（森林培育专业论文）几个苹果新品种自交不亲和基因的分离与鉴定.pdf

摘要 自交不亲和性( s e l f i n c o m p a t i b i l i t y ) 是植物防止近亲繁殖和保持物种连续性的一 种重要机制，在植物界普遍存在。苹果( 胁如如m e s r f c 口b o r k h ) 属于配子体自交不 亲和类型，是由一个基因座上的复等位基因一s 基因控制的，生产中必须配置具有不 同s 基因型的苹果品种作授粉树或用具有不同s 基因型的苹果品种花粉进行人工辅助 授粉，才能获得预期的产量和果实品质。如果不了解品种的s 基因型，在选配授粉品 种时会具有较大的盲目性。快速、早期鉴定苹果品种的s 基因型是保证其丰产稳产的 一项重要基础工作。河北省近十年来新引进了美国8 号、昂林、松本锦、华冠、南方 脆和斗南等苹果品种，关于它们的自交不亲和基因型国内外未见报道。为给以上苹果 品种确定栽培措施提供可靠的理论依据，作者于2 0 0 4 、2 0 0 5 连续两年对以上几个苹 果品种的s 基因进行了研究，主要研究结果如下： 1 在基因组d n a 提取方法上进行了改进，即：( 1 ) 在细胞核裂解之前加入提取液 ( o 4 m o l l 葡萄糖，3 可容性p v p ，1 b 一巯基乙醇) ，防止酚类氧化成醌类和d n a 降解。( 2 ) 用冰冻无水乙醇代替常规用的异丙醇沉淀d n a ，防止盐类、糖类等与d n a 共沉淀。( 3 ) 抽提过程只用氯仿异戊醇，加速有机相与无机相的分层，减少酚类的 污染。( 4 ) d n a 的收集采用低速离心法，避免了用钩子挑出对d n a 造成的机械损伤。 ( 5 ) 用双蒸h 2 0 溶解d n a ，利于以后测序工作的进行。建立了改进c 丁a b 法，该 方法提取基因组d n a 的a 2 6 0 a 2 8 0 值在1 8 19 之间，基因组d n a 浓度均在2 5 4 g 旺 左右，常规c t a b 法提取的基凶组d n a 的a z 6 0 a 2 8 0 不稳定在1 3 1 ，7 之间且基因 组d n a 浓度平均值较改进的方法低o 4 9 u “l 。用改进c t a b 法提取的基因组d n a 在08 的琼脂糖凝胶电泳条件下检测，d n a 呈一条整齐的亮带，无降解，点样孔无 残留、发亮现象。 2 在不同试材方面，以新梢顶端刚展开的嫩叶和成熟叶片为试验材料，用改进c t a b 法提取基因组d n a ，经纯化后样品的a 2 6 0 a 2 8 0 值均在l8 1 9 之间，d n a 纯度高， r n a 和蛋白质去除干净，但成熟叶片提耿的基因组d n a 浓度较新梢顶端刚展开的嫩 叶提取的基因组d n a 浓度低o 3 0 u 此。因此，基因组d n a 提取以新梢顶端刚展开 的嫩叶为好。 3 所用试材方面，刚采集的新鲜样品、采集后直接放于一7 0 冰箱中的样品和采集 后直接放于一4 0 冰箱中一个月的样品提取的基因组d n a 均较好。直接放于一3 0 冰箱中一个月的样品，所提取的d n a 出现降解，且有不同程度的变褐。 4 在引物方面，根据苹果s r n a s e 的保守序列“f t q q y q ”和“a n t i 1 m 1 w p n v ” 设计了弓i 物p l ：5 一t t t a c g c a g c a a t a t c a g 3 ：p 2 ： 5 a c g t t c g g c c a a a t a 加a t t - 3 ，用此引物对已经确定的苹果基因组d n a 中的s 基因进行p c r 扩增，结果能扩增出所选品种的s 1 ，、s 2 一、s 3 - 、s 5 、s 7 一、s 9 、s 。、s 2 4 - 、 s 2 6 、s 2 7 、和s ”等全部s 一等位基因，具有较高的s 一等位基因特异性。 5 南方脆、华冠、昂林、松本锦和美国8 号等5 个苹果品种的基因组d n a 的s 基 因p c r 扩增产物，经凝胶电泳检测，都含有一条3 4 0 b p 左右的片段，昂林含有条 5 3 0 b p 左右的片段，美国8 号含有一条1 3 0 0 b p 左右的片段。以上d n a 片断经不同限 制性内切酶酶切，表明美国8 号、昂林、松本锦、华冠、南方脆5 个苹果品种s 一等 位基因的基因型依次为：s 9 s 2 7 、s i s 9 、s 9 s 9 、s 2 s 9 、s 2 s 9 。 6 斗南苹果品种基因组d n a 的s 基因p c r 扩增产物，经凝胶电泳检测，也含有一 条3 4 0 b p 左右的片段，但其s 一等位基因片段不能被s l - 、s 2 、s 3 一、s 4 、s 5 - 、s 7 一、 s 9 、s 1 0 _ 、s 2 0 、s 2 5 一、s 2 6 i 、s 2 7 一、s 3 0 所对应的限制性内切酶切割。经测序显示该d n a 片段长度为3 4 8 b p ，在n c b i 中进行局部同源性比较与所搜索的序列相似性可达8 0 以上，与s 2 等位基因局部同源性达9 7 5 ( 不包括内含子) ，但该片段没有s 2 等 位基因的限制性内切酶e c o r v 酶切位点，将该片段确定为新的s 一等位基因，在 g e n e b a n k 中接收号为d 0 2 1 9 4 6 4 。 