（细胞生物学专业论文）酿酒酵母端粒酶全酶亚基est3p的功能分析.pdf

中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已绎注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得卜h ，实验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 杨翠萍 日期：2 0 0 6 年0 8 月0 7 日 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；，+ 科院可以公布论文的全部或部分内容，可以将奉学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名 y1 0 1 4 0 4 4 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 中文摘要 中文摘要 在酿酒酵母s n c c h a z o n t v c e sc 8 2 e v i s i a e 中至少有5 个基因是酵母体内端 粒酶活性所! 必须的，它们是毋仃，e s ? 2 , 叵，邢， i c i 和c d c l 3 。端粒酶的催化贬 基e s t 2 p 和r n a 业基r l ic l 组成了端粒酶的核心酶。e s t l p 和e s t 3 p 则是端粒酶 全酶的另外两个基。为了解析端粒酶业基e s t 3 p 在端粒复制中的功能，我们过 表达并纯化了苹组的野生型及突变的e s t 3 蛋白。其中，野生型e s t 3 蛋白和点突 变蛋白e s t 3 一k 7 1 a 和一t 1 1 5 a 能在体外形成二聚体，而点突变蛋白e s t 3d 4 9 a k 6 8 a 和一d 1 6 6 a 形成二聚体的能力下降。引起二聚体的能力下降的点突变在体内 表现出端粒缩短的表型。在形成二聚体的能力完全崔失的双点突变 e s t 3 p d d 9 a k 6 8 a 中，端粒的长度进一步的缩短了。在o s t 3 细胞内用c o n t r o m e i ，e 质粒异位共表达野生型e s t 3 蛋白和点突变e s t 3 一k 7 1 a 或一t 1 15 a 蛋白会导致端粒 的缩短，而异位共表达野生型e s t 3 蛋白利点突变e s t 3 一d 4 9 a ，k 6 8 a ，或d 1 6 6 a 蛋白则对端粒长度的调节没有什么影响。这些数据表明二聚化对于体内e s t 3 p 的功能是重要的，但二聚化对e s t 3 p 的功能并不是必需的。进一步的遗传学研究 发现在e s t 3 - 。k 6 8 a ，k 7 1 a ，f 1 0 3 a ，r 1 1 0 h 和t 1 1 5 a 的点突变的细胞中过量表 达e s t l p 不会像在野生型细胞中过量表达e s t l p 那样引起端粒d n a 的增长。而在 这些邯。z 7 点突变的细胞中过量表达e s t 2 p 或t l c l 不会像存野生型细胞中过量表 达e s t 2 p 或t c l 那样引起端粒i ) n a 的缩短，这表明e s t 3 p 的l y s 6 8 ，l y s 7 1 p h e l 0 3 ，a i l g l1 0 和t l u 1 1 5 残基对它与e sl l p 的柏坷作用是熏要的，而与e s t 2 p 或t l c l 的相听作用没有什么相关性。对e s t 3r 11 0 的点突变的进步f l g i j f 究显 示，6 s t 3 p 的a r g l l 0 突变为l y s 或h i s 会导致缩短的端粒，而a r g l l 0 突变为f l a l e u ，( ； u ，a s l ) 或t yr 会导致端粒缩短及细胞衰老死己表明e s t 3 p 的a r g l l 0 中囡科学院 海生命利学研究院生物化了与目 州目生物学研究所博十毕业论丈 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析中文摘要 在端粒酶功能发挥上起着关键的作用。总结一下，e s t 3 p 和e s t l p 之问存在着功 能性的相互作州对于体内端粒酶的活性是必须的，体内端粒酶需要这种相互作用 来延伸端粒d n a 。 关键词： 端粒、端粒酶、e s t 3 p 蛋白、二聚化、e s t 3 p 与e s t l p 相：互作用 中国利学院上海牛命利学研究院生物化学与细胞l 物学卅f 究所博十毕业呛文 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析英文摘要 英文摘要( a b s t r a c t ) t h ef u n c t i o n a ia n a i y s iso ft h et e l o m e r a s eh o i o e n z y m e s u b u nite s t 3 pins a c c h a r o m y c sc e r e v i s i a e c u i p i n gy a n g ( c e iib i o i o g y ) d ir e o t e db yp r o f e s s o rj in - o iuz h o u i ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，a