学的水平来看，木材生长发育形成过程中细胞形态结构发生了哪些变化？在细胞水平和组织水平上来说，木材生长过程中发生了哪些细胞力学性质和化学成分分布的变化？这些问题,对于实现木材性质的改良和定向培育提供重要的理论依据。,1.1木质部细胞的细胞壁结构,胞间层(intercellularlayer)细胞胞间层(intercellularlayer)在分裂时，最初形成的一层是由果胶质组成的细胞板(cellplate)，它把两个子细胞分开，这层就是胞间层，又称中层(middlelamella)。初生壁(primarywall)随着子细胞的生长，原生质向外分泌纤维素，纤维素定向地交织成网状，而后分泌的半纤维素、果胶以及结构蛋白填充在网眼之间，形成质地柔软的初生壁。次生壁(secondarywall)很多细胞只有初生壁，如分生组织细胞、胚乳细胞等。但是，某些特化的细胞，例如纤维细胞、管胞、导管等在生长接近定型时，在初生壁内侧沉积纤维素、木质素等次生壁物质，且层与层之间经纬交错。由于次生壁质地的厚薄与形状的差别，分化出不同的细胞，如薄壁细胞、厚壁细胞、石细胞等.形成层细胞分化为未成熟木质部细胞，未成熟木质部细胞继续分化。其中包括细胞壁沉积的重要过程,ml胞间层；cw1初生壁；s1次生壁外层；s2次生壁中层；s3次生壁内层,构成细胞壁的成分中，多糖，蛋白质、酶类以及脂肪酸等细胞壁中的多糖主要是纤维素、半纤维素和果胶类纤维素构成微团，微团组成微纤丝，微纤丝再组成大纤丝，构成细胞壁支架次生细胞壁中还有大量木质素,1.2细胞壁结构成分,1.3细胞壁形成,细胞壁的形成是多种细胞器配合作用的结果。新细胞壁的形成开始于细胞分裂的晚后期或早期。细胞分裂时，在母细胞的赤道板面上，分泌囊泡(secretoryvesicles)不规则地汇聚在一块，逐渐整齐地排列成片，组成成膜体(phragmoplast)。成膜体中的囊泡膜相互融合与连接形成细胞的质膜，其中的内含物连成一体构成细胞板，这是雏形的中层结构。细胞板组成后，高尔基体小泡运输造壁物质释放到质膜外，以充实新形成的壁。当细胞板中逐渐有果胶质和少量纤维素分子不断地填充和掺入时便构成了中层，在中层两侧陆续有纤维素和半纤维素等物质的沉积则形成了质地柔软的初生壁，这时两个子细胞便形成。此后，大多数细胞的初生壁内侧又分层、定向地沉积着纤维素分子，它们经纬分明地交叉加固，这是增强植物体支持能力的重要基础。纤维素分子的定向分层沉积与微管的活动有关，秋水仙素(colchicine)可阻止微管的形成，抑制纤维素分子的定向排列。微管的另一个重要作用是使新形成的细胞板上保留某些通道，参与胞间连丝的形成，使原生质在两个子细胞间能保持联系。,1.4胞间连丝,当细胞板尚未完全形成时，内质网的片段或分支，以及部分的原生质丝(约400nm)留在未完全合并的成膜体中的小囊泡之间，以后便成为两个子细胞的管状联络孔道，这种穿越细胞壁、连接相邻细胞原生质(体)的管状通道被称为胞间连丝(plasmodesma)。胞间连丝的数量和分布与细胞的类型，所处的相对位置和细胞的生理功能密切相关。胞间连丝的功能：物质交换0.5um）由于激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。而且,拉曼显微镜物镜可以将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小体积的样品。非损伤性测量（比如超薄切片用锇酸）样品用量少（ug级）由于激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得。而且,拉曼显微镜物镜可以将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小体积的样品。灵敏度高利用共振拉曼效应,可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动,这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强1000到10000倍。不受水溶液影响（水的红外吸收非常强烈）固体样品可直接测定，无需制样,2.5适用于植物细胞壁研究的拉曼光谱显微技术,傅立叶变换拉曼光谱分析技术(ftir)共振拉曼光谱技术(rrs)表面增强拉曼光谱技术(sers)针尖增强拉曼光谱技术（ters）共聚焦显微拉曼光谱技术(crm)受激拉曼散射光谱技术（srs）相干反斯托克斯拉曼散射光谱技术（cars）,835cm-1:果胶多糖1541cm-1,1650cm-1可能有细胞质蛋白1734cm-1，1240cm-1：木聚糖1629cm-1：非常复杂,傅立叶变换拉曼光谱分析技术(ftir)简介,一个mcf-7细胞的micro-raman，以及随后的定量分析(a&b)visibleimageofanmcf-7cellandchemicalimagingspecificfortheintensityofchstretchingthroughoutthecell(8080pixelsanda0.5mmspotsize).