7 用金冠、富士和嘎拉等苹果品种的花粉对斗南苹果进行田间授粉试验，花序坐果 率分别为：3 3 、6 8 和7 4 ，花朵坐果率分别为：3 4 、6 4 和7 7 ；用同样花粉 进行花柱半离体培养试验，其伸出花粉管的花柱比率分别为：3 8 4 6 、7 0 8 3 和8 6 6 7 ，平均每根花柱伸出花粉管数分别为：1 1 5 条、3 5 4 条和2 8 3 条，结果表明金冠、 富士和嘎拉均与斗南苹果亲和，说明斗南苹果不含有s 1 、s 2 、s 3 - 、s s 、s 9 等位 基因，与p c r r f l p 结果致。 关键词：苹果新品种；自交不亲和；s 基因：p c r r f l p i s o i a t i o na n di d e n t i f i c a t i o o fs e i f - i n c o m p a t i b i l i t ya l l e i eo fs o m en e wa p p l e c u l t i v e r 8 n a m e ：z h a n gx u e m e j s u p e r v j o r ：l ib a o - g u o o ig u o _ h u i s p e c i a l i t y ：s i l v i c u l t u r e a b s t r a c t s e i f - i n c o m p a t i b i l i t yi sa ni m p o r t a 士1 tm e c h a n i s mw h i c hc o u l dp r e v e n tc l o s eb r e e d i n g a n dl 【e e p s p e c i e sc o n t i n u i t y ，i te x i s t e dw i d e l y i nt h ep l a l l tk i n g d o m a p p l ee x h i b i t s g a n l e t o p h ”i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ( g s i ) g s lw a sc o n t r o l l e db yas i n g l e ，m u l t i - a 1 1 e l i cl o c u s ， t h es l o c u s i np r o d u c t i o n ，w em u s ta l l o c a t e dm ep o l l e nd o n o rw h i c hh a dd i 岱：r e n ts g e n o t y p eo rc h o s e 吐1 em a n u a la s s i s t 肌c ep o l l i n a t i o nw 孙a p p l ep o l l e no fd i 虢r e l l ts g e n o t y p e st ok e e pt l l ey i e l da 1 1 dq u a l i t y t h e r ee x i t e db l i n d n e s so fa l l o c a t i o nm ep o l l e n d o n o ri fw ed i d n tk n o wt h esg e n o t y p eo ft h ec u l t i v a r s t h e r e f o r e ，i tw a sa ni m p o n a mt o i d e n t 母t h esg e n o t y p eo f 印p l ec u l t i v a rq u i c k l ya n de a r ly a p p l ec u l t i v a r so fk o r i n ， n a n g c u i ，u s a - 8 ，h u a g u a n ，m a t s 啪o t on i s h i k ia 1 1 dd o u n a l lw e r ei n t r o d u c e dr e c e n t l y b yh e b e ip r o v i n c e ，b u tt 1 1 e i rsg e n o t y p ew e r e 幽o w n i nt 1 1 i st 1 1 e s i s ，sg e n o t y p eo fs o m e a p p l ec u l t i v a r sw e r es t u d i e d ，s oa st op m v i d et h e o r ya n dp r a c t i c eb a s i sf o r 印p l ep m d u c t i o n a n dc u l t i v a t i o n t h er e s u l t sw e r ea sf b l l o w s ： 1 t h ei m p r o v e dm e t h o do fg e n o m i cd n ae x a