tl e a s tf i v eg e n e s ，e s t l ，e s t 2 , e s t 3 , t l c la n d c d c l 3a r e , r e q u i r e df o rt e l o m e r a s ea c t i v i t y nv i v o t h et e l o m e r a s ec a t a l y t i cs u b u n i t e s t 2 pa n dt e l o m e r a s er n a s u b u n i tt l c lc o n s t i t u t et h et e l o m e r a s ec o r ee n z y m e ；t h e e s t l pa n de s t 3 pa r et h eo t h e rs u b u n i t so ft e l o m e r a s eh o l o e n z y m e i no r d e rt od i s s e c t e s t 3 p sf u n c t i o ni nt e l o m e r er e p l i c a t i o n ，w eo v e r - e x p r e s s e da n dp u r i f i e dr e c o m b i n a n t w i l d - t y p ea n dm u t a n te s t 3p r o t e i n s t h ew i l d - t y p e ，a sw e l la sk 7 1 aa n dt l l 5 a m u t a n t sw a sa b l et of o r mad i m e ri nv i t r o ，w h i l et h ee s t 3 p - d 4 9 a ，一k 6 8 ao r d 16 6 a m u t a n ts h o w e dr e d u c e da b i l i t yo fd i m e r i z a t i o n t h ed e f i c i e n c yo fd i m e r i z a t i o no f m u t a n te s t 3 pa p p e a r e dt oc a u s et e l o m e r es h o r t e n i n gi nv i v o f u r t h e rt e l o m e r e s h o r t e n i n gw a s o b s e r v e dw i t ht h ed o u b l em u t a n to fe s t 3 p - d 4 9 a k 6 8 aw h i c h t o t a l l y a b o l i s h e dt h ed i m e r i z a t i o na b i l i t y e c t o p i cc o e x p r e s s i o no fk 7 1 ao rt i l 5 am u t a n t a n dw i l d t y p ee s t 3 pf r o mc e n t r o m e r ep l a s m i d sc a u s e dt e l o m e r es h o r t e n i n g ，w h i l e c o - e x p r e s s i o no fd 4 9 a ，k 6 8 a o rd 1 6 6 am u t a n ta n d w i l d - t y p ee s t 3 ph a dn oe f f e c to n t e l o m e r el e n g t h t h e s ed a t as u g g e s t e dt h a td i m e r i z a t i o no fe s t 3 pi sr e q u i r e df o ri t s f u n c t i o ni nv i v o t h eg e n e t i ca n a l y s i ss h o wt h a tt h et e l o m e r el e n g t h e n i n gc a u s e db y e s t lpo v e r e x p r e s s i o nw a sc o m p r i s e di ne s t 3 一i ，y s 6 8 a l a ，一l y s 7 1 a l a ，- p h e l 0 3 a ， 中国科学院l 一海生命科学研究院生物化7 孚与细胞生物学州究所 l 礴 一斡j l 论史 4 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 英文摘要 - a r g l1 0 h i s ，a n d t h r l1 5 a l am u t a n t s ，b u tt h et e l o m e r es h o r t e n i n gc a u s e db ye s t 2 po r t l c lo v e r e x p r e s s i o nw a sn o ta f f e c t e di nt h e s ee s t 3m u t a n t sa si ne s