(c)hierarchicalclusteringofthespectralimagespecificforthefingerprintregion(1800675cm1)displaysthelocalitiesofsub-cellularcomponents.clustering可以用来量化亚细胞成分，就像细胞核,在这个细胞的例子里占了12%(768像素),micro-raman简介,表面增强拉曼(sers)简介,优势：可以得到常规技术不易得到的信息什么是表面增强?sers效应是在激发区域内，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致的拉曼散射信号极大的增强。怎么得到表面增强?远小于激发波长的金属颗粒(au,ag)会使电磁场增强，增强的电磁场可以使在金属颗粒表面的分子拉曼信号极大的增强激光激发了金属表面的等离子体,目前吸附分子产生表面增强拉曼散射的金属有ag、au、cu、li、na、k、in、al、pt、rh、ni|、ti、hg、cd、pd等，化合物有tio2、nio等,针尖增强拉曼光谱技术（ters）简介,扫描探针技术(spm),相干拉曼散射显微术（cars&srs）简介,cars优势：高灵敏度，高空间分辨率，高时间分辨率可以对脂类等小分子成像，重要的生命物质脂类进行观察。（谢晓亮院士说，因为美国人比较胖，所以）可以通过选择振动光谱，对体内特定小分子物质如药物，或者生物大分子如核酸蛋白质进行无需标记的成像，是重要的活体成像手段可以进行视频速率的活体监测可以很好的研究植物细胞壁中木质素的分布，有助于理解生物质转换过程中的各种处理与反应的发生机理srs优势：比cars更灵敏，且可以完成定量分析1999年，谢晓亮实验室采用新的激光控制技术，使cars显微术走向实用2009年，谢晓亮实验室开发出srs显微镜，很大程度上弥补了cars的不足,cars与srs技术的创立者谢晓亮，纵横生命科学世界的华人美国国家科学院院士，哈佛大学终身教授，nature杂志编委/research/faculty/sunney_xie.php,闵玮，哥伦比亚大学教授。博后期间以第一作者发表有关srs显微技术,carstissueimageofsmalladipocytesofthesubcutaneouslayerfrommouseeartissue.theimagewastakenataramanshiftof2845cm-1toaddressthech2stretchingfrequency.,rnaiscreeningofnewfatstorageregulatorygenesbasedoninvivolipidquantificationusinglabel-freesrsmicroscopy.srsimagesat2845cm-1forwild-typeworm(a),thedaf-2mutant(b),andthetransgenicwormintestinallyoverexpressingthelipase(c).(d)quantificationoffatcontentbysrs(n=5worms)andthin-layerchromatographygaschromatography.(e)srssignalincreasecomparedtothecontrolforgenesthatresultedinafatcontentincreaseofmorethan25%wheninactivatedbyrnai(p0.0001,n=5worms).,3拉曼光谱在植物细胞壁中的应用,细胞壁成分很复杂，是一种纳米复合材料，微纤丝嵌入在不同基体复合物中（纤维素，果胶，木质素），得到的光谱是多种物质光谱的重叠。植物的形状和机械强度由植物细胞壁决定，而植物细胞壁是由结构组件在复杂组合而成。细胞壁必须能够增长，因此,细胞壁具有灵活性和弹性。细胞壁的功能特性不仅取决于细胞壁的聚合物组成,还在于聚合物大分子结构和构象,和从几纳米尺度(即规模略高于分子)到几微米高度有序的架构。而利用经典的化学技术来处理细胞壁聚合物会让这些细节丢失。因此光谱方法发挥了重要作用检查植物细胞壁的原生状态。不仅化学成分本身的利益,还构造和组成与细胞壁层以及不同聚合物的取向和变形的变化。关于细胞壁的主体结构的研究已经完成,在接下来的重点将次要的植物纤维以及更细小更细节的部分。,3.1微纤丝,存在的技术难点：如果有合适的角度，拉曼光谱的强度取决于微纤丝之间的角度和激光偏振方向。