c t i o nw a sa sf o l l o w s ( 1 ) a d d i n ge x 廿a c t ( o 4 m o l lg l u c o s e ，3 p v p ，1 0 一m e r c a p t o e t h a n 0 1 ) p r i o rt ol y s i st h en u c l e ia n dt o i n h i b i tt h ef o m l a t i o no fo x i d i z e dp o l y p h e n o lc o m p o n e m s ( 2 ) u s i n g 矗o z e na n h y d r o u se t h y l a l c o h o li n s t e a do fi s o p m p y la l c o h 0 1w h i c hw a su s e dg e n e r a l l yt od e p o s i td n aa 1 1 dt o i n h i b i ts a l t sa i l dc a r b o h y d r a t ee t cd 印o s i t i o na l t o g e m e r 埘也d n a ，t h i sc o u l ds a v et i m eo f d n ad e p o s i t i o na n dr a i s et h e e f 五c i e n c y ( 3 )o n l yu s i n g c h l o r o f o r ma n d 3 一m e t h y l 一1 - b u t a l l o lt oa c c e l e r a t el a y e r i n gb e t w e e no r g a l l i ca i l di n o 唱a 1 1 i c ，r c d u c i n gt h e p o l l u t i o no fp h e n 0 1 ( 4 ) c e n t r i f u g a lm e t h o do fl o ws p e e dw a su s e di nm ec o l l e c t i o no f d n a ，c o m p a r i n gt oh o o k i n gd n a ，t h i sm e t h o dc o u i da v o i d em a k i n gm a c h i n e r yi n j u r yt o d n a1 5 ) d i s s o i v e dd n aw i t hs t e m ed i s t i l l e dw a t e rw h i c hh a da d v a m a g et os e q u e n c i n g a 2 6 0 a 2 8 0o fg e n o m i cd n aw a s1 8 一1 9a 董1 dt h ec o n c e n t r a t i o no fg e n o m i cd n aw a sa b o u t 2 5 4 p g “lu s i n gm em e t h o do fi m p r o v e dc 1 - a b a 2 6 0 a 2 8 0o fg e n o m i cd n aw a s13 - 1 7 ， a n dc o n c e m r a t i o no fg e n o m i cd n aw a sl o w e rt h a n0 2l 肛u lu s i n gt h eg e n e r a lc t a b m e t h o dt h a ni m p r o v e dc t a bm e t h o d d n as h o w e da 仃i mb r i g h tb a l l dw i t h o u ts m e a r a n d t h e r ew a sn or e s i d u eb r i g h ti n s 锄p l eh o l ew h e nd e t e c t e dw i t ho 8 a g a r o s eg e l e l e t r o p h o r e s i s t h er e s u l ts h o wt t l a tg e n o m i cd n ai sc o n l p l e t ca i l dw i t h o u td e g r a d a t i o n 2 t h ea 2 6 以乜8 0r a t i oo fg e n o m i cd n aw a s1 8 1 9 、v i t hi m p r o v e dc 1 、a bm e m o dw i t h m a t e r i a lo f t e n d e rl e a f o nt h et o po fs h o o t sa 1 1 da g e i n gl e a f ，a l lo f t h eg e n o m i cd n a p u r i t y w a sh i g h ，b u tt h eg e n o m