t 3w i l d t y p ec e l l s s u g g e s t i n gt h a tt h el y s 6 8 ，l y s 7 1 ，p h e l 0 3 ，a r g l l 0a n dt h r l l 5r e s i d u e si ne s t 3 pa r e i m p o r t a n tf o ri t sg e n e t i co rf u n c t i o n a li n t e r a c t i o nw i t he s t l p ，a n dd i s p e n s a b l ef o ri t s i n t e r a c t i o nw i t he s t 2 po rt i c t t h ef u r t h e rc h a r a c t e r i z a t i o no fe s t 3 - r 11 0m u t a n t s s h o w e dt h a tm u t a t i o no fa r 9 11 0i ne s t 3 pt ol y so rh i sr e s u l t e di ns h o r t e rt e l o m e r e s ， w h i l et h ea x g l l 0t oa l a ，l e u ，g l u ，a s po rt y rm u t a t i o nc a u s e db o t ht e l o m e r e s h o r t e n i n ga n dc e l l u l a rs e n e s c e n c e ，i n d i c a t i n gt h a ta r g l l 0o fe s t 3 pi sc r i t i c a lf o ri t s f u n c t i o ni nt e l o m e r a s eh o l o e n z y m e t a k e n t o g e t h e r ，t h e s ed a t ai n d i c a t et h a t nv i v o t e l o m e r a s er e q u i r e st h eg e n e t i co rf u n c t i o n a li n t e r a c t i o no fe s t 3 pw i t he s t l pt o e l o n g a t et e l o m e r i cd n a k e yw o r d s ： t e i o m e r e ，t e l o m e r a s e ，e s t 3 p ，d i m e r i z a t i o n ，e s t 3 pa n de s t l pi n t e r a c t i o n 中闽利学院上海生命利学研究院生物化学_ 细胞牛物学研究所博i 毕业沦文 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 英文缩写 b s a d t t e d t a e s t l e s t 2 e s t 3 英文缩写 b o v i n es e r u ma l b u m i n d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e v e rs h o r tt e l o m e r e sg e n e1 e v e rs h o r tt e l o m e r e sg e n e2 e v e rs h o r tt e l o m e r e sg e n e3 e s t 4 ( c d c l 3 ) e v e rs h o r tt e l o m e r e sg e n e4 g s t i p r g k b k d a p a g e p m s f s d s t l c l g l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s e i s o p r o p y i - p d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s l d e k i i o b a s e k i l o d a l t o n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h e n y l m e t h y l s u i f o n y lf l u o r i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t e l o m e r a s er n as u b u n i ti ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e l 。p 固利。院。 ：海生命 ：i 学 f 究院生物化。与细胞生物1 学4 卅究所博 ：牛、i k 沦文 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析背景 正文 一引言 1 1 端粒与端粒酶的发现 端粒是染色体末端的特殊结构，由串联重复的端粒d n a 及端粒相关蛋白组成 f g r e i d e r 1 9 9 6 ；z a k i a n ，1 9 9 6 ) 。