改变激光偏振平行(0)垂直于纤维轴(90)会导致几乎所有带非常大的拉曼强度的变化，因此,在每一个植物细胞壁拉曼实验中,纤维方向(轴)和激光偏振调整在一个已知或者定义的角度。可以研究的内容：可以由于纤维取向的改变造成的强度变化,由此发生不同的纤维素含量次生细胞壁内的纤维素纤维与纤维轴变化之间的不同的壁层(s1-s2-s3),可以通过拉曼成像可视化观察值得注意的纤维取向的变化往往对应于纤维素结晶度的变化,3.2细胞壁聚合物,纤维素半纤维素较为复杂，而幸运的是木质素和果胶都有非常明显的特征峰，因此可以利用拉曼光谱来研究。(图示杨树木材截面的拉曼图像),3.3细胞壁分子的取向,细胞壁组件是高度有组织的，可以通过激光平行和垂直于纤维轴来验证，而研究细胞壁分子的取向。r.h.atallaandu.p.agarwal,science227(1985),636638.,3.5力学上的应用,监测分子压力在分子水平上的力学压力监测，给分子变形experimentsondifferentcellwalltypesduringdeformationwillhelptodeepenthemicromechanicalunderstandingofplantcellwallsanditsmacromolecules.thistechniquecanalsogiveimportantinsightsintothemicromechanicsofotherbiomaterials,e.g.ofspidersilkandofnewlycreatedbioinspiredcomposites.识别和定位植物代谢产物识别植物中的矿物质,3.6细胞壁毒理,植物的环境毒理方面。具有代表性的是kamnev等对植物根际细菌的重金属培养实验,研究表明细菌的细胞壁或膜积累重金属可以引起其拉曼谱线的变化,提示拉曼光谱技术在植物细胞壁环境毒理方面应用具有可能性kamnevaa.journalofmolecularstructure,2002,610(1-3):127-131.,3.7细胞壁无标记成像,展望1,2014.3.2naturemethod哥伦比亚大学prof.weimin(闵玮)将受激拉曼散射显微镜技术，与一种小型但非常有活力的炔烃标记（即cc，碳碳三键）相结合，c=c是一种化合物键，当其拉伸时，会以独特的“频率”（不同于细胞内的自然分子）发出强烈的拉曼散射信号。活细胞全程可视化跟踪生命过程srs显微镜可捕获小分子携带的cc键的独特拉伸运动，生成活细胞和动物体内分子的三维图像闵玮说：“我们的新技术将开启用其他方式难以实现的、针对活细胞和动物中一些生物小分子的许多研究。除了基础研究，我们的技术还可能大大推动转化应用。我相信srs成像炔烃标记能够像gfp荧光团荧光成像一样，在大型物种中成像生物小分子。”,rrs可提供花青素糖基化修饰的典型光谱变化特征。这为次生产物的酶代谢调控机制研究提供了手段,植物次生代谢产物定位的无损分析较多集中在植物器官水平。那么，甲基化，磷酸化修饰的光谱变化特征？能否用拉曼光谱技术观察甲基化磷酸化？,展望2,谢谢！请多多指教！,细胞壁的结构成分1.纤维素纤维素(cellulose)是植物细胞壁的主要成分，它是由100010000个-d-葡萄糖残基以-1,4-糖苷键相连的无分支的长链。分子量在50000400000之间。纤维素内葡萄糖残基间形成大量氢键，而相邻分子间氢键使带状分子彼此平行地连在一起，这些纤维素分子链都具有相同的极性，排列成立体晶格状，可称为分子团，又叫微团(micellae)。微团组合成微纤丝(microfibril)，微纤丝又组成大纤丝(macrofibril)，因而纤维素的这种结构非常牢固，使细胞壁具有高强度和抗化学降解的能力。存在于细胞壁中的纤维素是自然界中最丰富的多糖。据推算，每年地球上由绿色植物光合作用生产的纤维素可达1011t之多，而1990年全球粮食产量只有2.2109t。如何把纤维素转化成为人类可利用的食物或者有效能源，是人们长期渴望解决的重大课题！2.半纤维素半纤维素(hemicellulose)往往是指除纤维素和果胶物质以外的，溶于碱的细胞壁多糖类的总称。半纤维素的结构比较复杂，它在化学结构上与纤维素没有关系。不同来源的半纤维素，它们的成分也各不相同。有的由一种单糖缩合而成，如聚甘露糖和聚半乳糖。有的由几种单糖缩合而成，如木聚糖、阿拉伯糖、半乳聚糖等。半纤维素在纤维素微纤丝的表面，它们之间虽彼此紧密连接，但并非以共价键的形式连接在一起。因此，它们覆盖在微纤丝之外并通过氢键将微纤丝交联成复杂的网格，形成细胞壁内高层次上的结构。3.果胶类果胶物质(pecticsubstances)也是细胞壁的组成成分。胞间层基本上是由果胶物质组成的，果胶使相邻的细胞粘合在一起。