i cd n ac o n c e n 仃a t i o no fa g e i n gl e a fw a sl o w e ro 17 lt h a n t h a to ft e n d e ri e a ft h e r e f o r e ，t h ee x 廿a c t i o no fg e n o m i cd n a s h o u l db ew i mt e n d e rl e a fo n t h et o po fs h o o t 3 t h e r ew e r e n tn o t a b l ei n n u e n c eo fm es a m p l e sw h i c hw e r e 抒e s h ，p u ti m o 一7 0 r e 缸g e r a t o r 锄dp u ti n t o 一4 0 r c f r 培e r a t o rf o ram o n t ht ot h eq u 锄t i t ya n dq u a i i t yo f g e n o m i cd n a t h ee x t r a c t i o no fg e n o m i cd n a w a sd e g r a d a t i o nw h e ns a m p l e sw e r ep u t i n t o 一3 0 r e f r i g e r a t o rf o ram o n m ，a i l dt 量1 eg e n o m i cd n a t 啪e db r o w nt os o m ee x t e n t 。 4 ap a i ro fa p p l ep r i m e r s ( p l ：5 一r n 、a c g c a o c a a r a t c a g 一3 ：p 2 ：5 一 a c g t t c g g c c a a a t a c a t t 一3 ) w e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt on l ec o n s e n ，e ds e q u e n c e o fa m i n oa c i da n dsg e n o t ) 乍es l ，s 2 ，s 3 一，s 5 - ，s 7 - ，s 9 一，s g ，s 2 4 - ，s 2 6 一，s 2 7 - a n ds 3 0 w e r e a m p l i f i e dw i t ht h i sp a i ro fa p p l ep r i m e r s ，t h i ss h o w e dt h a tm ep r i m e r sw e r ea b l et o 锄p i i 母 a p p l es a l i e i e s ，w i t hh i g hs a l l e l es p e c i 6 c i t v 5 a f t e rp c r 锄p 1 街c “o n ，m ec u l t i v a r so fn a n f h g c u i ，h u a g u a l l ，k o r i n ，m a t s u m o t o n i s h i k ia n du s a - 8c o n t a i na3 4 0 b ps e g m e n t ，k o r i nc o m a i na5 3 0 b ps e g m e n t ，u s a 8 c o n t a i na1 3 0 0 b ps e g m e m ，t h er e s u l t ss h o wt 1 1 a ts e l f - i n c o m p a t i b i l i 锣a i l e l e sw e r ei s o l a t e d a n di d e n t m e db yp c r - r f l pa n a l y s i s ，a 1 1 dt 1 1 e i rs e l f - i n c o m p a t i b i l i t yg e n o t ) ，p ew e r es 9 s 2 7 s 1 s 9 ，s 9 s 9 ，s 2 s 9 ，s 2 s 9r e s p e c t i v e l y 6 sa l l e l eo fd o u n a nw a sn o ti d e n t i f i e dw i t h s p e c i 丘cr e s t n c t i o ne n z y m e so f s 1 - ，s 2 一，s 3 - ，s 4 一，s 5 一，s 7 一，s 9 一，s 1 0 一，s 2 0 一，s 2 5 一，s 2 6 一，s 2 7 一，s 3 0 - 世e rs e q u e n c e ，t h er e s u l t s h o w e dt h a t 也i sp a r tc o n t a i n3 4 8 b p ，t h er e s u l to fb l a s ti nn c b is h o 、v e dt h a tm ei d e n t i