这个概念首先在2 0 世纪3 0 年代末在染色体片段逆 转研究中由m u l l e r 提出。几_ 了i _ 是同一时问，m c c l i n t o c k 发现在玉米的“断裂 融合桥”的循环中，新形成的染色体末端南1 i 性较大，容易与其他新形成的染色 体术端融合，而正常的染色体末端则牛h 对稳定( m u l l e r , 1 9 5 4 ；m c c l i n t o c k ，1 9 3 9 m c c l i n t o c k ，1 9 4 2 ；m u l l e r ，1 9 3 8 ) 。人们从而推测，染色体的自然末端应该不同于 断裂术端，它有一个特殊的结构来避免染色体阳：j 的相互融合。在逐渐明晰了染色 体特殊未端即端粒的概念后，b l a c k b u r n 于1 9 7 8 年第一次报道，四膜虫 ( t e t r a h y m e n a ) 的染色体外线性r d n a 的端粒是由重复的c c c c a a 序列组成的 ( b l a c k b u r na n dg a l l ，1 9 7 8 ) 。1 9 8 4 年，b l a c k b u r n 实验室通过将酵母端粒克降到线 性人工染色体的方法，发现酵母的端粒序列是由不太规则的t g c 。，a 组成的 ( s h a m p a ye ta 1 ，1 9 8 4 ；s z o s t a ka n db l a c k b u r n ，1 9 8 2 ) 。他们同时还发现带着四膜虫 端粒的人工线性染色体导入到酵母后，术端被加上了酵母的端粒的d n a 重复序 y d ( s h a m p a ye ta 1 ，1 9 8 4 ) 。这一发现列以前人们普遍倾向的同源重组维持端粒的机 制提山了挑战，暗示了个更为合理的假说：端粒的复制是由专门的酶来承担的。 在四膜虫发育过程的某个阶段，大核的染色体断裂成了几两个小染色体，i 币 每一个染色体都被加上了端粒d n a 序列，由此i ，j _ 以推测，此时细胞内的“嗨”活 性应该是非常高的。1 9 8 5 年，r a c k h ur l 实验室的( ；r e jd e r 从大核的裂觯液中 囡利学院上海生命科学i ! | = 究院，f 物化学与纲胞! l 物学研究所 博十牛, t k 沦文 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 发现了能延伸体外合成的四膜虫端粒d n a 的酶活性。当时以为这种酶活性与t r n a 的核苷末端转移酶相似( 不依赖于模板，加c c a 到t r n a 术端) ，因而命名为端粒 末端转移酶活性( g r e i d e ra n db l a c k b u r n ，1 9 8 5 ) 。但很快他们发现这种酶活性是依 赖于r n a 的：当样品用r n a s e 处理后，酶活性消失t ( g r e i d e ra n d b l a c k b u r n ，1 9 8 7 ) 。 1 9 8 9 年，他们从四膜虫的近亲e u p l o t e s 中克隆了端粒酶的r n a 模板亚基：它的 段r n a 序列i f 好和q 膜虫的端粒序列互补( g r e i d e ra n db l a c k b u r n ，1 9 8 9 ； s h a m p a y e ta 1 1 9 8 4 ) 。1 9 9 4 年，g o t t s c h l i n g 实验室克隆了酵母端粒酶的r n a 亚 基( s i n g e ra n dg o t t s c h l i n g 1 9 9 4 ) 。1 9 9 f i 年，b l a c k b u r n 实验室报道了酵母端粒酶 的活。胜( c o h na n db l a c k b u r n ，1 9 9 5 ) 。 后来，l i n g n e r 等用生化的方法纯化了四膜虫端粒酶复合物，其中的p 1 2 3 蛋白后来被证明是端粒酶的催化亚基( l i n g n e ra n dc e c h ，1 9 9 6 ) 。同时期， l u n d b l a d 实验室用遗传学的方法筛选到了几个与酵母端粒复制密切相关的基 冈，其中的e s t 2 后来被汪明编码酵母端粒酶的催化业基( l e n d v a ye la 1 ，1 9 9 6 ； l i n g n e r e ta 1 、1 9 9 7 b ) 。w a s t o n 于1 9 7 2 年提出染色体“术端复制问题”( w a t s o n ，1 9 7 2 ) 可以用端粒酶延伸端粒d n a 来解释。 1 2 端粒的主要的功能 端粒在细胞内丰要行使以下三个功能：第一，端粒的蛋白一d n a 高级结构可 以维持染色体末端的稳定并防止染色体之间的术端融合( d el a n g e ，2 0 0 2 ；v a n s t e e n s e le ta l 。1 9 9 8 ) ：笫二，端粒d n a 刈以利用细胞内一种特殊的反转录酶顺利 的进行复制，从而维持端粒d n a 的长度稳定，从而避免由于端粒的小断缩短导致 不能稳定的将遗传信息传递给后代。