果胶物质是由半乳糖醛酸组成的多聚体。根据其结合情况及理化性质，可分为三类：即果胶酸、果胶和原果胶。(1)果胶酸果胶酸(pecticacid)是由约100个半乳糖醛酸通过-1，4-键连接而成的直链。果胶酸是水溶性的，很容易与钙起作用生成果胶酸钙的凝胶。它主要存在于中层中。(2)果胶果胶(pectin)是半乳糖醛酸酯及少量半乳糖醛酸通过-1，4-糖苷键连接而成的长链高分子化合物，分子量在2500050000之间，每条链含200个以上的半乳糖醛酸残基。果胶能溶于水，存在于中层和初生壁中，甚至存在于细胞质或液泡中。(3)原果胶原果胶(protopectin)的分子量比果胶酸和果胶高，甲酯化程度介于二者之间，主要存在于初生壁中，不溶于水，在稀酸和原果胶酶的作用下转变为可溶性的果胶。果胶物质分子间由于形成钙桥而交联成网状结构。它们作为细胞间的中层起粘合作用，可允许水分子自由通过。果胶物质所形成的凝胶具有粘性和弹性。钙桥增加，细胞壁衬质的流动性就降低；酯化程度增加，相应形成钙桥的机会就减少，细胞壁的弹性就增加。4.木质素木质素(lignin)不是多糖，是由苯基丙烷衍生物的单体所构成的聚合物，在木本植物成熟的木质部中，其含量达18%38%，主要分布于纤维、导管和管胞中。木质素可以增加细胞壁的抗压强度，正是细胞壁木质化的导管和管胞构成了木本植物坚硬的茎干，并作为水和无机盐运输的输导组织。5.蛋白质与酶6.矿质细胞壁的矿质元素中最重要的是钙。据研究，壁中ca2+浓度远远大于胞内，估计为10-510-4moll-1，所以细胞壁为植物细胞最大的钙库。钙调素(calmodulin,cam)在细胞壁中也被发现，如在小麦细胞壁中已检测出水溶性及盐溶性两种钙调素。,激光器,如具有30nm，351nm发射线的紫外激光器；ar激光器一般在488.0nm,514.5nm等可见区发光；而nd:yag(钇铝石榴石)激光器则在1064nm的近红外区使用。,试样室,发射透镜使激光聚焦在样品上收集透镜使拉曼光聚焦在单色仪的入射狭缝,单色仪,仪器心脏1个光栅，2个狭缝减少杂散收光,2.4拉曼光谱技术在植物学研究中的优势,1、水的拉曼散射强度很微弱,生物大分子处于水溶液中，因此拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同时覆盖很广波数的区间,可对有机物及无机物等多种物质进行分析。相反,若让红外光谱覆盖如此广阔的区域则必须改变各种器件的参数,相比较而言程序复杂不具有通用性。3、拉曼光谱的谱峰清晰尖锐,适合定量研究以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分析中,独立的拉曼区间的强度和功能集团的数量相关。,生物分子鉴定,拉曼光谱法对于蛋白质中的酪胺酸可以测出它是埋藏在內或暴露于外。如果酪胺酸是被埋藏在內部，則它可做为强的氢键供给者（即提供氢原子給临近的氢鍵接受者）。此时拉曼光谱上850cm-1/830cm-1的比值为0.5，即830cm-1的光谱峰较高。反之，若酪胺酸暴露在蛋白质外部，則比值将升高，亦即850cm-1的光谱峰较高。,互补,互补,拉曼光谱与红外光谱的关系,互排法则：有对称中心的分子其分子振动对红外和拉曼之一有活性，则另一非活性,互允法则：无对称中心的分子其分子振动对红外和拉曼都是活性的。,参考资料,fig.2ramanimagesoftheaerenchymaticparenchyma,sclerenchymaandavascularbundleatposition1(p1)calculatedbyintegratingfrom2,769to3,087cm-1(acallcellwallpolymerswithamainpartofcellulose),from1,075to1,114cm-1(dfchangesincelluloseorientation),from842to872cm-1(gipectin)andfrom1,641to1,546cm-1(jllignin),fig.3ramanimagesofthesqueezedparenchymaatposition3(p3),thesclerenchymaandvascularbundleatposition4(p4)calculatedbyintegratingfrom2,769to3,087cm-1(acallcellwallpolymerswithamainpartofcellulose),from1,075to1,114cm-1(dfchangesincelluloseorientation),from842to872cm-1(gipectin)andfrom1,641to1,546cm-1(jllignin),srstissueimagingoffreshm