t y w a sa b o v e8 0 ，t h eb l a s t b e t w e e n 受一a 1 1 e l ea n d 岛，a i i e l ew a s9 7 5 ( d i dn o tc o n t a i n i n t r o n ) ，b u td i dn o ti d e m 汝e dw i t hs p e c i 矗cr e s 订i c t i o ne n z y m e so fs 2 ，讪e r e f o r e ，m i sp a n w a sd e f i n e df o ran e ws - a l l e l e ，m ea c c 印t e dn u m b e ri ng e n b a n kw 船d q 2 1 9 4 6 4 7 p o u e n so fg 0 1 d e nd e l i c i o u s ，f u j ia n dg a l a 、v e r ep o l i i n a t e dt od o u n a ni n 也ef i e l d ，t h e p 0 1 1 i n a t i o nr e s u l ts h o w e dt h a tt 1 1 ef u i ts e tp e r c e m a 龄o fi n n o r e s c e n c e 、v e r e3 3 ，6 8 a n d 7 4 r e s p e c t i v e l y ，m en i ts e tp e r c e n t a g eo fn o w e rw e r e3 批，6 4 a n d7 7 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l to fs e m iv i 订oc i l l t u r eo fs t y l ep o l l i n a t e dw i t ht 王1 es a m ec u l t i v a r ss h o w e dt h a tt h e r a t eo fs t y l e sw i t hp 0 1 l e nt u b em m u 曲t h e i rb o t t o m sw e r e3 8 4 6 ，7 0 8 3 a n d 8 6 6 7 r e s p e c t i v e ly ，m en 啪b e ro fp 0 1 1 e nt i l b e sp e rs t y l ew e r e1 1 5 ，3 5 4 肌d2 8 3 ，t l l e r e s u l ts h o w e dt h a tp o l l i n a t i o nc o m b i n a t i o n s 啦o n gd o u n a na n dg o l d e nd e l i c i o u s ，f u 亿 g a l aw e r ec o m p a t i b l e ，d o u n a nd i dn o tc o n t a mm esg e n eo f s l ，s 2 ，s 3 ，s 5 ，s 9 ，a n dm i sr e s u l t 、v a sa c c o r d a i 】tw j t bp c r r f i ，p k e yw o r d s ：n e wa p p i ec u l t i v a r s ；s e l f - i n c o m p a t i b i i i t y ；sg e n e ；p c r - r f l p s i s s i g s i r f l p p c r h v s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y 缩写词 自交不亲和性 s p o r o p h ”i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y 孢子体自交不亲和 g a m e t o p h ”i cs e l f i n c o m p a t i b i l 时 配子体自交不亲和 r e s t r i c t i o n 舾g m e n tl e n g t l lp 0 1 y m o r p l l i s m 限制性片断长度多态性 p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n h y p e rv a r i a b l er e g i o n c o n s e r v e dr e g i o n s r n a s e sl o c u sr i b o n u c l e a s e s c 1 、a b e d t a s d w e b b p t e d n t p p p v p 聚合酶链式反应 高变区 保守区 s r n a 酶 c e t y l 打i m e t l l y l a m m o n i 啪b r o m i d e 溴化十六烷基三甲基铵 e m y l e n ed i a l l l i n et e t m