第三，端粒有端粒何置效应，至少存 些物 中圈科一了q 皖上海生命科学州究院生物化学与细炮q j 物学研究所博 毕业论文 l 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 种中( 如酿酒酵母) ，端粒异染色质的形成可以抑制端粒附近基因黼( b a s sc t a 1 ，1 9 9 7 ；x ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 端粒d n a 的复制或维持除了依靠端粒酶途径外，还可以通过同源蕈绢途径。 在酿酒酵母中，每一条染色体末端的都含有一段约3 0 0 7 5b p s 的q ：, a t g 。，莺 复端粒d n a 序列。端粒d n a 除r r ( ；卜3 重复的d n a 序列以外，还有x 和y 亚端 粒d n a 序p t j ( z a k i a n ，1 9 9 6 ) ，在缺少端粒酶组分时，酵母细胞通常会早衰并最终死 亡，然而有一部分酵母细胞在持续培养一段时间以后，可以利用r a d 5 2 依赖的 同源重组的机制，复制扩增y 或t g 。重复的端粒d n a 序列来维持端粒和染色体 的稳定得以幸存下来( o r e i d c r , 1 9 9 6 ；g r e i d c ra n db l a c k b u r n ，1 9 8 5 ；k a s s e i s l e ra n d o r e i d e r , 2 0 0 0 ) 。这种存活下来的细胞分别被命名为i 型和i i 型的存活细胞，即 t y p ei 和t y p eits u r v i v o r ( l u n d b t a da n db l a c k b u r n ，1 9 9 3 ) 。在果蝇中，细胞利 用长转座子( j l e _ l 一a 和t a r t ) 的转座效应使得这些d n a 片段被转移到染色体的术 端从而达到稳定染色体端粒的目的( p a r d u ea n dd e b a r y s h e 2 0 0 3 ) 。 细胞端粒的维持需要端粒酶的活性及其功能的i r 常行使，这就要求端粒本身 的蛋i 刍d n a 高级结构必需存在有“丌放”和“关闭”的两种状态，使得端粒能 发挥灵活的调节功能( m i c h e le ta 1 ，2 0 0 5 ) 。人们可能希望那些维持端粒高级结构 的蛋白功能缺失，从而使端粒始终处于一种“开放”的状态，这样有助于端粒酶 更加顺畅地延伸端粒d n a 形成更长的端粒，从而维持染色体的稳定，降低实体瘤 或肿瘤的发生书。f 黾事实并非如此，并不是端粒越长越好，随着进化的流程，细 胞自身形成了端粒的高级紧密结构，其本身有着重要的生物学意义，随意地破坏 这种平衡并不是明智的选择，只会使细胞陷入混乱的状态造成臣人的损伤。因此 更多的研究者认为，端粒酶的招募和端粒d n a 的保护功能是很难被简单地分割丌 中团利学院上海生命利学研究院生物化0 “j 细胞生物学研究所陴十毕、i k 论义 1 2 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s l 3 p 的功能分析背景 来看待，这两个现象或功能是紧密相连的。 1 3 端粒酶复合物 端粒酶复合体在酵母5 冶c c h a z l o f l t v c e sc e r e v i s i a o 端粒的维持中起着重要的 作片j 。端粒酶复合体活性的丧失会导致端粒的隐缩及细胞最终的死产。利州遗传 学的方法，已经鉴定出的4 个e s t ( e v e rs h o r tt e l o m e r e s ) 基因及r n a 模板牲 因t l c l 是酵母中端粒酶活性所必需( m o r r i sa n dl u n d b l a d ，1 9 9 7 ) 。4 个e s i 。基凶分 别是点s y y ，e q t 2 , 晟f 7 3e s t 4 ，e s t 4 ( 也被称为c d c l 3 ) ( l e n d v a ye ta l ，1 9 9 6 ) 。 o j 7 7 基因编码酵母端粒酶复合体的催化蛋白亚基，浚亚基具有逆转录酶的 一些特。陛( l e n d v a ye ta 1 ，1 9 9 6 ) 。1 9 9 7 年，c e c h 实验室和w e in b e r g 实验室先后报 道e s t 2 p 含柯逆转录酶的结构域，如果对这些结构域的保守氨基酸残基进行突 变，端粒酶的活性也随之消失。从而，e s t 2 p 被认为是酵母端粒酶的催化亚基 ( c o u n t e re ta 1 ，1 9 9 7 ；l i n g n e re ta 1 ，1 9 9 7 b ；n a k a m u r a e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。毋刀基因敲除会 导致端粒的缩短，及酵母细胞最终的衰捌2 ( l i n g n e ra n dc e c h ，1 9 9 8 ) 。端粒酶 的逆转录酶结构域分布在蛋白的c 端，但通过不同种属的端粒酶的序列比对，人 们在n 端发现了另外一些端粒酶特异的保守序列，称为g q ，c p ，q f p 和t 。 ( n a k a m u r ae ta 1 ，1 9 9 7 ；x i ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这些保守序列的改变同样也会影响端粒 酶的体内功能。e s t 2 p 的n 端还可能和e s t 3 p 结合：e s t 2 p n 端的某些突变体的温 度敏感表型能被e s t 3 p 过表达而减轻( f r i e d m a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。此外，e s t 2 pl 司其它 端粒酶催化皿基一样，本身还可能含有核酸酶活性，因为它会降解底物d n a ，这 种活性可能提供了端粒酶在复制巾的校验功能( n i ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 儿a 这个端粒酶的r n a 绀成成分! i | j 为端粒术端重复序列的合成提供了模板 中国科学院 i 海生命科学研究院， = 物化学与细胞生物学研究所j 冉十毕业论文 1 3 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 i s i n g e ra n dg m t s c h l i n g ，1 9 9 4 ) 。t 1c 1 作为端粒酶的r n a 模板在生物界i + i 岜是高度 保守的，利州系统发育软件分析比较发现，t 1c i 的同源物t r 在脊椎动物中有 旧个结构域是保守的，而这种拓扑结构的惊人相似，暗示了端粒酶r n a 在整个牛 物体系中进化卜的保守f 生( c h e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。基于不同种的酵母端粒酶r n a 亚基 的序列比较，c e c h 实验室和w e l n g e r 实验室削计算机软件模拟出了t 1 c 1 的一 级结构图( d a n d j i n o ue ta 1 ，2 0 0 4 ；z 8 p p u l l aa n dc e c h ，2 0 0 4 ) 。t l c l 能够跟 k u ( p e t e r s o n e t a 1 ，2 0 0 1 ；s t e l l w a g e n e t a 1 ，2 0 0 3 ) ，s m ( s e t o et a 1 ，1 9 9 9 ) ， e s t l p ( l i v e n g o o de ta 1 ，2 0 0 2 ；s t e i n e r te ta 1 ，2 0 0 4 ；z h o ue ta 1 ，2 0 0 0 ) ，e s t 2 p 蛋白结 合( c h a p p e l la n dl u n d b l a d ，2 0 0 4 ；l i ne ta 1 ，2 f 0 4 ；l i v e n g o o de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。有意思的 是，如果将t l c l 的e s t l p 结合区移位到t l c l 的其它区域，e s t l p 同样能够结合， 并j _ 土保证端粒酶的体内功能( z a p p u l l aa n dc e c h ，2 0 0 4 ) 。最近报道端粒酶的r n a 亚 摹有一个保守的二级结构，能够与催化j i e 基e s t 2 p 结合( c h a p p e 儿a n dl u n d b l a d ， 2 0 0 4 ；l i ne la 1 ，2 0 0 4 ) 。 e s t l p 和c d c l 3 p ( e s t 4 p ) 是尊链端粒d n a 籼l q ( e v a n sa n dl u n d b l a d 1 9 9 9 ； q ia n dz a k i a n ，2 0 0 0 ) 。c d c l 3 p 是端粒的单链t ( j ”d n a 结合蛋白，酵母双杂交实验证 明它与d n a 聚合酶q 的催化亚基p o l d 及端粒酶r n a 相关蛋白e s t l p 有相互作用。 c d c l 3 p 与e s t l p 相一：作用共同将端粒酶招募到端粒上( e v a n sa n dl u n d b l a d ，1 9 9 9 ； o ia n dz a k i a n ，2 0 0 0 ) 。e s t l p 在端粒酶复合体中的作用也有了进一步的阐明：酵 母双杂交和免疫共沉淀实验证叫e s t l p 也能与单链端粒结合蛋白c d c l 3 p 相互作 用( q ia n dz a k i a r t ，2 0 0 0 ) 。有趣的是，如果把c d c l 3 p 和e s t 2 p 融台，酵母将不再 需要e s t l p 。这些证掘表明e s t l p 的功能是通过与c d c l 3 p 相互作用而把端粒酶 招募到端粒上复制端粒序列( e v a n sa n dl u n d b l a d ，1 9 9 9 ) 。e s t lp 除了将端粒酶核 中田利学i 皖上海生命f ： 学研罗t 院生物化。一1j 细胞生物导叫肝究所 博l j 毕业沦艾 1 4 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 心酶招募到端粒d n a 上，还有可能起到激活端粒酶的作用f f 迅h e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 此外，e s t l p jc d c l 3 p 的协j 司作用对于修复染色体断裂，在断裂端从头合成端 粒也起着重要功能( a l e s s a n d r ob i a n c h i ，2 0 0 4 ) 。