a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e r e t h i d i u r nb r o m i d e b a s ed a i r t r i se d t ab u f r e r 无菌双蒸馏水 溴化乙碇 碱基对 t e 缓冲液 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h l s p h o s p h a t e s 脱氧核苷三磷酸 p r i m e r p o i y v i n y lp y r r o l i d o n e 引物 聚乙烯基毗咯烷酮 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 堡垒些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 形匆私 签字日期：- 万年多月) 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解一塑i 堡壅些盎堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅a 本人授权塑j 垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：张考伽 签字同期：知节年月7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翮虢名气曲习 签字日期：廊年多月7 日 电话 邮编 些尘芏墨堑曼翌皇奎至童塑茎旦塑坌壹量鳖塞 1 引言 为了避免近亲繁殖，植物在长期的进化过程中形成了一种自交不亲和机制来防止 自身退化。自交不亲和( s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ，简称s i ) 指能产生具有正常功能且同期 成熟的雌雄配子的雌雄同株植物在白花授粉或相同基因型异花授粉时不能受精的现 象。由于s i 是植物的重要生命过程，对s i 进行深入研究将在生物生殖学和杂种优 势利用等方面具有重要的理论意义和应用价值。由于目前刚查清s l 的遗传机制，因 此对s i 的研究是植物生殖生物学和分子生物学等研究领域的热点课题之一1 2 】。目前 对孢子体自交不亲和性的雌蕊和花粉的s 基因以及蛋白质产物进行了广泛研究。配子 体自交不亲和植物的雌蕊和花粉基因及其蛋白质也已被克隆、鉴定。 1 1 植物自交不亲和性的普遍性及类型 1 1 1 自交不亲和现象的普遍性 目前已证实，自交不亲和性广泛存在于显花植物中。据报道，自然界中已经在 7 4 科2 5 0 属约3 0 0 0 种以上的显花植物中发现了自交不亲和现象1 4 ，5 j ，e a s te m 估计， 约有一半的被子植物中存在自交不亲和性【6 ，这说明白交不亲和性在植物界尤其是被 子植物中普遍存在，特别是十字花科( c r u c i f c r a e ) 、禾本科( g r a m i n e a e ) 、豆科 ( l e g u r n i n o s a e ) 、蔷薇科( r o s a c e a e ) 、茄科( s o l a i l a c e a e ) 、菊科( c p o s i t a e ) 植物中 普遍存在自交不亲和现象。 1 1 2 自交不亲和性的类型及其进化关系 植物的自交不亲和( s i ) 在自然界中存在两种类型：孢子体型自交不亲和性 ( s p o r o p h ”i cs e l f - c o m p a t i b i l i 吼简称s s i ) 和配子体型自交不亲和性( g a m e t o p h ”i c s e i f _ i n c o m p a t i b i l i t y ，简称g s i ) 7 。1 2 1 。 s s i 指s 等位基因在花粉母细胞尚未完成减数分裂之前进行表达，因而花粉中同 时存在两个等位基因的蛋白产物，授粉时该两个等位基因产物以共显性、共隐性、竞 争性互作等方式与雌蕊两个s 等位基因产物产生相互识别反应，即在自交不亲和反应 中花粉的行为由产生花粉的亲本孢子体的两个等位基因所决定，叫孢子体自交不亲 和。孢予体自交不亲和的花粉行为则受授粉植株二倍体基因( 即孢子体基因) 的支配， 由于雌蕊s 基因的表现型与基因型未必一致，因而表现出较为复杂的遗传方式，当花 粉的s 基因与雌蕊的s 基因的表现型相同时，就表现自交不亲和，如十字花科、菊科 植物均属于此类。 而g s i 是指s 等位基因在花粉母细胞完成减数分裂之后才进行表达，单倍体花 粉只含有母体一个s 等位基因的蛋白产物，授粉时该等位基因产物与雌蕊两个s 等位 基因产物产生识别反应，s i 反应由配子体s 基因型所决定，叫配予体自交不亲和性。 配子体自交不亲和的花粉行为受花粉本身的单基因( 即配子体基因) 所支配，当花粉的 河北农业大学硕士学位论文 s 基因与雌蕊的两个等位基因之一相同时，花粉就被排斥，从而表现自交不亲和，例 如茄科、蔷薇科植物。据研究表明，果树的自交不亲和性属于配子体型自交不亲和1 1 “。 从进化的角度看，g s i 比s s i 更原始，s s i 是由g s i 进化而来的。同一类型的 s i 的遗传控制途径在不同植物间也表现出很大的差异。如罂粟科、十字花科芸苔属、 蔷薇科、茄科和玄参科植物均属于g s i ，但在分子生物学研究中发现，前三种植物的 s 基因没有同源性，说明g s i 是由多起源通过异源同功进化而来的；而后三种植物( 不 够数) 的自交不亲和遗传机制较相似，说明这三种植物配子体s i 具有相同的起源 f i 4 l 引一 1 2 自交不亲和植物花柱s r n a s e 的特点 1 9 2 1 年p e r l l 肯定了自交不亲和性是由遗传因素决定的1 1 ”，随着遗传学、免疫学 和分子生物学的发展，表明多数植物s i 是由单个基因位点上的复等位基因( 该位点 叫s 一位点( s 1 0 c u s ) ，该位点的基因叫s 基因) 控制旧。在二十世纪5 0 年代初期， l e w i s 用免疫学方法从配子体自交不亲和的月见草( 仇n o 确p md 理鲫p 瑚括) 中找到了 与s 基因位点相关的蛋白质【l 引。2 0 世纪8 0 年代对配子体自交不亲和蛋白的分离、鉴 定、测序、分布部位及本质进行了研究，分别在n “删j 口v 拙、五弦印g 坩f c d ”、矽盯“v 册“m 、 s f “6 口，口s h 研、s c 卯d 册s p 柱头成份中提纯和鉴定了与自交不亲和性连锁的蛋白质。 a n d e r s o n 、c o m i s h 等【删发现s 糖蛋白存在于雌蕊输导组织的胞外空间。s 糖蛋白的分子量为2 4 3 2 k d a ，等电点在6 2 9 5 之间，不同s 基因编码的s 蛋白都 普遍存在一个长约2 0 个氨基酸的引导肽，但其一级结构的同源性差异从3 8 9 3 不等。a n d e r s o n 等i z l j 分离并克隆其c d n a 研究也表明，s 糖蛋白是雌蕊一花粉识别 所必须的，能够降解来自花粉管的r n a ( r r n a 和m r n a 等) ，导致不亲和反应的产 生【2 。s 糖蛋白具有核糖核酸酶活性，因而也被称之为s r n a s e 【2 3 1 。s 蛋白的本质是 核酸酶，也有研究表明，s r n a s e 的活动抑制花粉管在花柱中的生长，有活性的 s r n a s e 对自交不亲和反应是至关重要的m ”】。 s - r n a s e 在结构上由保守区和高变区两部分组成。茄科植物s 。r n a s e 的保守区可 划分为c 1 至c 55 个区域其中c l 、 c 4 、c 5 是疏水区，与s r n a s e 的结构有关； c 2 、c 3 由两个组氨酸残基组成的亲水区，是s 一核酸酶的活性部位。h o r i u c h ih f 2 6 1 等研究发现亲水区与真菌的一类核酸酶r h 和t 2 具有很高的同源性。高变区可划分 为h v a ( h y p e r v a r i a b l er e g i o n ，简称h v ) 和h v b 两个区域，他们介于c 2 和c 3 之间，是 s 一糖蛋白中含亲水集团最多的部分m 2 8 1 。蔷蔽科植物s r n a s e 中也存在与茄科植物 保守区c 1 、c 2 、c 3 、c 5 相当的区域，但未发现与茄科植物保守区c 4 相当的区域， 说明c 4 有可能是区别不同植物科间的特异区域。( 梨、苹果、杏、樱桃等蔷薇科植 果树) 序列比较研究发现，在该科植物基因组中具有一处氨基酸序列变化较丰富的区 段，它相当于茄科植物h v a 区域，但同一s 基因表达的s 糖蛋白因品种不同而存在 着显著差异。张绍铃等在研究梨品种花柱发现，同s 基因所表达的糖蛋白量因品种 而异的现象，主要是由于梨品种花柱内还存在着调控s 一基因表达的修饰基因所致。 些尘芏墨堑曼翌旦茎至量翌墨里塑坌皂皇鳖塞 研究表明s r n a s e 的活性表现可以用来推断自交不亲和性 3 ”“，张绍铃【2 圳等认为 梨花柱内每1ug 可溶性蛋白质中含总s 一糖蛋白的量在1 3 n g 以上时为自交不亲和强 的品种，0 7 o 9 n g 为自交不亲和强度弱的品种，在o 7 n g 以下时可定为自交亲和的 品种，并指出花柱内总s 糖蛋白的含量与品种自交不亲和强度显著相关 ( 严o 9 0 6 n = 2 0 ) ，为今后选育和鉴定品种的自交不亲和强度提供了参考。 s r n a s e 序列同源性比较表明，茄科植物及蔷薇科植物的许多果树如苹果、梨、 扁桃、樱桃的s 基因n 一的末端氨基酸序列具有很高的同源性【3 “j 。但扁桃的保守区 ( c 1 ) 与苹果和梨的( c 1 ) 区有所不同。而苹果和梨的c 1 区却与茄科植物s r n a s e 的c 1 区保守氨基酸残基是相同的。蔷薇科植物中可能仅仅是苹果属和梨属的c 1 区 相同，并不是所有蔷薇科植物的c 1 区都相同，说明s 基因在不同植物属问有差异。 1 3 花粉s 基因的分离与鉴定 上世纪九十年代初，人们发现在配子决定型中，母体的决定因子是s - r n a s e ，但 其作用机理和花粉决定因子并不清楚。