e s t l p 蛋白通过r n a 识别结构域 ( r r m ) 与t l c l 一个相当保守的茎环结构相互结合。位于r r m 区域的一个g s t p 突变体不能与t l c l 结合，从而也不能互补e s t l p 的功能( s e t oe ta t 2 0 0 2 ；z h o ue t a 1 ，2 0 0 0 ) ，这种相互作用是不依赖j 二全长的t l c l 的r n a ，但必须是完整的茎环 ( s e t oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在裂殖酵母和人中也都发现了e s t l 的同源物，与端粒也有着 密切的关系( b e e m i n ke ta 1 ，2 0 0 3 ；r u l e re ta l ，2 0 0 5 ) 。在裂殖酵母中，e s t l p 的同 源蛋白能够帮助端粒酶核心酶识别特定的底物，提高酶活。i 生( b e e r n i n k e ta 1 2 0 0 3 ) 。在人中，g s t l p 的同源蛋向可能参与调控端粒术端的结构( r u f e re ta 1 、 2 0 0 5 ) 。对人中e s t l p 同源物结构功能分析表明，e s t l p 还可以通过参与n m d ( n o n s e n s e m e d i a t e dm r n ad e c a y ) 通蹄来调节端粒及端粒酶复合体的其他纰分 的表达水平，以此来影响端粒的功能。而e s t l p 的过量表达会导致染色体复制异 常，出现染色质桥( r e i c h e n b a c he ta l ，2 0 0 3 ) 。 e s t 3 基冈能编码两种形式的蛋白：第一种形式只编码了第一个开放阅读框 而另一个蛋白姒u 通过移码从而翻译出了全& g s t 3 p 蛋白。只有全长的1 8 1 个氨基 酸，2 0 5 k d a 的e s t 3 p 蛋白才是体内功能所必需的( h u 曲e se ta 1 ，2 0 0 0 a ) 。敲除了 e s t 3 基因之后，呈现出的端粒酶缺陷的表型与e s t 2 和t l c l 无义突变体的表型是一 致酗j ( l e n d v a ye ta 1 ，1 9 9 6 ) 。用g s t 3 p 和e s t l p 免疫共沉淀的产物具有由e s t 2 p 和 t l c l 其同作用下的端粒酶的活。i t ( h u g h e se ta 1 ，2 0 0 0 b ；z h o ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。而e s t 3 p 与f 1c 1 的桐互作用是通过e s t 2 p 介导的。这些结果都表叫端粒酶除了e s t 2 p 和 t l c l 这两个核心酶组分之外，还包括了盼c ) 和e s t 3 p 这两个组分。g s t 3 p 与 p 阳 - 学院卜海生命科学f 究院生物化学_ i 。细胞牛物学研究所i 尊l 毕业 文 1 5 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 e sl 2 p 蛋白的n 一端存在遗传学上的相互作用，凼为过表达e s t 3 p 能补偿e s t 2 “n 端区域i 早某些特定位点的氨基酸突变导致的温度敏感的表型f f r i c d m a ne ta 1 2 0 0 3 ) 。但对于e s t 3 p 存端粒的复制功能中的机制到目前为止了解的还是很少。 1 4o d e l 3 p s t n l p t e n l p 染色体术端的端粒币链d n a 是需要蛋白质的保护的，否则容易受到核酸酶如 e x o l p 的攻击，e x o l p 可以结合到单链d n a 的末端将其水解，在富含胞嘧啶( c ) 链的降解中起着很重要的作用( b e r t u c ha n dl u n d b l a d ，2 0 0 4 ；m a r i n g e l ea n dl y d a l l ， 2 0 0 2 ) 。而富含鸟嘌呤( g ) 单链端粒d n a 由于有c d c l 3 p 的结合而不会被核酸酶 攻击。c d c l3 蛋白能与s t n l 和t e n l 形成了一个蛋白复合体，它既有调节端粒长 短又有保护端粒d n a 的功能。通过遗传学的研究，发现c d e t 3 一，s 加? 和 t o n l - 3 1 的突变酵母细胞和野生型的细胞相比，端粒的长短发生了变化，并且在 高温( 3 6 。c ) 培养条件下端粒单链d n a 加长( g a j ke ta 1 ，1 9 9 5 ；g r a n d i ne ta 1 ，2 0 0 0 ； g r a n d i ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。通过对c d c l 3 p 的生化特性研究发现，c d c l 3 p 可以高效地结 合富含g 的端粒单链d n a ( l i na n dz a k i a n ，1 9 9 6 ；n u g e n te ta 1 ，1 9 9 6 ) ，这一特性在 细胞内的蛋白一d n a 交联，染色质免疫共沉淀实验也得到了进一步的证实r f i s h e re t a 1 ，2 0 0 4 ) 。