直到本世纪初，中国科学院遗传与发育生物学 研究所薛勇彪研究员领导的创新小组在植物有性生殖自交不亲和的分子机理研究方 面耿得突破性进展，确定了自交不亲和的花粉因子在配子决定型中，是否亲和决定于 母体与花粉的基因型，而与父本基因型无关。在长期的研究探索中，该小组在国际上 首先从金鱼草中克隆到了个与花粉决定因子相关的基因a h s l f s 2 1 3 9 】，证明该基因 具有花粉决定因子的遗传学特征【4 “。并且把a h s l f s 2 转到自交不亲和的矮牵牛中， 可以把自交不亲和的矮牵牛转变成亲和的，这就证明a h s l f s z 确实是自交不亲和的 花粉决定因子i 4 “。 为研究a h s l f s 2 和雌性因子s r n a s e 之间相互作用导致自交不亲和的发生，乔 红等利用免疫共沉淀和酵母双杂交等技术，首次证明a h s l f s 2 能和s r n a s e 及与s c f 蛋白降解复合体中的a s k l 、c u l l i n 相互作用，并通过特异抑制剂和生化试验，证 明s r n a s e 在亲和组合中被泛素化【4 2 】。该研究首次证明了a h s l f s 2 在自交不亲和中 的关键作用，并证明s r n a s e 的降解是通过a h s l f 。s 2 介导的泛素2 6 s 蛋自降解复体 途径来完成的。但是，这两类蛋白质如何相互作用产生特异性花粉识别的机理还不清 楚。 1 4 苹果自交不亲和性的研究进展 苹果自交不亲和属于配子体自交不亲和1 4 3 j ，目前，对配子体型自交不亲和研究较 多的是茄科、蔷薇科和罂粟科【代4 卯。配子体自交不亲和性植物为二核花粉，其不亲和 反应的抑制部位在花柱，因此，花粉的细胞学特征、不亲和性的遗传学特征和抑制部 位之间存在密切的关系【4 。不亲和的花粉落到柱头上后，通常不能吸水萌发【4 7 ，48 1 。不 亲和花粉管生长被抑制主要与花粉管顶部含有大量胼坻质沉积有关，白花授粉后 1 0 m i n 内就能观察到这种沉积现象【4 9 5 ，而亲和花粉没有这种胼坻质的形成，这是自 河北农业大学硕士学位论文 花授粉的细胞显表现。 i s h i m i 孤等f 5 1 1 和n o r i o k a 等旧报导，蔷薇科s r n a s e 的c l 区在结构上不葡于茄 科的s - r n a s e 的c l 区，因此推测蔷薇科的n 端是独特的，然而在扁桃上的s - r n a s e 得出的结果却不支持这种解释。在扁桃侧中，经i e f 和2d p a g e 与免疫印迹相结台， 成功地鉴定出4 个与自交不亲和相关的s - 蛋白，s ，s b ，s 。，sd _ 这4 个蛋白分子 量大约都为3 0 k d a ，分子量大小的顺序为s b ，s c ，sd i s a ，其等电点都在高碱性 区，由低到高的顺序为s 。，s a - ，s b ，s d - o 其中编码s b - ，s 。和s d 的c d n a s 已被克 隆出，序列也已经被测出 ，其n 端氨基酸序列与苹果、梨、玄参科和茄科相比较， 也有很高的同源性，在茄科植物中，鉴定出的保守区域c l 区在这几个物种中同源性 分别达6 0 、5 0 和5 0 7 0 。奇怪的是，扁桃的s r n 鼬e 中的一些保守氨基酸残 基与苹果、梨的s - r n a s e s 的不同，但却与玄参科和茄科的s 。r n a s e 、保守氨基酸残 基是相同的。可能仅仅是苹果属和梨属的c l 区是相同的。并不是所有蔷薇科植物的 c l 区都相同。就形态学和基因特性而言，苹果属和梨属的相关性比与杏属的更紧密 1 5 ”，按次序杏属比苹果属和梨属在n 端氨基酸序列上与玄参科和茄科更相似。 s a s s a 等【5 6 j 在苹果上鉴定出s 。，sb ，s 。，sd - ，s 。- ，s f _ 蛋白，其分子量分别是 3 0 ，2 9 3 0 ，2 8 ，3 0 和2 7 k d a ，与曰本梨的s 一糖蛋白的分子量和等电点相似。苹果 中的蛋白不仅能与c o r a 反应，也能与日本梨的s 4 。糖蛋白的抗血清产生杂交反应， 都包含t 2 s 型r n a s e 的活力位置的特性。这不仅表明苹果中的s 蛋白也是糖蛋白， 也表明与日本梨中的s - 蛋白有相似的特性，即：s 蛋白是苹果花柱中s 等位基因的 产物。现已测得苹果雌蕊中的s i m a e s 只是在花粉管生长的通道中表达，第一次报道 了蔷薇科植物中s r n a s e 的准确分布，并且在非s 一等位基因专一产物中发现了细 胞间标记，说明可能有不被s ，位点编码的但作用与s 蛋白相似的些成份存在。在 苹果上克隆出了编码苹果花柱s 2 和s 3 r n a s e 的2 个c d n a s ，对其序列进行进一步的 分析后发现，与2 个s 等位基因对应的基因组d n a 序列分别具有1 3 8 b p 和11 0 0 b p 的内含子，对两个序列比较，表明c d n a s 所编码的成熟的蛋白6 5 的残基是相同的 p ”j 。它们推断的s - r n a s e 氨基酸序列与已报道的茄科家族相似。这个发现肯定了蔷 薇科和茄科可能在自交不亲和系统中有棚似的机理。 1 9 3 9 年k o b e l 等就对i o 个苹果品种的花粉管生长进行了研究，证实了苹果的自交 不亲和是由多