在酿酒酵母e a c c h a ，o m v c e sc e r e v i s i a e 中，c d c l 3 p 通常被视为具有 将端粒酶招募到端粒d n a 末端行使其反转录酶活性的功能f e v a n sa n dl u n d b l a d ， 1 9 9 9 ；q ia n dz a k i a n ，2 0 0 0 ) 。酵母双杂交实验证明，s t n l p 能与c d c l 3 p 相互结合 ( g r a n d i ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ，而s t n 一坩突变的酵母细胞则表现出异常加长的端粒 d n a ( g r a n d i ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。同样酵母取杂交实验也证明r1 、e n l p 与c d c l 3 p 和$ t n l p 的相互作用，形成一个蛋白复合体来行使功能，并保护端粒d n a 不被降解f g r a n d i n e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 中同利学院上海生命科? 1 驯究院! l 物化学与细胞生物学研究所 i 冉 ：毕业论艾 1 6 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 1 5 其它端粒相关因子 真核细胞中，还存在计多其它的端粒保护蛋白因子，k u 蛋白是其中一个非 常熏要的异源二聚体蛋白，两个亚皋的分子量分别是7 0 和8 0 k d a ，被称为k u 7 0 和k u 8 0 或k u 8 6 ( 在高等真核生物中) 。1 9 8 1 年，研究者在分析聚多肌炎一硬皮病 交叠综合症病人的血样时，发现超过一半的血样将k u 作为自身免疫抗原从而发 现了k u 复合物( m i m o r ie ta 1 ，1 9 8 1 ) 。酵母k u 7 0 8 0 ( y k u 7 0 8 0 ) 异源二聚体在端 粒的维持上也发挥了重要作用( b o u l t o na n dj a c k s o n ，1 9 9 6 ；d eg r e ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 y k u 直接结合在端粒d n a 卜保护端粒，防止同源重组( g r a v e l e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，及渊节 端粒c - 链的降解( m a “n g e l ea n dl y d a l l ，2 0 0 2 ) 。在y k u 缺失的情况。f ，即使在2 3 “c 时，出于单链端粒g 一链的增长，最终导致细胞周期阻滞，细胞停留在s 期( g r a v e l e ta i 。1 9 9 8 ) 。另外，有实验证明y k u 在近端粒区基因的沉默也起了相当重要色作 用，将y k u 敲除将丧失端粒的位置效应( b o u t t o na n dj a c k s o n ，1 9 9 8 ；l a r o c h ee ta 1 ， 1 9 9 8 ；n u g e n te ta 1 ，1 9 9 8 ) 。值得一提的是，y k u 还参与r 核结构的维持( h c d i g e r a n d g a s s e r ，2 0 0 2 ；l a r o c h ee ta 1 1 9 9 8 ) 。另外，y k u 还能与端粒酶的t l c l 组分结合， 在招募端粒酶的过程中起了很蕈要的作用( l a r o c h ee ta 1 ，1 9 9 8 ；p e t e r s o ne t a 1 ， 2 0 0 1 ；s t e l l w a g e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 6 端粒酶的多聚体状态 在s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中，端粒酶全酶的不同组分之阳j 能相互协作在体 内形成一个有活性的端粒酶复合物共同行使功能。p r e s c o t t 和b 1 a e k b u r n 发现 在s a c c h 口r o m y c e sc e r e v i s i a e 的端粒酶在体内能形成一个有活性的多聚体复合物， 且该复合物可能仝! p 含有两个活性位点( p r e s c o i la n db l a c k b u r n ，1 9 9 7 ) 。在体外实 巾闰科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 l 尊i 一毕业论文 1 7 酿酒酵母端粒酶全酶亚基e s t 3 p 的功能分析 背景 验中还发现，端粒酶活性仝少需要端粒酶r n a 和端粒酶催化亚基( b a he ta l ，2 0 0 4 l i n ge ta 1 ，2 0 0 5 ；w e i n r i c he la 1 ，1 9 9 7 ) 。向刘端粒酶核心酶的两个亚皋即催化亚基 和r n a 亚基分别的研究表明，曲者皆至少以_ 聚休的形式存在行使功能f t e s m e rc t a 1 ，1 9 9